وقد تم تمويل هذا العمل من قبل ويلكوم WT091939MA منحة الثقة. ويدعم آلان Filloux من قبل الجمعية الملكية.

1. سلالات بكتيرية والثقافات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مهندس المتلقي كولاي الخلية (بري، P) عن طريق تحويل (باستخدام معيار CaCl 2 العلاج أو الصعق الكهربائي) 15 E. القولونية الخلايا DH5α مع البلازميد السماح للتكامل A-من الجين lacZ (الجدول 1). لوحة الخلايا على لوحات أجار تحولت لوريا Bertani-(LBA، أجار 1.5٪) تحتوي على 5-برومو-4-كلورو indolyl-β-D-galactopyranoside (X-GAL) في 40 ملغ / مل تركيز النهائي والمضادات الحيوية المناسبة. احتضان عند 37 درجة مئوية خلال الليل وصباح اليوم التالي لتحديد transformants الأزرق (انظر § 1.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الخلايا المتبرع الزنجارية الزائفة التي هي T6SS النشطة (D +) أو غير نشط T6SS-(D-) (الجدول 1) على LBA بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. في المثال المقدمة هنا استخدمنا P. تكنولوجيات الطاقة المتجددة الزنجارية توتر امتلاكوH1-T6SS بالموقع جوهري ل16 و متحولة إسوية الجينات مع حذف الكتلة الجينات H1-T6SS (الجدول 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي، وإعداد ثقافة السائل في قارورة بين عشية وضحاها الغازية، فحقن استنساخ مشرق الزرقاء بين E. transformants القولونية (P) من لوحة وصفها في § 1.1، في 5 مل من مرق الصويا تريبسيني (TSB) تستكمل مع المضادات الحيوية المناسبة. تنمو تحت التحريض في 37 ° C. المضي قدما على قدم المساواة مع واحد من مستعمرة (D +) من و(D -) من لوحة وصفها في § 1.2. </li></ol> 2. المنافسة الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد لوحات LBA للتجربة اليوم التالي. تأكد من يتم تجفيفها بشكل صحيح هذه اللوحات (إما بالقرب من الموقد بنسن أو في مجلس الوزراء تدفق الصفحي). إعداد &quot;الفحص المدخلات&quot; (A-الإدخال) لوحة لسلالات (D +)، (D -)، و (P </strong&gt;). يعد &quot;مصلحة دمغ المصوغات والمخرجات&quot; (A-الإخراج) لوحة لسلالات (D - + P) و (D + + P). تقسيم وتسمية لوحات وفقا لذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد النمو بين عشية وضحاها (انظر § 1.3)، قياس الكثافة الضوئية (OD 600nm) من مدخلات ثقافة البكتيرية (D -، D + P و) وحساب حجم المطلوبة للحصول على ما يعادل كثافة الخلية إلى 1 وحدة OD 600Nm من كل سلالة . كل ثقافة &quot;الإدخال&quot; خلية (D -، D + P و) في البداية يتم جمع 1،5 العقيمة في أنابيب إيبندورف مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي العينات البكتيرية في 13000 دورة في الدقيقة خلال 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق الكريات من D -، D +، وP الثقافات، في 100 ميكرولتر من TSB جديدة من خلال طيف وpipetting تطعيم 10 مل من كل تقابلsponding سلالة كبقعة واحدة على لوحة &quot;A-المدخلات&quot; (أعد § 2.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم في &quot;A-الإخراج&quot; لوحة (أعد § 2.1). على نحو أدق، مزيج بلطف 30 ميكرولتر من (+ D) مع 30 ميكرولتر (P) و 30 ميكرولتر من - مع 30 مل (P) في اثنين من أنابيب إيبندورف منفصلة (لاحظ أن الثقافات المستخدمة هي تلك التي وصفها في § 2.4) (D) . تطعيم 20 ميكرولتر من مزيج (D + / P) و (D - / P). كبقع الفردية على لوحة &quot;A-الإخراج&quot; السماح للبقع لتجف في مكان قريب ناسخ بنسن ووضع لوحة في حاضنة في C ° 37 لفترة مناسبة من الوقت خلالها قتل البكتيريا