تم دعم البحث المذكور في هذا المنشور من قبل مكتب مدير مكتب برامج البنية التحتية للبحوث ، التابع للمعاهد الوطنية للصحة بموجب الجائزة رقم R43OD020304 والمعهد الوطني للصحة العقلية التابع للمعاهد الوطنية للصحة بموجب الجائزة رقم R44MH122117. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

تم اتباع جميع المبادئ التوجيهية الدولية والوطنية والمؤسسية المعمول بها لرعاية الحيوانات واستخدامها. كانت جميع الإجراءات التي أجريت في الدراسات التي شملت الحيوانات متوافقة مع المعايير الأخلاقية للجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية التابعة لشركة ParaTechs Corporation وأجريت وفقا للمعايير التي يمليها مكتب رعاية المختبر ، والمعاهد الوطنية للصحة ، وخدمة الصحة العامة ، ووزارة الصحة والخدمات الإنسانية بالولايات المتحدة. تم استخدام ذكور وإناث CD1 (ICR) وإناث الفئران C57Bl / 6J الذين تتراوح أعمارهم بين >8 أسابيع في هذه الدراسة. تم الحصول على الحيوانات من مصادر تجارية (انظر جدول المواد).
1. إجراء التلاعب عنق الرحم للاستخدام مع التلقيح الاصطناعي في الفئران CD1
<ol><li>الإباضة المتزامنة للفئران الإناث في اليوم 1 واليوم 3<ol><li>حقن إناث الفئران ب 2.5 وحدة دولية PMSG (انظر جدول المواد) عن طريق الحقن داخل الصفاق (IP) في اليوم 1 ، 0.5 ساعة قبل بدء دورة بيت الحيوان المظلمة. ملاحظة: سيوفر كل متبرع ذكر ما يكفي من الحيوانات المنوية ل 10 متلقين من الإناث.</li>
		<li>حقن الإناث ب 2.5 وحدة دولية موجهة الغدد التناسلية المشيمائية البشرية (انظر جدول المواد) عن طريق حقن IP في اليوم 3 ، 1 ساعة قبل بدء دورة الظلام في بيت الحيوان. ملاحظة: توقيت الحقن ونقل الحيوانات المنوية ودورة الضوء بالنسبة لبعضها البعض مهمة جدا. تستند الأوقات المحددة لجميع الإجراءات في هذا البروتوكول إلى دورة ضوء / ظلام مدتها 12 ساعة.</li>
	</ol></li>
	<li>جمع وسعة الحيوانات المنوية الطازجة في اليوم 4<ol><li>تحضير قطرة 500 ميكرولتر من وسط ما قبل حضانة الحيوانات المنوية (PM ، انظر جدول المواد) في طبق زراعة الأنسجة 60 مم تحت زيت البارافين. تحضير طبق واحد لكل متبرع ذكر. توازن لمدة 30 دقيقة على الأقل عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 قبل جمع الحيوانات المنوية.</li>
		<li>في 1 ساعة بعد بدء دورة ضوء الحوض ، القتل الرحيم للذكور وفقا للإرشادات المؤسسية. سيوفر كل ذكر ما يكفي من الحيوانات المنوية ل 10 عمليات تلقيح صناعي.</li>
		<li>تشريح بسرعة البربخ الذيل من الماوس. قم بإجراء شق البطن المستعرض فوق المثانة باستخدام مقص التشريح والملقط المسنن.<ol><li>توجد ضمادات الدهون في الخصية على جانبي المثانة. أمسك إحدى وسادات دهون الخصية بالملقط المنحني ، وقم بإزالة الخصية والبربخ من تجويف الجسم. حدد البربخ الذيلي على أنه تركيب أنبوبي بيضاوي مسطح أسفل الخصية مباشرة.</li>
			<li>امسك البربخ الذيلي بالملقط المنحني ، واستأصله باستخدام مقص صغير بزاوية. قم بإزالة كل من البربخ الذيلية ، ونقلها إلى نسيج ماص لإزالة الدهون والدم تحت مجهر تشريح.</li>
		</ol></li>
		<li>ضع اثنين من الذيول البربخ في كل قطرة 500 ميكرولتر من الجسيمات المتوازنة تحت زيت البارافين عند 37 درجة مئوية. قطع الأنسجة عن طريق عمل ستة شقوق باستخدام مقص صغير. إذا تم استخدام أكثر من متبرع ذكر، فاستخدم بربخا واحدا من كل متبرع لكل عينة من الحيوانات المنوية لتقليل التباين بين العينات.</li>
		<li>قم بتدوير الطبق برفق ، واسمح للحيوانات المنوية بالخروج من الأنسجة لمدة 3 دقائق ، مع الدوران مرة واحدة في الدقيقة. إزالة جميع الأنسجة.</li>
		<li>احتضان عينة الحيوانات المنوية لمدة 45 دقيقة إلى 1 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 للسعة.</li>
		<li>اختياري: قياس عدد الحيوانات المنوية ، وتقييم الحركة تحت المجهر باستخدام مقياس الدم. للعد ، قم بتخفيف الحيوانات المنوية في PM حسب الحاجة.</li>
	</ol></li>
	<li>تأكيد تزامن الدورة الشحمية عن طريق التقييم الخلوي<ol><li>باستخدام مسحة صغيرة مبللة مسبقا (انظر جدول المواد) ، اجمع الخلايا المهبلية برفق من جدار المهبل عن طريق لف المسحة على الأنسجة ، وقم بتشويهها في قطرة 20 ميكرولتر من الماء المعقم على شريحة مجهرية ، وجففها في الهواء.</li>
		<li>تحت المجهر باستخدام تكبير 100x مع إضاءة المجال الساطع ، قم بتقييم وجود الخلايا الظهارية المتقرنة. الإناث في شبق أو في وقت متأخر سوف يكون لها خلايا ظهارية متقرنة موجودة ويجب اختيارها لمعالجة عنق الرحم.</li>
		<li>اختياري: سجل وزن المتلقات الإناث قبل التلقيح.</li>
	</ol></li>
	<li>إجراء التلاعب عنق الرحم (CM)<ol><li>قبل حوالي 0.5 ساعة من التلقيح ، ضع أنثى متلقية على قمة قفص برف سلكي ، مما يسمح للماوس "بالاستيلاء" على سطح شريط القفص. أمسك بالقرب من قاعدة الذيل باستخدام الإبهام والسبابة وقم بزاوية الذيل لأعلى مع تثبيت الحيوان (الشكل 1). ملاحظة: سيبقى الماوس ثابتا طوال مدة الإجراء عند تنفيذ تقنية المعالجة بشكل صحيح. إذا تحرك الماوس خارج موضعه ، فقم بتغيير موضعه برفق والمتابعة. إذا تم اختيار عدواني كمتلقي ، فإن السماح للحيوان بالدخول إلى نفق التخصيب أثناء الإجراء يمكن أن يكون مهدئا. يعد استخدام النفق أمرا اختياريا ، ولكنه يمكن أن يساعد الباحثين في التعامل مع الحيوانات من خلال توفير إلهاء أثناء هذا الإجراء.</li>
		<li>أدخل الطرف الحاد لقضيب بلاستيكي صغير (انظر جدول المواد) عن طريق المهبل للتلامس مع عنق الرحم ، واهتز لمدة 30 ثانية عن طريق ملامسة أداة تشذيب (انظر جدول المواد). ملاحظة: ضع القضيب في موضعه قبل بدء أداة التشذيب. كلاهما يحملان بيد واحدة أثناء العملية. لا حاجة للتخدير أو التسكين.</li>
	</ol></li>
	<li>نقل الحيوانات المنوية غير الجراحية للتلقيح الاصطناعي<ol><li>ضع جهاز التلقيح (انظر جدول المواد) على ماصة P200 مضبوطة على 40 ميكرولتر ، وقم بإزالة الغطاء الواقي.</li>
		<li>قم بإزالة حصة عينة الحيوانات المنوية السعوية من الطبق عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 ، وانقلها إلى طبق زراعة الأنسجة 35 مم بدون زيت عند 37 درجة مئوية. سيتم استخدام عينة الحيوانات المنوية على الفور لنقلها. ملاحظة: سوف تفقد الحيوانات المنوية حركتها بسرعة خارج حاضنة CO2 . الحفاظ على عينة الحيوانات المنوية السعة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 قدر الإمكان.</li>
