بروتوكولنا يسهل إعداد الفئران المعدلة وراثيا بسهولة وكفاءة، وبسرعة من أجنة الماوس خلية واحدة. يجمع بروتوكولنا بين استخدام أجنة مرحلة الخلايا الواحدة المذابة بالتجميد والإلهاك الكهربائي مما يسمح بالجيل السريع من الفئران المعدلة وراثياً بما في ذلك الفئران المتحولة بكفاءة عالية ومعدلات فسيفساء منخفضة. للتخصيب في المختبر، تبدأ من قبل السوبر الإباضة أربعة أو ثمانية أسابيع من العمر أنثى الفئران C57BL/6J عبر الحقن داخل الصفتون من 7.5 وحدات دولية من gonadotropin مصل الفرس الحوامل تليها حقن داخل الصفتون من 7.5 وحدات دولية من gonadotropin المشيالية الإنسان 48 ساعة في وقت لاحق.
بعد ذلك ، قم بإزالة cauda epididymis من نضج جنسيًا من ثلاثة إلى خمسة أشهر من العمر فئران C57BL/6J واستخدام إبرة تشريح لاستخراج جلطات من الحيوانات المنوية. ثم احتضان الجلطات في قطرة 200 ميكرولتر من HTF في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 1.5 ساعة للقدرة. 16 إلى 18 ساعة بعد حقن gonadotropin المشيمية الإنسان، وجمع مجمعات البويضات cumulus من oviducts واحتضان المجمعات مع 200 ميكرولترات من HTF مغطاة البارافين السائل لمدة لا تزيد على ساعتين حضانة في حاضنة ثقافة الخلية.
في نهاية الحضانة، إضافة واحد إلى خمسة microliters من تعليق الحيوانات المنوية من حدود وسط الحضانة إلى قطرة 200 ميكرولتر من مجمعات البويضات cumulus ووضع الثقافة المشتركة في الحاضنة ثقافة الخلية لمدة ثلاث ساعات. في نهاية الحضانة، وغسل البويضات مع البوتاسيوم تكملة بسيطة التحسين المتوسطة ثلاث مرات لإزالة أي الحيوانات المنوية المتبقية وخلايا الركام واستخدام المجهر المقلوب للتحقق من تشكيل برونويكلير والدرجة من أجنة خلية واحدة. بالنسبة لخلية واحدة من حفظ الأجنة، قم بنقل الأجنة إلى قطرة جديدة 200 ميكرولتر من HTF تكملها مصل الأبقار الجنينية بنسبة 20٪لاحتضان لمدة 10 دقائق في حاضنة ثقافة الخلية.
في نهاية الحضانة، نقل 20 إلى 100 جنين إلى 50 ميكرولتر من محلول سلفوكسيد ثنائي الفينيل مولر واحد ونقل ما يصل إلى 100 جنين في خمسة ميكرولترات من الحل إلى أسفل أنبوب التبريد. تبريد الأجنة لمدة خمس دقائق في درجة الصفر مئوية قبل إضافة 45 ميكرولترات من حل DAP213 أسفل الجانب من الأنبوب. بعد وضع حد لصف، احتفظ بالخلايا لمدة خمس دقائق إضافية عند درجة الصفر قبل تخزين الأنبوب بسرعة في النيتروجين السائل.
إعداد ميكروغرام واحد لكل ميكرولتر من الجيش الملكي النيبالي كريسبر واحد ميكروغرام لكل ميكرولتر من تراكررنا في الحد الأدنى من المصل المتوسطة الأساسية. إضافة ستة ميكرولترات من كل حل RNA إلى 42 ميكرولترات من العازلة خالية من النوى ووضع الخليط في سخان جاف لمدة ثلاث دقائق في 95 درجة مئوية. في نهاية الحضانة، يبرد الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق ويعد ميكروغرام واحد لكل ميكرولتر من بروتين HiFi Cas9 مع انخفاض الحد الأدنى من الوسيلة الأساسية للمصل.
أضف ستة ميكرولترات من محلول HiFi Cas9 المخفف إلى محلول الحمض النووي الريبي ونقل ما يصل إلى 100 جنين مذاب إلى 25 ميكرولترات من محلول الريبونوكليوبروتين المعقد الناتج في شريحة زجاجية كاملة واحدة. ثم احتضان الأجنة لمدة 10 دقائق في 37 درجة مئوية. بالنسبة لكهربية الأجنة، في نهاية الحاضنة، قم بتعيين معلمات electroporator وتحميل الشريحة على electroporator.
وينبغي إجراء الكهربة في غضون ساعة واحدة من ذوبان الأجنة لضمان حدوث تحرير الجينوم قبل أول تكرار للحمض النووي ولمنع الفسيفساء. بعد electroporation، وغسل الأجنة ثلاث مرات مع تعديل كريبس-رينجر bicarbonate العازلة اثنين من المتوسطة في اثنين من يغسل مع قطرة من البوتاسيوم تكمل بسيطة التحسين المتوسطة مغطاة البارافين السائل. ثم احتضان الأجنة في البوتاسيوم الطازجة تكمل بسيطة التحسين المتوسطة في حاضنة ثقافة الخلية بين عشية وضحاها.
يؤدي استخدام طريقة الحفظ بالتبريد المعدلة هذه للأجنة ذات الخلية الواحدة إلى تحسين معدل نمو الأجنة المذابة بالتجميد إلى مرحلة الخلية الثانية. باستخدام هذه الطريقة، كانت جميع الفئران التي تم إنشاؤها في هذه التجربة التمثيلية المهق مع فأر فسيفساء واحد فقط يحمل معطفًا مع بقع بيضاء وسوداء. هنا يمكن ملاحظة قسم تمثيلي من الكروم من فأرة المهق التي تحتوي على أليل M1.
كما هو موضح ، يمكن للبروتوكول توليد خروج المغلوب وضرب في الفئران مع كفاءة عالية ومعدلات فسيفساء منخفضة. في الواقع ، فإن ذرية F1 من نسل homozygous F0 هي heterozygous تحتوي على متحولة واحدة و allele نوع واحد من نوع البرية مع عدم وجود طفرات متباينة. تذكر أن البويضة المخصبة هشة في مرحلة الخلية الواحدة.
إضافة مصل الأبقار الجنين يعزز الجنين. ومع ذلك، يجب معالجتها بعناية في كل خطوة. ويمكن لهذه الطريقة أن تسهم في تحليل وظيفة الجينات والبحوث في الأمراض البشرية من خلال تسهيل إنتاج أسرع وأكثر كفاءة للفئران المعدلة وراثيا.
