Продемонстрированный протокол подчеркнул прямой и эффективный экспериментальный подход и подробные шаги к эффектам иммунного ответа новых вирусных адъювантов. Этот протокол предоставляет исследованиям не только в основном иммунный метод оценки адъювантной вакцины, но также может определять их массовую стабильность. Для начала возьмите 10 миллиграмм на миллилитр рабочего раствора белка-антигена MRSA HI и к нему последовательно добавьте три вспомогательных вещества: изопропилмиристат, полиоксиэтиленкасторовое масло и пропиленгликоль, поддерживая соотношение масс один к шести к трем.
Хорошо перемешайте смесь, затем постепенно добавляйте стерилизованную чистую воду, чтобы достичь объема системы в 10 миллилитров. Чтобы приготовить наноэмульсионную вакцину методом низкоэнергетического эмульгирования, перемешайте ее при 500 оборотах в минуту и 25 градусах Цельсия в течение примерно 20 минут. Впоследствии наноэмульсионную вакцину, содержащую один миллиграмм на миллилитр белка, получают в виде прозрачной прозрачной жидкости.
Для антигенного покрытия иммуноферментного анализа или планшета ИФА разбавьте антиген белка HI до 10 мкг на миллилитр с помощью раствора для покрытия и добавьте 100 микролитров разбавленного антигена на лунку в планшет ИФА. Инкубируйте тарелку при четырех градусах Цельсия в течение ночи. После инкубации вымойте тарелку 300 микролитрами ПБСТ на лунку.
Запечатайте лунки 300 микролитрами герметизирующего раствора на лунку в течение двух часов при 37 градусах Цельсия, затем разбавьте три микролитра сыворотки мышей из каждой экспериментальной группы 100 раз, добавив 297 микролитров PBST, и встряхните разбавленную сыворотку. Добавьте 100 микролитров разбавленной сыворотки на лунку в планшет ИФА с покрытием для каждого образца сыворотки. Аналогичным образом, разбавьте положительную и отрицательную контрольные сыворотки в 100 раз PBST, добавив четыре микролитра положительной или отрицательной контрольной сыворотки к 396 микролитрам PBST с последующим вихревым перемешиванием.
Чтобы выполнить разведение в двойном соотношении, добавьте 200 микролитров предварительно разбавленной экспериментальной сыворотки в первый ряд планшета ИФА с покрытием, затем добавьте 100 микролитров PBST во все лунки, кроме тех, которые находятся в первом и 12-м рядах. Затем отрегулируйте пипеточный пистолет на 100 микролитров и перенесите 100 микролитров сыворотки из первого ряда во второй ряд, содержащий PBST. Перемешайте содержимое во втором ряду 10 раз с помощью пипетки.
Аналогично выполняют от одного до двух последовательных разведений сыворотки до 11 ряда. После этого слейте 100 микролитров жидкости из ряда 11. Добавьте 100 микролитров разбавленной отрицательной и положительной сыворотки в каждую соответствующую лунку в строке 12 после шаблона образца.
Запечатайте планшет ИФА полиэтиленовой пленкой и выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа. Между тем, разбавьте вторичные антитела против мышиного IgG HRP в 10 000 раз, добавив PBST. После часовой инкубации промойте планшет ИФА 300 микролитрами PBST на лунку, чтобы очистить несвязанные антитела, затем добавьте 100 микролитров разбавленного вторичного антитела в каждую лунку и инкубируйте планшет при 37 градусах Цельсия в течение 40 минут.
Промойте пластину 300 микролитрами PBST на лунку, затем добавьте 100 микролитров раствора для проявления цвета TMB в каждую лунку. Поставьте тарелки при температуре 37 градусов Цельсия и вдали от света на 10 минут. После чего немедленно прекратите реакцию 50 микролитрами двух молярных серных кислот.
Определите оптическую плотность или значения OD на расстоянии 415 нанометров с помощью ферментного маркера в течение 15 минут после завершения. Физические характеристики новой наноэмульсионной вакцины были проанализированы с помощью просвечивающей электронной микроскопии и атомно-силовой микроскопии. Динамическое рассеяние света использовалось для определения распределения частиц по размерам и дзета-потенциала образца.
SDS-PAGE и вестерн-блоттинг показали, что количество антигена в осадке и надосадочной жидкости значительно не уменьшилось после центрифугирования, что указывает на то, что вакцина была структурно интактной, специфичной и иммуногенной. Наноэмульсионная адъювантная вакцина значительно увеличила общие титры антител IgG, IgG1 и IgG2a у мышей. Иммуногенность белковой вакцины значительно улучшилась.
Значения OD IgG2b в сыворотке крови на 450 нанометрах были самыми высокими, когда PBS использовался в разведении от одного до 5000. Летальная модель мышей MRSA 252 показала, что наноэмульсионная вакцина показала хороший защитный эффект и эффективно ингибировала бактериальную инфекцию MRS A 252, улучшая выживаемость инфицированных мышей. Приготовление наноэмульсии и добавление сыворотки в растение являются наиболее важными.
Кроме того, при обнаружении титра антител следует обратить внимание на корректный более широкий и жидкостный выход. Помимо адъювантов, этот метод также может быть использован для иммунной эволюции других математических массивов, таких как пластмассы или системы доставки.