		<li>اضغط على مكبس الماصة إلى المحطة الأولى ، واخفض طرف القسطرة في عينة الحيوانات المنوية عند 37 درجة مئوية ، وقم بتحميل الحيوانات المنوية ببطء في جهاز النقل. تجنب أي كتل. قم بإزالة الزيت المتبقي من الجزء الخارجي لجهاز التلقيح باستخدام نسيج ماص. توضع جانبا ماصة. ملاحظة: يجب تجنب نقل زيت البارافين إلى قرن الرحم. قم بإزالة الزيت المتبقي من الجزء الخارجي لجهاز التلقيح باستخدام نسيج ماص.</li>
		<li>ضع الأنثى المتلقية على أعلى قفص الرف السلكي. أمسك الماوس في موضعه باستخدام نفس تقنية المناولة المستخدمة في CM ؛ أمسك بالقرب من قاعدة الذيل باستخدام الإبهام والسبابة ، وقم بزاوية الذيل لأعلى مع تثبيت الحيوان.</li>
		<li>ضع المنظار الصغير (انظر جدول المواد) في المهبل.</li>
		<li>أدخل قسطرة جهاز التلقيح في المنظار ، من خلال عنق الرحم ، وفي الرحم. بمجرد اتصال محور الجهاز بالمنظار ، قم بتوزيع الحيوانات المنوية عن طريق الضغط على مكبس الماصة إلى المحطة الأولى. تجنب نقل الهواء الزائد إلى قرن الرحم. ملاحظة: إذا لم يتم وضع القسطرة بشكل صحيح ، فسوف تصطدم بالأنسجة المحيطة بعنق الرحم ، مما يؤدي إلى ثنيها وثنيها في النهاية. إذا لم تنزلق القسطرة عبر عنق الرحم في المحاولة الأولى ، فقم بإرجاع القسطرة برفق للخارج ، وأعد المحاولة حتى تنجح. قد يكون من الضروري إعادة وضع المنظار.</li>
		<li>قم بإزالة الجهاز والمنظار. لا يلزم مراقبة ما بعد الإجراء.</li>
	</ol></li>
	<li>اختياري: فحص الحمل في الأيام 10-12<ol><li>استخدم زيادة الوزن لتحديد حالة الحمل. تعتمد زيادة الوزن على الإجهاد ، لكن الزيادة التي لا تقل عن 1-2 غرام ترتبط بالحمل.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65477/65477fig01.jpg"> الشكل 1: تقنية الإمساك بالماوس لمعالجة عنق الرحم. يقع الماوس على قمة قفص سلكي ويتم تثبيته عند الذيل وعلى كلا الجانبين في مقدمة الأرجل الخلفية. يتم إدخال الطرف الحاد لقضيب بلاستيكي صغير عن طريق المهبل للاتصال بعنق الرحم ويهتز عن طريق ملامسة أداة تشذيب. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65477/65477fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
2. إجراء نقل الأجنة غير الجراحي للاستخدام مع التلاعب بعنق الرحم في الفئران CD1
<ol><li>الإباضة المتزامنة للفئران الإناث في اليوم 1 واليوم 3<ol><li>حقن الفئران الإناث مع 2.5 وحدة دولية PMSG عن طريق حقن IP في اليوم 1 ، حوالي 6 ساعات بعد بدء دورة ضوء بيت الحيوان.</li>
		<li>حقن الإناث ب 2.5 وحدة دولية موجهة الغدد التناسلية المشيمائية البشرية عن طريق حقن IP في اليوم الثالث ، في فترة 47 ساعة بعد حقن PMSG أو حوالي 5 ساعات بعد بدء دورة ضوء بيت الحيوان.</li>
	</ol></li>
	<li>تأكيد تزامن الدورة الشحمية عن طريق التقييم الخلوي<ol><li>في اليوم 3 ، حوالي 1 ساعة قبل CM ، قم بإجراء علم الخلايا على المتلقين المحتملين. باستخدام مسحة صغيرة مبللة مسبقا ، اجمع الخلايا المهبلية برفق من جدار المهبل عن طريق لف المسحة على الأنسجة ، وقم بتشويهها في قطرة 20 ميكرولتر من الماء المعقم على شريحة مجهرية ، وجففها في الهواء.</li>
		<li>تحت المجهر باستخدام تكبير 100x مع إضاءة المجال الساطع ، قم بتقييم وجود الخلايا الظهارية المتقرنة. الإناث في شبق أو في وقت متأخر سوف يكون لها خلايا ظهارية متقرنة موجودة ويجب اختيارها لمعالجة عنق الرحم.</li>
		<li>اختياري: سجل وزن متلقي الأجنة الإناث المحتملات.</li>
	</ol></li>
	<li>أداء CM<ol><li>في اليوم 3 ، 1 ساعة قبل بدء دورة بيت الحيوان المظلمة ، ضع أنثى مستلمة على قمة قفص برف سلكي ، مما يسمح للحيوان "بالاستيلاء" على سطح شريط القفص. أمسك بالقرب من قاعدة الذيل باستخدام السبابة والإبهام ، ثم قم بزاوية الذيل لأعلى أثناء تثبيت الحيوان (الشكل 1). ملاحظة: سيبقى الماوس ثابتا طوال مدة الإجراء عند تنفيذ تقنية المعالجة بشكل صحيح. إذا تحرك الماوس خارج موضعه ، فقم بتغيير موضعه برفق ، وتابع. إذا تم اختيار عدواني كمتلقي ، فإن السماح للحيوان بالدخول إلى نفق التخصيب أثناء الإجراء يمكن أن يكون مهدئا.</li>
		<li>أدخل الطرف الحاد لقضيب بلاستيكي صغير عن طريق المهبل للاتصال بعنق الرحم ، واهتزه لمدة 30 ثانية عن طريق ملامسة أداة التشذيب. ملاحظة: ضع القضيب في موضعه قبل بدء أداة التشذيب. كلاهما يحملان بيد واحدة أثناء العملية. لا حاجة للتخدير أو التسكين.</li>
	</ol></li>
	<li>نقل الأجنة غير الجراحي في اليوم 6<ol><li>ضع قطرة 20 ميكرولتر من وسط M2 (انظر جدول المواد) على غطاء طبق زراعة الأنسجة. ملاحظة: يتم اختيار الغطاء لأنه يحتوي على حافة أقصر ، وبالتالي فهو مناسب للوصول إلى الأجنة في القطرة. لا تقم في أي وقت بوضع زيت البارافين فوق قطرة M2 ، حيث يبدو أن إدخال الزيت في قرن الرحم يؤثر سلبا على نقل الأجنة.</li>
		<li>تحت المجهر وباستخدام الإضاءة العاكسة ، قم بتحميل 10-20 كيسة أريمية في قطرة متوسطة باستخدام ماصة قياسية للتعامل مع الجنين (انظر جدول المواد). ملاحظة: يعتمد العدد الأمثل للأجنة المراد نقلها على سلالة الفأر وأي تلاعب خضعت له الأجنة. بالنسبة للأجنة السليمة غير المعالجة ، يجب أن يكون نقل 10-15 جنينا كافيا. لإعادة الاشتقاق أو الأجنة المعدلة وراثيا ، يكون نقل المزيد من الأجنة مناسبا.</li>
		<li>قم بتثبيت جهاز نقل الأجنة غير الجراحي (انظر جدول المواد) على ماصة P2 مضبوطة على 1.8 ميكرولتر. قم بإزالة غطاء القسطرة الواقي.</li>
		<li>اضغط على مكبس الماصة إلى المحطة الأولى ، وخفض طرف القسطرة في الوسط ، واسحب الأجنة ببطء إلى طرف قسطرة الجهاز. قم بإزالة الطرف من الوسط. ملاحظة: سيسمح تصور الأجنة تحت التكبير المنخفض بتحميل الأجنة بسهولة في الجهاز. إذا كانت الأجنة مبعثرة في القطرة ، هز الطبق برفق من جانب إلى آخر لتركيز الأجنة في وسط القطرة ، أو أعد وضعها باستخدام ماصة مناولة الجنين.</li>
		<li>اضبط حجم الماصة على 2.0 ميكرولتر لتوليد فقاعة هواء صغيرة عند طرف القسطرة. ضع الماصة برفق مع تحميل الأجنة بالقرب من قفص الفأر.</li>
		<li>ضع الأنثى المتلقية على أعلى قفص الرف السلكي. أمسك الماوس في موضعه باستخدام نفس تقنية المناولة المستخدمة في CM ؛ أمسك بالقرب من قاعدة الذيل باستخدام السبابة والإبهام ، ثم قم بزاوية الذيل لأعلى مع تثبيت الحيوان.</li>
		<li>ضع منظارا صغيرا (انظر جدول المواد) في المهبل.</li>
		<li>أدخل قسطرة جهاز النقل في المنظار ، من خلال عنق الرحم ، وفي الرحم. بمجرد اتصال محور الجهاز بالمنظار ، قم بتوزيع الأجنة عن طريق الضغط على مكبس الماصة إلى المحطة الأولى. تجنب نقل الهواء الزائد إلى قرن الرحم.</li>
		<li>دون تحرير مكبس الماصة ، قم بإزالة الجهاز والمنظار. لا يلزم مراقبة ما بعد الإجراء.</li>
	</ol></li>
</ol>