يحدث. في حالة P. الزنجارية، لوحظ حدوث قتل البكتيريا كفاءة الموارد البشرية بعد مرور فترة الحضانة 5 عند المقارنة بين T6SS نشطة مع سلالة معيبة T6SS. </li></ol> 3. مراقبة نوعية رانه قتل البكتيريا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد لوحات LBA يحتوي على 40 ميكروغرام / مل X-غال لقراءات من الفحص. وسوف يطلق على لوحات &quot;إدخال قراءات&quot; أو &quot;R-المدخلات&quot; على الفور البكتيريا المعزولة أو &quot;قراءات الناتج&quot; أو &quot;R-الإخراج&quot; على الفور الثقافات البكتيرية المختلطة وبالتالي قراءة أداء القتل. هذه اللوحات تحتاج أيضا إلى أن تجفف بشكل صحيح. تقسيم لوحة في أربعة أجزاء متساوية على ظهرها والحواشي هذه الأجزاء 0، 10 -1، و10 -2 10 -3، ووصف التخفيفات للثقافة البكتيرية على الفور على لوحات أجار (انظر § 3.3). وسوف تسمح التخفيف تقييم شبه الكمي للنسبة البكتيريا الزرقاء / أبيض داخل نفس المكان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع مع حلقة عقيمة البقع البكتيرية الفردية من لوحة &quot;A المدخلات و&quot; (انظر § 2.4) و &quot;A-الإخراج&quot; لوحة (انظر § 2.5) و resuspend كل بقعة في أنابيب إيبندورف متميزة 1،5 مل يحتوي على 1 مل من TSB. ضع في مبنى شاكر إيبندورف خلال 30 دقيقة ل resuspend بكفاءةالبكتيريا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد سلسلة من 5 مرات أنابيب إيبندورف 3 تحتوي على 900 ميكرولتر من TSB والمضي قدما لكل بقعة معلق على التخفيفات مسلسل 10 أضعاف ما يصل الى 10 -3. تأكد من تغيير ماصة نصائح ودوامة 5 ثوان بين كل خطوة التخفيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتقل إلى اكتشاف من التخفيفات الخاص البكتيرية أعد § 3.3 على لوحات LBA جيدا المجففة يحتوي على 40 ميكروغرام / مل X-غال من خلال البدء مع المخفف أكثر إلى تعليق غير مخفف، مما يجعل هذه و&quot;R-المدخلات&quot; لوحات لA &quot;في المدخلات &quot;النقاط و&quot; R-الإخراج &quot;لوحات&quot; النقاط &quot;A-الإخراج (الشكل 2). دوامة لفترة وجيزة كل أنبوب قبل الانتقال إلى اكتشاف للحفاظ على التعليق متجانسة البكتيرية. لاستنساخ النتائج، سبوت 20 ميكرولتر من ثلاث نسخ ضمن رباعي (الشكل 2). جفاف النسبي لوحة الخاص بك هو المهم في هذه المرحلة منذ البقع تحتاج للبقاء فصل على حدة على لوحة وليس الانزلاق نحو بعضها البعض. تقدير كمي للمقايسة المنافسة الممكن أيضا في هذه المرحلة من التجربة. بعد الخطوة 3.3، نشر 100 ميكرولتر من 10 -3 التخفيف على لوحات LBA يحتوي على 40 ميكروغرام / مل X-غال. لاستنساخ النتائج، بإجراء الطلاء في ثلاث نسخ لكل بقعة من لوحة &quot;A-الإخراج&quot;. وضع لوحات في التخفيف 37 ° C حاضنة ليلة وضحاها (الموافق الحضانة ساعة 16). انتقل إلى عد المستعمرات الزرقاء (P الخلايا التي بقيت على قيد الحياة). وتظهر النتائج التي تم الحصول عليها نموذجية بعد 5 ساعة من المنافسة في الشكل 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك مفتوحا لوحة (لا غطاء) داخل منطقة معقمة للسماح للامتصاص فائض السائل في داخل كل بقعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة في الحاضنة 37 درجة ° يلة وضحاها. وخلال هذا الوقت الحضانة، وقتل ما زالت تحدث في مزيج (D + / P) لأن كلا السلالات لا تزال على اتصال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط صورةأو مسح لوحات الخاص لتحليل الإخراج (الشكل 2). حيث لا تزال بقع زرقاء إلى حد كبير إلى أن E. لم القولونية قتل على يد P. الزنجارية. هذا هو الحال عندما E. يتم خلط القولونية مع P. T6SS-معيبة سلالة الزنجارية (D) (الشكل 2، لوحة في أسفل اليمين). </li></ol>

