يمكن أن يحل حقن المنوية المستديرة مشكلة التكاثر لدى بعض مرضى فقد النطاف غير الانسدادي ، لكن كفاءته منخفضة للغاية. استخدمت دراستنا الفئران كنماذج للبحث عن طرق لتحسين كفاءة التطور الجنيني ل ROSI في الفأر. تشير الإحصائيات غير المكتملة إلى أنه تم ولادة أقل من 200 جنين بشري تم تصورهم بعدوى العكسجين على مستوى العالم.
حدثت نقطة تحول في فهم إمكانات تقنية ROSI في عام 2015 ، عندما أبلغ تاناكا وزملاؤه عن الولادات الناجحة ل 14 جنينا من خلال تقنية ROSI ، مما غرس ثقة متجددة في تطبيقها السريري وجدوىها. ينصب التركيز الحالي لأبحاث ROSI على التشوهات في التعديلات اللاجينية والتنشيط غير الطبيعي بمساعدة البويضات ، في حين أن تحديد بيانات المنوية المستديرة بدقة يمثل تحديا أيضا. كفاءة تطوير أجنة ROSI في الفأر عالية جدا بالفعل في مختبرنا ، وهو مشابه للمختبرات الأخرى.
ومع ذلك ، فإن كفاءة تطوير غير القوارض ، مثل البشر ، لا تزال جديدة جدا. في المستقبل ، سنركز على تحسين كفاءة تطوير غير القوارض. للبدء ، قم بحقن أنثى فأرة عمرها ستة إلى ثمانية أسابيع داخل الصفاق مع 7.5 وحدة دولية لكل من موجهة الغدد التناسلية في مصل الفرس الحامل في الساعة 5:00 مساء وموجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية بعد 48 ساعة.
تأكد من عدم حدوث أي اتصال مع ذكور الفئران بعد الحقن. بعد القتل الرحيم للفأر ، افتح تجويف البطن. باستخدام المقص ، اقطع قناتي فالوب بالقرب من كلا المبيضين وضعهما في مخزن M2 مسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية.
تحت هدف 10X من المجهر المستقيم ، حدد موقع الجزء الشفاف والموسع من قناة فالوب. ثم ، باستخدام حقنة سعة مليلتر واحد ، قم بتأمين قناة فالوب ، وقطع الجزء المتضخم ، وجمع المجمعات الركامية الإكليلية للبويضة. لإزالة الخلايا الحبيبية ، ضع مركب البويضة في محلول تشغيل M2 مسخن مسبقا يحتوي على 0.1٪ هيالورونيداز ، وانفخ برفق من خلال ماصة فموية.
انقلي البويضة بشكل متسلسل إلى قطرات KSOMaa لشطفها ثلاث مرات ، وضعيها في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. للبدء ، احصل على فأر ذكر C57BL / 6 يبلغ من العمر ثمانية إلى 10 أسابيع. افتح تجويف البطن واستئصال البربخ برفق بالقرب من الخصية بالمقص.
ضع الطبق الذي يحتوي على البربخ في وسط M2 تحت هدف 10X من المجهر المستقيم. وباستخدام حقنة سعة مليلتر واحد ، قم باستئصال البربخ برفق للسماح للحيوانات المنوية بالتدفق. قم بسحب المنوية المتدفقة في معلق في قاع أنبوب يحتوي على 0.5 مل من المخزن المؤقت M2.
لعزل المنوية المستديرة ، انقل الخصية التشريح إلى المخزن المؤقت M2. باستخدام حقنة سعة مليلتر واحد ، قم بقطع الغشاء الأبيض برفق تحت المجهر ، ثم اضغط على الأنابيب المنوية الملتوية واستئصالها. بعد استخراج التعليق ، قم بالتصفية بمنخل شبكي 400 وجهاز طرد مركزي للخلايا المفلترة.
تخلص من المادة الطافية واحتضان الخلايا ب 200 ميكرولتر من Hoechst 33342 عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ضع أنبوب قياس الخلايا الذي يحتوي على خلايا ملطخة في مقياس التدفق الخلوي. بعد ضبط الجهد ، حدد عدد الخلايا بناء على التشتت الأمامي والجانبي.
ثم قم بإزالة التصاقات الخلية وفقا للتشتت الأمامي وعرض نبضة الزناد. باستخدام قناتين للكشف تحت ليزر بطول موجي 355 نانومتر ، قم بفرز المنوية المستديرة وتخزينها عند أربع درجات مئوية. تحت المجهر ، كان قطر المنوية المستديرة للفأر حوالي 10 ميكرومتر وأظهرت بنية نواة تشبه النتوء في المنتصف.
للبدء ، احصل على البويضات المنوية المستديرة من الفئران. ثم قم بإعداد إبر التثبيت والحقن بأقطار مناسبة. ضع البويضات في قطرات M2 سعة 10 ميكرولتر مع أو بدون السيتوكالاسين B لتليين الأمشاج وتخزينها.
بعد ذلك ، ضع قطرات المنوية المستديرة M2 وقم بتركيب طبق التشغيل على طاولة العمليات المجهرية. اضبط موضع الحقن وقم بإصلاح الإبرة. باستخدام بولي فينيل بيروليدون ، أو PVP ، قم بترطيب وتنظيف إبرة الحقن.
بعد ذلك ، استخرج المنوية المستديرة في إبرة الحقن. قم بتدوير البويضة بإبرة التثبيت لتوجيه الجسم القطبي للبويضات في موضع الساعة 12. ثم ضع إبرة الحقن بعناية في موضع الساعة الثالثة على البويضة.
باستخدام جهاز PiezoXpert ، قم بإنشاء ثقب في البويضات المنطقية الشفافة. بعد ذلك ، قم بدفع إبرة الحقن برفق إلى البويضة أفقيا وتمزق غشاء البويضة. حقن المنوية المستديرة تدريجيا في سيتوبلازم البويضة.
اسحب إبرة الحقن واستنشق كمية صغيرة من غشاء البويضات بالقرب من الفتحة لإغلاقها. لحقن المنوية داخل الهيولى ، ضع المنوية على مدرج PVP. شفط المنوية من الذيل ووضع رقبتها عند فم إبرة الحقن.
ضع بيزو لفصل رأس المنوية عن الذيل. بعد ذلك ، قم بحقن المنوية في البويضة كما هو موضح سابقا ، بإبرة حقن بقطر تسعة إلى 10 ميكرومترات. لتنشيط البويضات بمساعدة ، ضع البويضات في 20 ميكرولتر قطرة من وسط الكالسيوم ووسط CZB الخالي من المغنيسيوم الذي يحتوي على سداسي هيدرات كلوريد السترونتيوم.
ثم قم بنقلها إلى وسط زراعة KSOMaa للزراعة. في الوقت نفسه ، قم بإنشاء مجموعة لتنشيط التوالد العذري دون حقن المنوية المستديرة أو المنوية للدراسات الجنينية. بعد التفعيل، يتم نقلها إلى وسط زراعة KSOMaa للزراعة.
أظهرت الأجنة المستديرة المحقونة بالحيوانات المنوية كفاءة نمو منخفضة مقارنة بالأجنة المحقونة داخل الهيولى.