التلاعب بعنق الرحم الناجم عن الحمل الكاذب في الفئران للمساعدة على الإنجاب

<ol>
	<li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, fourth edition. , (2014).</li><li>Wake, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+induction+of+pseudopregnancy+using+sonic+vibration+in+mice.">Successful induction of pseudopregnancy using sonic vibration in mice.</a> Scientific Reports. 13 (1), 3604 (2023).</li><li>Stone, B. J., Steele, K. H., Fath-Goodin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+effective+nonsurgical+artificial+insemination+protocol+using+the+NSET+device+for+sperm+transfer+in+mice+without+anesthesia.">A rapid and effective nonsurgical artificial insemination protocol using the NSET device for sperm transfer in mice without anesthesia.</a> Transgenic Research. 24 (4), 775-781 (2015).</li><li>Green, M., Bass, S., Spear, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+device+for+the+simple+and+rapid+transcervical+transfer+of+mouse+embryos+eliminates+the+need+for+surgery+and+potential+post-operative+complications.">A device for the simple and rapid transcervical transfer of mouse embryos eliminates the need for surgery and potential post-operative complications.</a> BioTechniques. 47 (5), 919-924 (2009).</li><li>Bin Ali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+pregnancy+and+birth+rates+with+routine+application+of+nonsurgical+embryo+transfer.">Improved pregnancy and birth rates with routine application of nonsurgical embryo transfer.</a> Transgenic Research. 23 (4), 691-695 (2014).</li><li>Men, H., Stone, B. J., Bryda, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Media+optimization+to+promote+rat+embryonic+development+to+the+blastocyst+stage+in+vitro.">Media optimization to promote rat embryonic development to the blastocyst stage in vitro.</a> Theriogenology. 151, 81-85 (2020).</li><li>Stone, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nonsurgical+embryo+transfer+technique+for+fresh+and+cultured+blastocysts+in+rats.">A nonsurgical embryo transfer technique for fresh and cultured blastocysts in rats.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 59 (5), 488-495 (2020).</li><li>Steele, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonsurgical+embryo+transfer+device+compared+with+surgery+for+embryo+transfer+in+mice.">Nonsurgical embryo transfer device compared with surgery for embryo transfer in mice.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (1), 17-21 (2013).</li><li>Terkel, J., Witcher, J. A., Adler, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+&amp;#34;memory&amp;#34;+of+cervical+stimulation+for+the+promotion+of+pregnancy+in+rats.">Evidence for &amp;#34;memory&amp;#34; of cervical stimulation for the promotion of pregnancy in rats.</a> Hormones and Behavior. 24 (1), 40-49 (1990).</li><li>Kaneko, T., Endo, M., Tsunoda, S., Nakagawa, Y., Abe, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+induction+of+pseudopregnancy+by+artificial+stimulation+using+a+sonic+vibration+in+rats.">Simple induction of pseudopregnancy by artificial stimulation using a sonic vibration in rats.</a> Scientific Reports. 10 (1), 2729 (2020).</li><li>Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+estrous+cycle+identification+tool+and+images.">Mouse estrous cycle identification tool and images.</a> PLoS One. 7 (4), e35538 (2012).</li><li>Cora, M. C., Kooistra, L., Travlos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaginal+cytology+of+the+laboratory+rat+and+mouse:+Review+and+criteria+for+the+staging+of+the+estrous+cycle+using+stained+vaginal+smears.">Vaginal cytology of the laboratory rat and mouse: Review and criteria for the staging of the estrous cycle using stained vaginal smears.</a> Toxicologic Pathology. 43 (6), 776-793 (2015).</li><li>Luo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superovulation+strategies+for+6+commonly+used+mouse+strains.">Superovulation strategies for 6 commonly used mouse strains.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (4), 471-478 (2011).</li><li>Gates, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+and+developmental+capacity+of+eggs+from+immature+mice+treated+with+gonadotrophins.">Viability and developmental capacity of eggs from immature mice treated with gonadotrophins.</a> Nature. 177 (4512), 754-755 (1956).</li><li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).</li><li>Hasegawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+scheduled+production+of+pseudopregnant+female+mice+for+embryo+transfer+by+estrous+cycle+synchronization.">Efficient and scheduled production of pseudopregnant female mice for embryo transfer by estrous cycle synchronization.</a> Journal of Reproduction and Development. 63 (6), 539-545 (2017).</li><li>Beaumont, H. M., Smith, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+mortality+during+the+pre-+and+post-implantation+periods+of+pregnancy+in+mature+mice+after+superovulation.">Embryonic mortality during the pre- and post-implantation periods of pregnancy in mature mice after superovulation.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 45 (3), 437-448 (1975).</li><li>Champlin, A. K., Dorr, D. L., Gates, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+stage+of+the+estrous+cycle+in+the+mouse+by+the+appearance+of+the+vagina.">Determining the stage of the estrous cycle in the mouse by the appearance of the vagina.</a> Biology of Reproduction. 8 (4), 491-494 (1973).</li></ol>

تعمل كل من باربرا ستون وسارة سرودولسكي في شركة ParaTechs Corporation ، ليكسينغتون ، كنتاكي ، الولايات المتحدة الأمريكية. تمتلك ParaTechs حقوق الترخيص الحصرية لتصنيع جهاز mNSET للفئران. قامت ParaTechs Corp بتطوير وبيع أجهزة mNSET و mC&I ، والتي يمكن استخدامها لنقل الأجنة غير الجراحي والتلقيح الاصطناعي غير الجراحي ، على التوالي.