<ol>
	<li>Filloux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterial+type+VI+secretion+machine:+yet+another+player+for+protein+transport+across+membranes.">The bacterial type VI secretion machine: yet another player for protein transport across membranes.</a> Microbiology. 154 (6), 1570 (2008).</li><li>Cascales, E., Cambillau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+of+type+VI+secretion+systems.">Structural biology of type VI secretion systems.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 367 (1592), 1102 (2012).</li><li>Leiman, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+the+T4+tail+and+tail+fibers.">Morphogenesis of the T4 tail and tail fibers.</a> Virol. J. 7, 355 (2010).</li><li>Ballister, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+self-assembly+of+tailorable+nanotubes+from+a+simple+protein+building+block.">In vitro self-assembly of tailorable nanotubes from a simple protein building block.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (10), 3733 (2008).</li><li>Leiman, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+VI+secretion+apparatus+and+phage+tail-associated+protein+complexes+share+a+common+evolutionary+origin.">Type VI secretion apparatus and phage tail-associated protein complexes share a common evolutionary origin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (11), 4154 (2009).</li><li>Pukatzki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+VI+secretion+system+translocates+a+phage+tail+spike-like+protein+into+target+cells+where+it+cross-links+actin.">Type VI secretion system translocates a phage tail spike-like protein into target cells where it cross-links actin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (39), 15508 (2007).</li><li>Ma, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+a+Vibrio+cholerae+type+VI+secretion+effector+requires+bacterial+endocytosis+by+host+cells.">Translocation of a Vibrio cholerae type VI secretion effector requires bacterial endocytosis by host cells.</a> Cell Host Microbe. 5 (3), 234 (2009).</li><li>Hood, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+type+VI+secretion+system+of+Pseudomonas+aeruginosa+targets+a+toxin+to+bacteria.">A type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa targets a toxin to bacteria.</a> Cell Host Microbe. 7 (1), 25 (2010).</li><li>Russell, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+VI+secretion+delivers+bacteriolytic+effectors+to+target+cells.">Type VI secretion delivers bacteriolytic effectors to target cells.</a> Nature. 475 (7356), 343 (2011).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+type+VI+secretion+effector+recognition+by+a+cognate+immunity+protein.">Structural basis for type VI secretion effector recognition by a cognate immunity protein.</a> PLoS Pathog. 8 (4), e1002613 (2012).