3Rs هو إطار أخلاقي لاستخدام الحيوانات في البحث ، كما هو موضح في عام 1959 من قبل راسل وبورش في "مبادئ التقنية التجريبية الإنسانية"15. تمثل 3Rs الاستبدال والتقليل والصقل في استخدام الحيوانات. تتوافق البروتوكولات الموضحة هنا مع 3Rs. تقلل تقنية التلاعب بعنق الرحم من عدد الحيوانات التي تحتاجها من خلال عدم الحاجة إلى استخدام الذكور لإنتاج إناث كاذبة الحوامل. تلغي هذه التقنية أيضا الحاجة إلى إجراء قطع القناة المنوية على الذكور ، وبالتالي توفير الصقل عن طريق تقليل الألم والضيق. تقنيات الإنجاب المساعدة الموصوفة هنا (التلقيح الاصطناعي ونقل الأجنة) غير جراحية ، وبالتالي ، يوفر كلاهما صقلا 3Rs عن طريق تقليل الألم والضيق8الناجم عن بدائلهما الجراحية.
يعد استخدام الإناث الحوامل الزائفات ضروريا لاستعادة الجراء عند إجراء المساعدة على الإنجاب في الفئران1. يعد إجراء CM طريقة فعالة لإنتاج الإناث الحوامل الزائفات ، ولكن تزامن مرحلة الدورة الشحمية للإناث المتلقيات هو خطوة أولى حاسمة في العملية. يمكن أن يقلل التزامن الوحشي بشكل كبير من عدد الإناث اللازمة في المستعمرة لإعداد المتلقين المحتملين ويساعد في إنتاج إناث حاملات كاذبة موقوتة عند الطلب. لا يبدو أن استخدام جرعة منخفضة من الهرمونات يسبب أي آثار ضارة على استعادة الفضلات الحية في الفئران CD1. يجب توخي الحذر مع السلالات الأخرى للعثور على مزيج الهرمون والتركيز الذي ينتج أفضل الإناث المتلقية للأجنة أو الحيوانات المنوية المنقولة. يمكن تحقيق التزامن باستخدام PMSG و hCG16 ، لكن الجرعات التي تنتج إناثا مفرطة التبويض قد لا تكون مناسبة للحمل المستمر17.
لتحديد ما إذا كانت الأنثى في شبق ، تم إجراء تقييم خلوي في هذا العمل. يمكن أيضا تقييم المرحلة الشحمية من خلال ملاحظة الفتحة المهبلية11,18. في حين أن هذه الطريقة مفيدة للغاية ويمكن استخدامها بمفردها أو كتأكيد ، إلا أنها أكثر ذاتية من استخدام علم الخلايا. علم الخلايا المهبلية دون تلطيخ سريع وفعال على حد سواء لاختيار الإناث في شبق لأنه يمكن التعرف على الخلايا الظهارية المتقرنة بسهولة. في هذا البروتوكول ، يتم إجراء التقييم الخلوي قبل CM لتحديد المتلقين المحتملين. من المهم إجراء علم الخلايا قبل CM ، حيث يميل الإجراء إلى تفتيت الخلايا المقطوعة من منطقة المهبل ، مما يجعل التعرف عليها صعبا. يمكن إجراء التقييم الخلوي للحمل الكاذب أو الحمل في 3.5-11.5 يوما بعد CM (dpcm) لمدة 3 أيام متتالية. يجب أن يكون الملف الشخصي للإناث ركوب الدراجات الشهوقة على الأقل 1 يوم مع تسلل كبير للخلايا الظهارية المتقرنة. يجب أن تظهر الإناث الحوامل / الحوامل الزائفات ملف تعريف diestrus (في الغالب كريات الدم البيضاء مع عدد خلايا منخفض محتمل) لمدة 3 أيام متتالية.
من خلال تطوير تقنية CM ، وجد أن بعض الفئران أكثر تقبلا للإجراء من غيرها. تعتبر إناث الفئران CD1 مرشحة ممتازة بسبب طبيعتها الهادئة وغرائزها المغذية الممتازة. من السهل التعامل مع هذه السلالة وتعمل بشكل جيد أثناء تقنيات CM وتقنيات الإنجاب المساعدة غير الجراحية. تميل الفئران C57Bl / 6 إلى أن تكون أكثر عدوانية وأقل رعاية. في حين أن هذا البروتوكول أنتج بشكل فعال إناث C57Bl / 6 الحامل الزائف باستخدام CM ، إلا أنهن كن أقل عرضة للتساهل باستمرار مع الإجراء. يبدو أن هذا يرتبط إلى حد ما بالمرحلة الشحمية خلال CM. كانت الإناث في شبق أو شبق أكثر تقبلا. سمح استخدام أنبوب التخصيب للحيوان بالدخول إلى الوصول إلى المهبل لإجراء العملية وساعد على تهدئة الأنثى. الإجراء نفسه لا يقيد الأنثى تماما ، لذلك يمكن للحيوان الانسحاب في أي وقت. إذا حدث هذا ، يمكن إعادة وضع الحيوان ، ويمكن بعد ذلك متابعة الإجراء. يتوقف توقيت الإجراء إذا ابتعدت الأنثى واستأنفت عند استئناف الإجراء. من الأمور الحاسمة لنجاح الإجراء مرحلة الدورة الشحمية (الشبق المتأخر والشبق) واتصال القضيب بعنق الرحم. يوفر اهتزاز ماكينة القطع CM قياسية. لضمان ملامسة عنق الرحم ، يتم تطبيق ضغط لطيف على القضيب ، ويتم ضمان وضع القضيب مقابل عنق الرحم بحركات صغيرة ذهابا وإيابا للقضيب.
أدى استخدام CM إلى تحسين بروتوكول NSAI ، حيث يمكن اختيار الإناث في المرحلة الصحيحة من الدورة الشحمية قبل نقل الحيوانات المنوية ، ولم يعد البروتوكول مشروطا بالتزاوج مع الذكور الذين تم استئصال الأسهر. يتم توقيت تزامن دورة التلقيح الاصطناعي بحيث يتوافق نضوج البويضة مع نقل الحيوانات المنوية في صباح اليوم 4. من الأمور الحاسمة لنجاح البروتوكول تكييف توقيت الإباضة بحيث يمكن أن يحدث الإخصاب. يجب توخي الحذر لإدارة هرمون موجهة الغدد التناسلية المشيمائية البشرية 15-17 ساعة قبل النقل المتوقع للحيوانات المنوية ، كما هو مقترح للتوقيت المستخدم للتخصيب في المختبر 1. ستؤثر جودة عينة الحيوانات المنوية بشكل مباشر على نتيجة التلقيح الاصطناعي. الحيوانات المنوية الطازجة التي تم سعتها ستعمل بشكل أفضل. يمكن للحيوانات المنوية المحفوظة بالتبريد ذات النوعية الجيدة إنتاج أجنة مخصبة في الجسم الحي. ومع ذلك ، يجب توخي الحذر عند النقل المباشر للحيوانات المنوية المذابة ، لأن المواد الواقية بالتبريد المتبقية المنقولة إلى قرن الرحم قد تمنع الزرع (ملاحظات غير منشورة).
يعد استخدام CM جنبا إلى جنب مع نقل الأجنة تكيفا سهلا من الناحية المفاهيمية. يقلل تزامن الدورة Estrous من عدد الإناث اللازمة لإنتاج مجموعة المستلمين. تحديد المرحلة الشهوانية قبل CM يزيد من احتمال الحصول على المتلقين الحوامل الزائفة. عيب واحد من هذه الطريقة هو أن علم الخلايا من المتلقين في وقت نقل الأجنة هو في مرحلة من التغير. جميع أنواع الخلايا موجودة إذا كانت الأنثى تنتقل من شبق إلى ملف الحمل الكاذب ، ويصبح الحمل الكاذب واضحا فقط إذا تم تتبع علم الخلايا لعدة أيام. استنادا إلى نجاح (>80٪) في الانتقال من شبق إلى الحمل الكاذب للفئران CD1 و C57Bl / 6 ، من المتوقع أن تكون هذه الطريقة مناسبة لمتلقي نقل الأجنة. تظهر النتائج الأولية نجاحا جيدا مع نقل الأجنة غير الجراحي المحدود. بشكل عام ، فإن كفاءة نقل الأجنة غير الجراحية قابلة للمقارنة مع التقنية الجراحية 4,5 ، ويمكن أن يحل النقل غير الجراحي محل عمليات نقل الأجنة الجراحية في مرحلة الكيسة الأريمية. بالنسبة للأجنة في المراحل المبكرة ، يلزم زراعة الأجنة إلى مرحلة الكيسة الأريمية. ومع ذلك ، إذا كان النقل الجراحي مفضلا ، فمن الممكن تكييف تقنية CM مع التوقيت الصحيح اللازم للمتلقات الحوامل الزائفاتالمناسبات 2. بشكل عام ، فإن متلقي الجنين هم 1 يوم أقل تقدما من الجنين. على سبيل المثال ، يتم حصاد الكيسات الأريمية عند 3.5 dpc من المتبرعين ونقلها إلى 2.5 متلقي dpc. لذلك ، يجب إجراء CM بحيث يكون المتلقي في حالة حمل زائف أقل تطورا من الأجنة.
في الختام ، تظهر تقنية CM الموضحة هنا وعدا ممتازا للتكامل مع تقنيات الإنجاب المساعدة الأخرى للفئران. لقد قدمنا بروتوكولات ناجحة للتلقيح الاصطناعي ونقل الأجنة باستخدام تقنيات غير جراحية. مجتمعة ، توفر تقنية CM مزايا 3Rs ، بما في ذلك (1) تقليل عدد الحيوانات من خلال القضاء على الحاجة إلى الذكور الذين تم استئصال الأسهر و (2) تحسين التقنيات عن طريق استبدال التقنيات الجراحية ببدائل غير جراحية.

تستخدم تقنيات المساعدة على الإنجاب لإنتاج نماذج الفئران المعدلة وراثيا ، وكذلك استعادة السلالات من الحفظ بالتبريد ، وإعادة اشتقاق السلالات من حالة صحية معرضة للخطر ، والإدارة الاستراتيجية لحظيرة الحيوان ، بما في ذلك إنتاج مجموعات متطابقة مع العمر. تتطلب جميع تقنيات الإنجاب المساعدة في الفئران استخدام متلقات من الإناث الحوامل الزائفات لنمو الجنين. تاريخيا ، تم إنشاء المتلقين الحوامل الزائفة عن طريق التزاوج مع الذكور العقيمة ، والتي إما استئصال الأسهر جراحيا أو العقم وراثيا ، ويتم تقييم وجود سدادة الجماع في صباح اليوم التالي1. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير بروتوكول للتحفيز الصوتي في الفئران للنقل الجراحي لأجنة الفأر النووية أو ثنائية الخلية2. لقد طورنا أيضا بروتوكول معالجة عنق الرحم (CM) للاستخدام مع التلقيح الاصطناعي ونقل الأجنة غير الجراحي للأكياس الأريمية. الأساس المنطقي لاستخدام الإجراء هو توفير تخفيض 3Rs في عدد الحيوانات المطلوبة (لم تعد تتطلب ذكور الفئران) وصقل التقنيات المستخدمة (لم تعد تستلزم إجراء قطع القناة المنوية الجراحي لذكور الفئران). يتضمن وصف هذا البروتوكول تقنية المساعدة على الإنجاب المرتبطة للمساعدة في دمج CM في سير العمل العادي. الهدف العام من طريقة CM هو استبدال استخدام الفئران الذكور في توليد الإناث الحوامل الزائفة لتقنيات الإنجاب المساعدة ، بما في ذلك التلقيح الاصطناعي ونقل الأجنة.
تم تطوير بروتوكول CM الموصوف هنا لأول مرة للمساعدة في التلقيح الاصطناعي في الفئران. حقق بروتوكول التلقيح الاصطناعي ، كما هو موضح في الأصل ، معدل حمل بنسبة 50 ٪ ، بمتوسط حجم القمامة من 7 الجراء3. كانت الفئران المتلقية CD1 متزامنة مع جرعة منخفضة من الهرمونات ، بما في ذلك موجهة الغدد التناسلية في مصل الفرس الحامل (PMSG) وموجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية (hCG) ، في فترة 47 ساعة قبل التلقيح. ومن مزايا التزامن الشبق أنه يسمح باستخدام البروتوكول خلال ساعات العمل العادية. تم إقران الإناث مع الذكور الذين تم استئصال الأسهر مباشرة بعد التلقيح الاصطناعي ، وتم تأكيد التزاوج من خلال وجود سدادة الجماع. تم الإبلاغ عن عدم الاتساق في معدل التزاوج مع المتلقين كصعوبة في الإجراء. لذلك ، تم البحث عن بدائل للتزاوج لتحريض الحمل الكاذب.
تقدم هذه الدراسة تقنية CM موحدة لزيادة كفاءة إنتاج الإناث الحوامل الزائفة. بالنسبة للإناث في شبق أو شبق ، يتم إدخال الطرف الحاد لقضيب بلاستيكي صغير عن طريق المهبل للاتصال بعنق الرحم ويهتز لمدة 30 ثانية عن طريق ملامسة أداة تشذيب. يتم تنفيذ الإجراء على قفص يعلوه الأسلاك. لا حاجة للتخدير أو التسكين. تقنية CM ملائمة لإنتاج الإناث الحوامل الكاذبة ، والتي يمكن أن تنتج الفضلات بعد التلقيح الاصطناعي غير الجراحي دون الحاجة إلى التزاوج مع الذكور الذين تم استئصال الأسهر. يمكن أيضا استخدام CM لإنتاج الإناث الحوامل الكاذبة كمتلقين لنقل الأجنة. على وجه التحديد ، يمكن إقران تقنية CM بنقل الأجنة غير الجراحي ، كما هو موضح هنا. لقد ثبت أن الطرق غير الجراحية فعالة في نقل الأجنة في مرحلة الكيسة الأريمية في الفئران4,5 والجرذان 6,7. نظرا لأن هذه الطريقة غير الجراحية هي بديل فعال للطرق الجراحية ، فإنها تعتبر صقلا 3Rs للتقنية. استنادا إلى الأبحاث السابقة ، تشير مستويات الكورتيكوستيرون البرازية ، كمقياس للإجهاد ، إلى أن الطبيعة غير الجراحية للإجراء لا تزيد من مستويات التوتر في القوارض 7,8. الإجراءات أقل تحديا من الناحية الفنية من نقل الأجنة الجراحي وهي أسرع بكثير في الأداء. عندما يتم نقل الأجنة إلى الرحم ، يجب نقل أجنة المرحلة الصحيحة لتطور الرحم. بالنسبة للفئران ، يتم نقل الكيسات الأريمية إلى 2.5 يوم بعد الجماع (dpc) المتلقين الحوامل الزائفة.
بالنسبة للتقنيتين غير الجراحيتين الموصوفتين هنا ، يختلف توقيت إعطاء الهرمون وتقنية CM. توقيت إجراء CM بالنسبة إلى شبق مهم للنجاح ، لأنه يحل محل التزاوج الطبيعي لإنتاج المتلقين الكاذبة. من خلال القضاء على الحاجة إلى الذكور الذين تم استئصال الأسهر للحث على الحمل الكاذب ، يوفر هذا الإجراء فوائد 3Rs من خلال تقليل عدد الحيوانات المطلوبة والقضاء على ضرورة الذكور المعدلة جراحيا. الإجراء نفسه سريع (30 ثانية) ولا يتطلب تخديرا أو تسكين. تزيد هذه التقنية بشكل كبير من الموثوقية والقدرة على التنبؤ بإنتاج الإناث الحوامل الزائفات للمساعدة على الإنجاب.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Blastocyst stage embryos</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CARD Fertiup Preincubation Medium (PM)</td>
			<td>CosmoBio</td>
			<td>KYD-002-EX</td>
			<td>For sperm capacitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo handling pipette</td>
			<td>Cook Medical</td>
			<td>K-FPIP-1120-10BS</td>
			<td>Flexipet is available in various diameters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo handling pipette assembly</td>
			<td>Paratechs</td>
			<td>90010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female mice, Crl:CD1(ICR)</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td>22</td>
			<td>&#62;8 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11053-10</td>
			<td>Toothed, for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11052-10</td>
			<td>Curved, for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Dumont #5</td>
			<td>Fine, for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>267110</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human Chorionic Gonadotropin (hCG)</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>hor-250</td>
			<td>For estrus synchronization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator, 37 &#176;C 5% CO2</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator, 37 &#176;C, benchtop</td>
			<td>Cook</td>
			<td>K-MINC-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td>Absorbant tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MR-015-D</td>
			<td>Embryo handling medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male mice, Crl:CD1(ICR)</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td>22</td>
			<td>&#62;8 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mC&#38;I device</td>
			<td>ParaTechs</td>
			<td>60020</td>
			<td>For sperm transfer, specula included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCM rod</td>
			<td>ParaTechs</td>
			<td>90050</td>
			<td>Smooth, blunt, with a diameter @3 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX7</td>
			<td>20x and 40x magnification with transmitted and reflected illumination source for embryo work and dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>ACCU-SCOPE</td>
			<td>3032</td>
			<td>100x magnification with bright field illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mNSET device</td>
			<td>ParaTechs</td>
			<td>60010</td>
			<td>For embryo transfer, specula included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles, 26 G</td>
			<td>Exel</td>
			<td>26402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papanicolaou Staining System</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76265-730</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette, P200</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4074</td>
			<td>Fits the C&#38;I device for sperm transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette, PR-2</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17008648</td>
			<td>Fits the NSET device for embryo transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG)</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>hor-272</td>
			<td>For estrus synchronization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>American Weigh Scales</td>
			<td>LB-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14068-12</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14081-09</td>
			<td>Angled, dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swabs, Constix</td>
			<td>Contec</td>
			<td>SC-4</td>
			<td>For vaginal cytology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes, 1 cc</td>
			<td>Becton Dickenson and Company</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes, 35 mm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes, 60 mm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmer</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>ChroMini T-Cut</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire bar topped mouse cage</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducing pseudopregnancy in female mice without the need for vasectomized males prior to non-surgical embryo transfer or artificial insemination