</li><li>Zheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+anti-amoebae+and+anti-bacterial+activities+of+the+type+VI+secretion+system+in+Vibrio+cholerae.">Genetic analysis of anti-amoebae and anti-bacterial activities of the type VI secretion system in Vibrio cholerae.</a> PLoS One. 6 (8), (2011).</li><li>Schwarz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burkholderia+type+VI+secretion+systems+have+distinct+roles+in+eukaryotic+and+bacterial+cell+interactions.">Burkholderia type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions.</a> PLoS Pathog. 6 (8), e23876 (2010).</li><li>Murdoch, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+opportunistic+pathogen+Serratia+marcescens+utilizes+type+VI+secretion+to+target+bacterial+competitors.">The opportunistic pathogen Serratia marcescens utilizes type VI secretion to target bacterial competitors.</a> J. Bacteriol. 193 (21), 6057 (2011).</li><li>Boyer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+bacterial+type+VI+secretion+system+by+a+genome+wide+in+silico+analysis:+what+can+be+learned+from+available+microbial+genomic+resources?.">Dissecting the bacterial type VI secretion system by a genome wide in silico analysis: what can be learned from available microbial genomic resources?.</a> BMC Genomics. 10, 104 (2009).</li><li>Maniatis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: A Laboratory Manual. , (1982).</li><li>Mougous, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+virulence+locus+of+Pseudomonas+aeruginosa+encodes+a+protein+secretion+apparatus.">A virulence locus of Pseudomonas aeruginosa encodes a protein secretion apparatus.</a> Science. 312 (5779), 1526 (2006).</li><li>Records, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+type+VI+secretion+system:+a+multipurpose+delivery+system+with+a+phage-like+machinery.">The type VI secretion system: a multipurpose delivery system with a phage-like machinery.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 24 (7), 751 (2011).</li><li>Hachani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+VI+secretion+system+in+Pseudomonas+aeruginosa:+secretion+and+multimerization+of+VgrG+proteins.">Type VI secretion system in Pseudomonas aeruginosa: secretion and multimerization of VgrG proteins.</a> J. Biol. Chem. 286 (14), 12317 (2011).</li></ol>

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

الأسلوب في هذه المقالة يسمح الملاحظة البصرية للنشاط جراثيم T6SS بوساطة / الجراثيم. يتم تنفيذ الفحص على سطح لوحة أجار. ولقد ثبت في وقت سابق ان T6SS التي تعتمد على فحص أداء قتل مع مختلطة ثقافة البكتيرية السائلة ليست فعالة، من المحتمل بسبب عدم وجود اتصال مستمر بين البكتيريا السابقتين 8. ويعتقد أن T6SS للعمل مع آلية شبيهة لتلك المستخدمة من قبل البكتيريا لحقن الحمض النووي في الخلايا المستهدفة 17. في الثقافة السائلة، وهيكل أنبوب يشبه من T6SS قد كسر بسهولة أكبر، ويمكن أن تضيع بين البكتيرية الاتصال، لا يتم تسليم والسموم بكفاءة. من حيث أوقات الحضانة، و5 ساعات الأولي من الاتصال التي وصفنا بين سلالة المانحة والقتيل كافية لمراقبة قتل البكتيريا P. بين الزنجارية وE. القولونية، كما هو موضح في الشكل (3) </strong&gt;. ومع ذلك، فإنه من المستحسن