للحفاظ على الحمل بنجاح مع نقل الأجنة أو التلقيح الاصطناعي ، يجب حث الفئران المتلقية الإناث في حالة الحمل الكاذب. يتم إقران إناث الفئران تقليديا بين عشية وضحاها مع الذكور الذين تم استئصال الأسهر ، وفي صباح اليوم التالي ، يتم تقييم وجود سدادة الجماع. لزيادة كفاءة إنتاج الإناث الحوامل الزائفة ، تم توحيد تقنية التلاعب بعنق الرحم لاستخدامها مع نقل الأجنة غير الجراحي أو تقنيات التلقيح الاصطناعي في الفئران. يتم إدخال الطرف الحاد لقضيب بلاستيكي صغير عن طريق المهبل للاتصال بعنق الرحم ويهتز لمدة 30 ثانية عن طريق ملامسة أداة التشذيب. الإجراء سريع ولا يتطلب تخديرا أو تسكين. تزيد هذه التقنية من الموثوقية والقدرة على التنبؤ بإنتاج الإناث الحوامل الكاذبة وتلغي تماما متطلبات الذكور الذين تم استئصال الأسهر. بالنسبة للفئران CD1 ، كانت كفاءة تحريض الحمل الكاذب باستخدام معالجة عنق الرحم 83٪ للإناث في شبق (N = 76) ولكن تم توصيل 38٪ فقط من الإناث في شبق من قبل الذكور الذين تم استئصال الأسهر (N = 24). تم إجراء التلقيح الاصطناعي في الفئران CD1 عن طريق تزامن شبق مع الهرمونات ، والتلاعب عنق الرحم ، ونقل الرحم للحيوانات المنوية. كان لدى متلقي التلقيح الاصطناعي الذين يتلقون معالجة عنق الرحم (N = 76) معدل حمل 72٪ ومتوسط حجم فضلات يبلغ 8.3 جرو. يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لإنتاج إناث حوامل كاذبة لنقل الأجنة غير الجراحي. لذلك ، فإن تحفيز الحمل الكاذب عن طريق التلاعب بعنق الرحم هو بديل مناسب وفعال للتزاوج مع ذكر مقطوع الأسهر عند إجراء تقنيات الإنجاب المساعدة غير الجراحية. يوفر استخدام التلاعب بعنق الرحم فوائد 3Rs (الاستبدال والتقليل والصقل) لتقنيات الإنجاب المساعدة عن طريق تقليل عدد الحيوانات المطلوبة والقضاء على ضرورة الذكور المعدلة جراحيا.

Assisted reproduction technologies are used for the production of genetically modified mouse models, as well as the recovery of strains from cryopreservation, the rederivation of strains from a compromised health status, and strategic vivarium management, including the production of age-matched cohorts. All assisted reproduction techniques in mice require the use of pseudopregnant female recipients for embryo development. Historically, pseudopregnant recipients have been generated by mating with sterile males, which are either surgically vasectomized or genetically infertile, and the presence of a copulation plug is assessed the following morning1. Recently, a protocol for sonic stimulation in mice has been developed for the surgical transfer of pronuclear or two-cell mouse embryos2. We have also developed a cervical manipulation (CM) protocol for use with artificial insemination and the non-surgical embryo transfer of blastocysts. The rationale for the use of the procedure is to provide a 3Rs reduction in the number of animals required (no longer requiring male mice) and a refinement of the techniques used (no longer necessitating the surgical vasectomy procedure for male mice). The description of this protocol includes the associated assisted reproduction technique to aid in the integration of CM into normal workflows. The overall goal of the CM method is to replace the use of male mice in the generation of pseudopregnant females for assisted reproduction techniques, including artificial insemination and embryo transfer.
The CM protocol described here was first developed to assist with artificial insemination in mice. The artificial insemination protocol, as originally described, achieved a pregnancy rate of 50%, with an average litter size of 7 pups3. CD1 recipient mice were estrous synchronized with a low dose of hormones, including pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) and human chorionic gonadotropin (hCG), at a 47 h interval prior to insemination. An advantage of estrous synchronization was that it permitted the use of the protocol during normal working hours. Females were paired with vasectomized males immediately after artificial insemination, and mating was confirmed by the presence of a copulation plug. Inconsistency in the mating rate with recipients was reported as a difficulty in the procedure. Therefore, alternatives to mating were sought for the induction of pseudopregnancy.
The present study presents a standardized CM technique to increase the efficiency of producing pseudopregnant females. For females in estrus or proestrus, the blunt end of a small plastic rod is inserted vaginally to contact the cervix and is vibrated for 30 s by contact with a trimmer. The procedure is performed on a wire-topped cage. No anesthesia or analgesia is required. The CM technique is convenient for producing pseudopregnant females, which can produce litters after non-surgical artificial insemination without the need for mating with vasectomized males. CM can also be used for the production of pseudopregnant females as recipients of embryo transfer. Specifically, the CM technique can be paired with non-surgical embryo transfer, as described here. Non-surgical methods have been shown to be effective for the embryo transfer of blastocyst stage embryos in mice4,5and rats6,7. As this non-surgical method is an effective alternative to surgical methods, it is considered a 3Rs refinement of the technique. Based on previous research, fecal corticosterone levels, as a measure of stress, indicate that the non-surgical nature of the procedure does not increase stress levels in rodents7,8. The procedures are less technically challenging than surgical embryo transfer and are much faster to perform. As the embryos are transferred to the uterus,&#160;embryos of the correct stage for uterine development must be transferred. For mice, blastocysts are transferred to 2.5 days post coitum (dpc) pseudopregnant recipients.
For the two non-surgical techniques described here, timing of the hormone administration and the CM technique differs. The timing of the CM procedure relative to estrus is important for success, as it replaces natural mating for the production of pseudopregnant recipients. By eliminating the need for vasectomized males to induce pseudopregnancy, this procedure provides 3Rs benefits by both reducing the number of animals required and eliminating the necessity for surgically altered males. The procedure itself is quick (30 s) and does not require anesthesia or analgesia. The technique greatly increases the reliability and predictability of producing pseudopregnant females for assisted reproduction.

تسليط الضوء على المؤلف: تحفيز الحمل الكاذب في إناث الفئران دون الحاجة إلى قطع الأسهر قبل نقل الأجنة غير الجراحي أو التلقيح الاصطناعي  

تحفيز الحمل الكاذب في إناث الفئران دون الحاجة إلى قطع الأسهر قبل نقل الأجنة غير الجراحي أو التلقيح الاصطناعي

Our primary research focus is the development of assisted reproduction techniques that provide refinements and reductions in keeping with the 3Rs of animal experimentation. We have developed non-surgical embryo transfer and non-surgical artificial insemination procedures for mice and a non-surgical embryo transfer procedure for rats. With the addition of the cervical manipulation procedure to provide pseudo pregnant females, we create 3Rs improvements and assisted reproduction in rodents.The protocols described here provide streamlined methods for recovering pups using non-surgical embryo transfer methods and artificial insemination in mice. The cervical manipulation protocol provides a refinement of procedures producing pseudo pregnant female recipients for assisted reproduction techniques. It reduces the number of females needed as pseudo pregnant recipients and it eliminates the need for vasectomized males.The protocols outlined here can be used for strategic vivarium management. The protocols can be used with cryo preservation, in vitro fertilization, rederivation, the production of age match cohorts and the production of genetically modified animals.