لضبط الوقت عن طريق إجراء الحضانة الحركية من أجل تحسين الظروف التجريبية. منذ هذا الأسلوب هو أسلوب يستند إلى لون ويمكن أن تتضرر النتائج التي خرج تصبغ في سلالة المانحة. على سبيل المثال، في حالة P. الزنجارية، وبعض سلالات إنتاج مستويات عالية من المواد الملونة الملونة مثل بايوسيانين وpyoverdine، والتي يمكن أن تتداخل مع قراءات الفحص، مما يجعل تمييز من الصعب نسبيا فريسة. ويمكن استخدام مولد اللون β-الأخرى غالاكتوزيداز ركائز، مثل غال غال أرجواني أو أحمر، بدلا من X-غال (الجدول 1). يمكن للفحص المنافسة الاستفادة من الجينات الأخرى لمراسل قراءات. على سبيل المثال، كما تم فحص مماثلة أجريت باستخدام الفلورية الخضراء البروتين المسمى يفترس 12. مقايسة لدينا، في حين لا الكمية، ويعطي مؤشرا جيداالنشاط T6SS لأنها مبنية على بقاء أو قتل فريسة مراسل. يقدم هذه التقنية ميزة كونها سهلة ومريحة لتقييم نشاط مبيد للجراثيم / الجراثيم من T6SSs من أي نوع من الأنواع البكتيرية. وقد أبلغ حتى الآن، وقد تبين أن نشاط T6SS ضد البكتيريا سالبة الجرام وليس مثال واضح على البكتيريا إيجابية الجرام T6SS حساسة 12 حتى الان. ومن الواضح أيضا أن عدم التوافق في الثقافة من الأنواع البكتيرية المختلفة لاختبار (مثل النمو درجة الحرارة، والأوكسجين، وسائط معين) هو أخذها بعين الاعتبار. ويمكن أيضا أن تستخدم لدينا فحص لتقييم أي من مكونات ضرورية للغاية T6SS منذ آثار مادة سامة حتى يفرز قد تكون كافية لقتل الفريسة. يمكن أن النشاط حتى ضعف واضح T6SS ثم يمكن الكشف عنها بواسطة الفحص لدينا بالمقارنة مع مستوى إفراز الإجراء T6SS التي تعتمد على استخدام اختبار لطخة الثقافة طاف والغربيةالتحليل. ومع ذلك، لا تزال هناك حاجة لتشكيل مستعمرة السليم حدة (CFU) عد لالكمي الدقيق لهذا النشاط T6SS.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف / المواد </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> P. الزنجارية PAKΔ تكنولوجيات الطاقة المتجددة (D +) (T6SS بالموقع) </td><td> مختبر سلالة </td><td></td><td> وصف مرجع في 16 </td></tr><tr><td> P. الزنجارية PAKΔ تكنولوجيات الطاقة المتجددة Δ H1-T6SS (D -) (T6SS غير نشط) </td><td> هذه الدراسة </td><td></td><td> تم حذف الكتلة H1-T6SS (تشمل الجينات PA0070 PA0095 ل) عن طريق تبادل أليلية بعد الإجراء الموضح في المرجع 18. تم إنشاء جزء mutator مع المجموعة التالية من الاشعال: الاشعال وحتى جزء: 5&#39;-ATGGTCAACGACATGGAGCTGGAG-3 &quot;، و 5&#39;CGAGGCCGATCAGGCCTTCAGAACTGA-3 &quot;. الاشعال جزء أسفل: 5&#39;-TCAGGCCTTCAGAACTGAAGCGGCGCA-3 &#39;، <pre style=";text-align:right;direction:rtl"> 5&#39;-GGTGGCGTTCAACAGTTCCATGTC-3 &#39; </pre></td></tr><tr><td> القولونية DH5α </td><td> إينفيتروجن </td><td> 18258-012 </td><td> F-φ80 أمريكا اللاتينية والكاريبي ZΔM15 Δ (LAC-ARG ZYA F) U169 نهاية A1 A1 تفصيل HSD R17 (ص ك -، م ك +) A بو سوب E44-λ ثي -1 جير A96 الرطوبة A1 </td></tr><tr><td> pBluescript II SK (+) </td><td> اجيلنت </td><td> 212205 </td><td> هذا المتجه يعبر عن الببتيد α β-غالاكتوزيداز من استخدامها لتكامل-α. </td></tr><tr><td> X-غال </td><td> إينفيتروجن </td><td> 15520-018 </td><td> استخدام في 40 ميكروغرام / مل </td></tr><tr><td> لوريا Bertani أجار </td><td> ميرك المواد الكيميائية </td><td> 1.10283.0500 </td><td></td></tr><tr><td> TSB (الكازين مرق فول الصويا) </td><td> OXOID </td><td> CM109 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> دوامة شاكر عبقرية 3 </td><td> IKA </td><td> 3340000 </td><td></td></tr><tr><td> الماسح الضوئي </td><td> EPSON </td><td> V700 </td><td></td></tr><tr><td> الطيف </td><td> WPA Biowave </td><td> CO8000 متر خلية الكثافة </td><td></td></tr><tr><td> أرجواني غال </td><td> Bioworld </td><td> 30350001-1 (715241) </td><td></td></tr><tr><td> الحمراء غال </td><td> البحث العضوية </td><td> 1364c </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> الجدول 1. الإجهاد، البلازميد والمادية وكاشف المستخدمة. </td></tr></tbody></table>

a visual assay to monitor t6ss-mediated bacterial competition

نظم إفراز نوع السادس (T6SSs) هي هذه التقنية الجزيئية تسمح الجراثيم سلبية الغرام لنقل وحقن البروتينات إلى مجموعة واسعة من 1،2 الخلايا المستهدفة. ويتألف من المكونات الأساسية T6SS 13 و يعرض أوجه التشابه الهيكلي مع أنبوب الذيل من البكتيريا 3. فإن الفيروس يستخدم أنبوب وجهاز ثقب لاختراق الغلاف خلية من البكتيريا المستهدفة وحقن الحمض النووي. يقترح أن T6SS هو جهاز عاثية مقلوب خلق مسار معين في المغلف الخلية البكتيرية لدفع المستجيبات والسموم إلى السطح. يمكن أن تؤخذ في عملية أخرى، ويمكن الجهاز T6SS خرم الخلايا الأخرى التي البكتيريا على اتصال، وبالتالي ضخ والمستجيبات في هذه الأهداف. يتم إجراء أنبوب الذيل وأجزاء الجهاز تعطيب من T6SS مع المندوبية والبروتينات VgrG، على التوالي 4،5. وقد أظهرت براعة من خلال ليالي T6SStudies باستخدام مسببات الأمراض البكتيرية المختلفة. يمكن للالكوليرا الضمة T6SS يعيد الهيكل الخلوي للخلايا حقيقية النواة المضيف عن طريق حقن و&quot;تطورت&quot; VgrG يحمل الأكتين C-محطة عبر ربط المجال 6،7. وقد تم توثيق مؤخرا ضرب مثالا آخر باستخدام الزائفة الزنجارية التي هي قادرة على استهداف وقتل البكتيريا بطريقة T6SS التي تعتمد على، وتعزيز ذلك بإنشاء البكتيريا في بيئات محددة والميكروبية بيئة تنافسية 8،9،10. في الحالة الأخيرة، تم تحديد ثلاث T6SS-يفرز البروتينات، وهي Tse1، وTse2 Tse3 والسموم حقن البكتيريا في الهدف (الشكل 1). محمي الخلية المانحة من تأثير ضار من هذه المستجيبات عبر آلية مكافحة السم، بوساطة بروتينات المناعة Tsi1، وTsi2 Tsi3 8،9،10. ويمكن رصد هذا النشاط البكتيري عند T6SS-يتقن البكتيريا شارك في زراعتها على قشهيد السطوح في منافسة مع الأنواع البكتيرية الأخرى أو مع T6SS خاملا البكتيريا من نفس النوع 8،11،12،13. وأكد أن البيانات المتاحة نهج العددية للفحص الجرثومي المنافسة، بما في ذلك عد CFU تستغرق وقتا طويلا أن تعتمد إلى حد كبير على واضعي المضادات الحيوية. في حالة السلالات المقاومة للمضادات الحيوية مثل P. الزنجارية، يمكن لهذه الأساليب أن يكون غير لائق. وعلاوة على ذلك، مع تحديد مواضع مختلفة نحو 200 T6SS في أكثر من 100 الجينوم البكتيري 14، أداة فحص ملاءمة هو مرغوب فيه للغاية. وضعنا مقايسة التي هي سهلة الاستخدام ويتطلب معيار المواد المختبرية والكواشف. الأسلوب يوفر تقنية سريعة ونوعية لمراقبة نشاط T6SS التي تعتمد على جراثيم / الجراثيم باستخدام سلالة مراسل بوصفه ضحية (في هذه الحالة كولاي DH5α) السماح لتكامل-lacZ من الجين. وعموما، هذا الأسلوب هو العنبالتحالف الدولي للموئل ويسمح التحديد السريع للT6SS الظواهر ذات الصلة على لوحات أجار. يمكن تكييفها هذا البروتوكول التجريبي لسلالات أخرى أو الأنواع البكتيرية مع مراعاة الظروف الخاصة مثل وسائط النمو، درجة الحرارة أو وقت الاتصال.