نظرا لاستخدام التحفيز الكهربائي9 والصوتي10 لعنق الرحم للحث على الحمل الكاذب في الفئران ، يقدم هذا العمل إجراء ميكانيكيا موحدا يمكن استخدامه في الفئران. يمكن أن يساعد علم الخلايا المهبلية في تحديد الإناث في مراحل مختلفة من الشهوة. لتأكيد الحمل الكاذب عند الإناث ، تم استخدام هذه الطريقة نفسها. أولا ، تمت مقارنة ملامح علم الخلايا للإناث للفئران CD1 و C57Bl / 6 طوال الدورات الشحمية ، أثناء الحمل ، وأثناء الحمل الكاذب الناجم عن التزاوج أو CM. تم أخذ مسحات مهبلية من الإناث وصبغها باستخدام نظام تلطيخ Papanicolaou (انظر جدول المواد). لوحظت الخلايا تحت تكبير 100x مع إضاءة المجال الساطع. تضمنت الخلايا التي لوحظت كريات الدم البيضاء والخلايا الظهارية النواة والخلايا الظهارية غير المنوية. استند تحديد مرحلة الدورة الشحمية إلى النسبة النسبية لكل نوع خلية11,12. يتميز شبق بغلبة الخلايا الظهارية المتقرنة. مع انتهاء الشبق ، يبدأ metestrus ، وتبدأ الكريات البيض في الظهور ، بينما تصبح الخلايا الظهارية المتقرنة أقل وضوحا. يحتوي Diestrus على خلوية معتدلة إلى منخفضة ، مع هيمنة الكريات البيض وبدأت الخلايا الظهارية النواة في الظهور. يتميز Proestrus بفقدان الكريات البيض ، وزيادة في الخلايا الظهارية النواة ، وظهور الخلايا الظهارية المتقرنة. بعد الشبق ، يبدأ الشبق ، وتستمر الدورة.
لتطوير ملف تعريف خط الأساس ، تم تسجيل علم الخلايا المهبلي لدورتين كاملتين على الأقل لكل أنثى (N = 20 ل CD1 ، N = 20 ل C57Bl / 6) قبل التزاوج. اختلفت أطوال الدورات والملامح الفردية بين الفئران. ومع ذلك ، لوحظت الاتجاهات العامة المتوقعة. كان متوسط طول الدورة الشحمية للفئران CD1 و C57Bl / 6 3.8 يوما ، مع نطاق من 3-5 أيام. في اليوم السابق لحدوث التزاوج الطبيعي ، كانت جميع الفئران الإناث في حالة شبق. بعد التزاوج ، تم إجراء علم الخلايا مرة أخرى بعد 1.5 يوم من الجماع (dpc) حتى استؤنف ركوب الدراجات الشهوانية. يوضح الشكل 2 المظهر الخلوي للإناث CD1 و C57Bl / 6 الحوامل الكاذبة المتزاوجة مع الذكور التي تم استئصال الأسهر.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65477/65477fig02.jpg"> الشكل 2: الملف الخلوي لإناث الفئران الكاذبة الحامل. يتم عرض متوسط النسب المئوية لكل نوع من أنواع الخلايا للكريات البيض والخلايا الظهارية النواة والخلايا الظهارية المتقرنة كدالة لأيام ما بعد الجماع (DPC) ل (A) CD1 (N = 20) و (B) C57Bl / 6 (N = 20) الفئران. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65477/65477fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
في هذا العمل ، تم توحيد تقنية CM لزيادة كفاءة إنتاج الإناث الحوامل الزائفة. بالنسبة للإناث في شبق أو شبق ، يتم إدخال الطرف الحاد لقضيب بلاستيكي صغير عن طريق المهبل للاتصال بعنق الرحم ويهتز لمدة 30 ثانية عن طريق ملامسة أداة تشذيب. يتم تنفيذ الإجراء على قفص يعلوه الأسلاك. لا حاجة للتخدير أو التسكين. لتحديد فعالية إجراء CM ، تمت مقارنة علم الخلايا المهبلية لإناث CD1 (N = 20) و C57Bl / 6 (N = 20) الفئران بعد التزاوج مع الذكور الذين تم استئصال الأسهر وبعد CM (المجموع N = 40). كان المظهر الخلوي للحمل الكاذب الناجم عن CM مشابها لملف الحمل الكاذب الناجم عن التزاوج ، كما هو موضح في الشكل 3.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65477/65477fig03.jpg"> الشكل 3: الملف الخلوي لإناث الفئران الحامل الكاذبة بعد التلاعب بعنق الرحم (CM). تظهر النسبة المئوية لكل نوع من أنواع الخلايا للكريات البيض والخلايا الظهارية النواة والخلايا الظهارية المتقرنة كدالة لأيام ما بعد الجماع (DPC) أو أيام ما بعد التلاعب بعنق الرحم (DPCM). يتم عرض متوسط النسب المئوية لنوع الخلية للفئران CD1 و C57Bl / 6 (N = 40) (A) المتزاوجة مع الذكور الذين تم استئصال الأسهر أو (B) بعد CM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65477/65477fig03large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
لتحديد ما إذا كانت تقنية CM كافية لإثبات الحمل للمساعدة على الإنجاب ، تم إجراء CM كجزء من بروتوكول التلقيح الاصطناعي غير الجراحي (NSAI) في إناث CD1. تضمن بروتوكول التلقيح الاصطناعي تزامن شبق الإناث مع جرعة منخفضة من هرمونات PMSG و hCG قبل نقل الحيوانات المنوية. تم إجراء CM قبل نقل الحيوانات المنوية مباشرة. بالنسبة للفئران CD1 ، كانت كفاءة تحريض الحمل الكاذب باستخدام CM للإناث في شبق (N = 76) مع هذه التقنية 83٪. في تجربة مراقبة ، تم توصيل 38٪ فقط من الإناث في شبق من قبل الذكور الذين تم استئصال الأسهر (N = 24). كان لدى متلقي التلقيح الاصطناعي الذين يتلقون معالجة عنق الرحم (N = 76) معدل حمل 72٪ ومتوسط حجم فضلات يبلغ 8.3 جرو. وبالتالي ، فإن تحريض الحمل الكاذب بواسطة CM هو بديل مناسب وفعال للتزاوج مع ذكر قطع القناة المنوية عند إجراء NSAI. أدى استخدام CM لإعداد متلقي CD1 (N = 4) في شبق لنقل الأجنة غير الجراحية للأكياس الأريمية CD1 الطازجة إلى معدل حمل بنسبة 100٪. أسفر نقل 9-15 جنينا عن ثلاثة فضلات صحية بمعدل مواليد 45٪ ومتوسط حجم فضلات يبلغ 6 جراء. وبالمقارنة ، فإن متلقي CD1 (N = 20) الذين تم تزويجهم مع الذكور الذين تم استئصال الأسهر للحث على الحمل الكاذب كان لديهم معدل حمل 80٪ ومعدل مواليد 46٪ بعد نقل 20 كيسا أريما جديدا B6C3F2.
من المحتمل أن تكون نتائج تقنيات الإنجاب المساعدة خاصة بالإجهاد ، حيث تم العثور على متغيرات مثل جرعة وتوقيت إعطاء الهرمونات للإباضة الفائقة تعتمد علىالإجهاد 13. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تؤثر عوامل مثل عمر المتلقي والوزن على رد الفعل على الهرمونات14. في هذا العمل ، عند إجراء إجراء CM للتلقيح الاصطناعي ، تم العثور على الإناث فقط في الشبق المتأخر أو الشبق للاستجابة. بشكل عام ، لزيادة عدد المتلقين المتاحين في السكان ، يتم أولا مزامنة الإناث مع جرعة منخفضة من الهرمونات3. كان تزامن الشبق مع 2.5 وحدة دولية من PMSG و hCG فعالا بنسبة 78٪ لإناث CD1 بعمر 11-14 أسبوعا (N = 27) و 60٪ فعال لإناث C57Bl / 6 بعمر 18-32 أسبوعا (N = 22) في هذا العمل. كانت كفاءة تحريض الحمل الكاذب باستخدام معالجة عنق الرحم على إناث CD1 83٪ للإناث في شبق (N = 76) و 82٪ (N = 100) للإناث C57Bl / 6 في شبق مع هذه التقنية.

Watch this Scientific Journal Video about Inducing Pseudopregnancy in Female Mice Without the Need for Vasectomized Males Prior to Non-Surgical Embryo Transfer or Artificial Insemination at JoVE.com

يمكن لطريقة التلاعب بعنق الرحم المقدمة أن تحفز الحمل الكاذب في الفئران دون الحاجة إلى تربية الإناث مع الذكور الذين تم استئصال الأسهر. مطلوب تحريض الحمل الكاذب لنجاح نقل الأجنة غير الجراحي والتلقيح الاصطناعي غير الجراحي ، وكلاهما مقدم أيضا.

For successfully maintaining pregnancy with embryo transfer or artificial insemination,&#160;female recipient mice must be induced into a pseudopregnant ...

ينصب تركيزنا البحثي الأساسي على تطوير تقنيات الإنجاب المساعدة التي توفر تحسينات وتخفيضات بما يتماشى مع 3Rs للتجارب على الحيوانات. لقد طورنا إجراءات نقل الأجنة غير الجراحية والتلقيح الاصطناعي غير الجراحي للفئران وإجراء نقل الأجنة غير الجراحي للفئران. مع إضافة إجراء التلاعب بعنق الرحم لتوفير الإناث الحوامل الزائفات ، نقوم بإنشاء تحسينات 3Rs والإنجاب المساعد في القوارض.توفر البروتوكولات الموصوفة هنا طرقا مبسطة لاستعادة الجراء باستخدام طرق نقل الأجنة غير الجراحية والتلقيح الاصطناعي في الفئران. يوفر بروتوكول معالجة عنق الرحم صقلا للإجراءات التي تنتج متلقات حوامل زائفات لتقنيات الإنجاب المساعدة. إنه يقلل من عدد الإناث اللازمات كمتلقين حوامل زائفة ويلغي الحاجة إلى الذكور الذين تم استئصال الأسهر.يمكن استخدام البروتوكولات الموضحة هنا للإدارة الاستراتيجية للحظيرة. يمكن استخدام البروتوكولات مع الحفظ بالتبريد ، والتخصيب في المختبر ، وإعادة الاشتقاق ، وإنتاج مجموعات مطابقة العمر وإنتاج الحيوانات المعدلة وراثيا.

inducing-pseudopregnancy-female-mice-without-need-for-vasectomized

Research

JoVE Journal

Biology

Inducing Pseudopregnancy in Female Mice Without the Need for Vasectomized Males Prior to Non-Surgical Embryo Transfer or Artificial Insemination

4.5K Views.  ParaTechs Corporation. ينصب تركيزنا البحثي الأساسي على تطوير تقنيات الإنجاب المساعدة التي توفر تحسينات وتخفيضات بما يتماشى مع 3Rs للتجارب على الحيوانات. لقد طورنا إجراءات نقل الأجنة غير الجراحية والتلقيح الاصطناعي غير الجراحي للفئران وإجراء نقل الأجنة غير الجراحي للفئران. مع إضافة إجراء التلاع?...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: تحفيز الحمل الكاذب في إناث الفئران دون الحاجة إلى قطع الأسهر قبل نقل الأجنة غير الجراحي أو التلقيح الاصطناعي  

For successfully maintaining pregnancy with embryo transfer or artificial insemination,&#160;female recipient mice must be induced into a pseudopregnant state. Female mice are traditionally paired overnight with vasectomized males, and the following morning, the presence of a copulation plug is assessed. To increase the efficiency of producing pseudopregnant females, a cervical manipulation technique has been standardized to be used in combination with non-surgical embryo transfer or artificial insemination techniques in mice. The blunt end of a small plastic rod is inserted vaginally to contact the cervix and is vibrated for 30 s by contact with a trimmer. The procedure is quick and does not require anesthesia or analgesia. This technique increases the reliability and predictability of producing pseudopregnant females and entirely eliminates the requirement for vasectomized males. For CD1 mice, the efficiency of pseudopregnancy induction using cervical manipulation was 83% for females in estrus (N = 76) but only 38% of females in estrus were plugged by vasectomized males (N = 24). Artificial insemination in CD1 mice was performed by estrus synchronization with hormones, cervical manipulation, and the uterine transfer of sperm. Artificial insemination recipients receiving cervical manipulation (N = 76) had a pregnancy rate of 72% and an average litter size of 8.3 pups. This method can also be used to produce pseudopregnant females for non-surgical embryo transfer. Therefore, inducing pseudopregnancy by cervical manipulation is a convenient and efficient alternative to mating with a vasectomized male when performing non-surgical assisted reproduction techniques. Using cervical manipulation provides 3Rs (replacement, reduction, and refinement) benefits for assisted reproduction techniques by reducing the number of animals required and eliminating the necessity for surgically altered males.

The cervical manipulation method presented can induce pseudopregnancy in mice without the need for breeding females with vasectomized males. The induction of pseudopregnancy is required for the success of non-surgical embryo transfer and non-surgical artificial insemination, both of which are also presented.

Cervical Manipulation Procedure for Use with Artificial Insemination in CD1 Mice

To begin cytological evaluation for confirming estra cycle synchronization, gently collect the vaginal cells from the CD1 mouse by rolling the swab against the vaginal wall using a small pre moisten swab smear the collected vaginal cells into a 20 microliter drop of sterile water on a microscope slide and air dry. Under a microscope, use 100X magnification with bright field illumination to evaluate for the presence of cornified epithelial cells. For cervical manipulation, place a recipient female on the top of a cage with a wire rack approximately 0.5 hours before insemination allowing the mouse to grab the cage bar surface grasp near the base of the mouse's tail using the thumb and forefinger and angle the tail upward while stabilizing the animal.Insert the blunt end of a small plastic rod vaginally to contact the cervix and vibrate for 30 seconds by contact with the trimmer. To perform a non-surgical sperm transfer for artificial insemination, place the insemination device on a P200 pipette set to 40 microliters and remove the protective cover. Remove an aliquot of the capacitated sperm sample from the dish placed at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide and transfer it to a 35 millimeter tissue culture dish without oil at 37 degrees Celsius, press the plunger of the pipette to the first stop.Lower the tip of the catheter into the sperm sample and slowly load 40 microliters of the sample into the transfer device. Remove residual oil from the exterior of the insemination device using an absorbent tissue before setting the pipette aside. Next place the recipient female on the wire rack cage top.Hold the female mouse in position by grasping near the base of the tail, using the thumb and forefinger and angle the tail upward while stabilizing the animal. Place the small speculum into the vagina and insert the insemination device catheter into the speculum through the cervix and into the uterus. Once the device hub contacts the speculum dispense the sperm by pressing the pipette plunger to the first stop.Once done, remove the device and speculum.

إجراء التلاعب بعنق الرحم للاستخدام مع التلقيح الاصطناعي في الفئران CD1

Non-Surgical Embryo Transfer Procedure for Use with Cervical Manipulation in CD1 Mice

Begin non-surgical embryo transfer in the CD1 mouse on day 6 by placing a 20 microliter drop of M2 medium onto the lid of a tissue culture dish. Use reflective lighting under a microscope and load 10 to 20 blast assists into the M2 medium drop with a standard embryo handling pipette. Secure the non-surgical embryo transfer device onto a P2 pipette set to 1.8 microliters and remove the protective catheter cover.Press the plunger of the pipette to the first stop and lower the tip of the catheter into the medium before slowly pulling the embryos into the catheter tip of the device. Then remove the catheter from the medium. Next, set the pipette volume to 2.0 microliters to generate a small air bubble at the tip of the catheter.Gently lay the pipette loaded with the embryos near the mouse cage. Place the recipient female on the wire rack cage top and hold the mouse in position by grasping near the base of the tail using the forefinger and the thumb then angle the tail upward while stabilizing the animal. Place a small speculum into the vagina and insert the transfer device catheter into the speculum through the cervix and into the uterus.Once the device hub contacts the speculum dispense the embryos by pressing the pipette plunger to the first stop. Avoid the transfer of extra air into the uterine horn. Remove the device and speculum.