وتظهر نتائج نموذجية في الشكل 1 مع سلالات والكواشف وصفها في الجدول 1. وتفحص لوحات معروضة في هذا الرقم بعد الحضانة بين عشية وضحاها. و&quot;قراءات المدخلات&quot; لوحات تبين وجود نمط التخفيف المتسلسل للسلالات المستخدمة في هذا الاختبار. كما هو متوقع، وE. القولونية فريسة البقع (P) overexpressing الجين الأزرق lacZ تظهر على وسائل الإعلام تستكمل مع X-غال، في حين أن الجهات المانحة P. سلالات الزنجارية (D +، T6SS بالموقع) و (D -، غير نشط T6SS) لا تزال بيضاء. و&quot;قراءات والمخرجات&quot; لوحات التي تم رصدها المزيج بين الفريسة وسلالة T6SS النشطة (D + / P) تظهر اختفاء الزرقاء فريسة مما يشير إلى أنه قد قتل. هذا يدل على قدرة المانحين لتكومبيتي الفريسة. استمرار اللون الأزرق على (D - / P) لوحة يدل على عدم قدرة متبرع T6SS غير نشط لقتل الفريسة الأزرق. <img src="/files/ftp_upload/50103/50103fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1. قتل E. القولونية من T6SS-يتقن P. الزنجارية. P. الزنجارية يضخ السموم في E. القولونية الخلية المستهدفة بطريقة T6SS التي تعتمد على (كما هو موضح بواسطة السهم الأبيض). يتم حقن السموم اثنين Tse1 وTse3 (البرتقال والدوائر الحمراء) في E. الجبلة المحيطية القولونية وتدهور ببتيدوغليكان 9. يتم حقن السم Tse2 (دائرة صفراء) في E. القولونية السيتوبلازم ولها نشاط جراثيم 8،10. العمل المشترك من السموم يقتل الخلايا المستهدفة (ميض البرق والجمجمة). ويمكن الكشف عن بقاء الخلايا المستهدفة من خلال مراقبة نشاط غالاكتوزيداز β-المنتجة (انظر أيضا الشكل 2). P. لمحمي ضد النشاط eruginosa من السموم من البروتينات الحصانة Tsi1، وTsi2 Tsi3 (البرتقال والساحات الصفراء والحمراء على التوالي) 8،9،10. <img src="/files/ftp_upload/50103/50103fig2.jpg" alt="الشكل 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50103/50103fig2highres.jpg"/> الشكل 2. أجار مقايسة لوحة لرصد T6SS التي تعتمد على قتل البكتيريا في هذا الرقم وتظهر على الجزء العلوي من &quot;قراءات المدخلات&quot; لوحات تتكون من التخفيفات التسلسلي للD -، D +، P المدخلات والخلايا. إدخال الخلايا P زرقاء نظرا لتكامل-α من الجين lacZ والمنتجة على هذا النحو β-غالاكتوزيداز أن يشق X-غال. في الجزء السفلي يظهر &quot;قراءات والمخرجات&quot; لوحات تتكون من التخفيفات المسلسل من مزيج بين البكتيريا النشطة (P + / D) </strاونج&gt;، أو غير نشطة (D - / P)، T6SS المانحة P. سلالة الزنجارية مع E. القولونية الفريسة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50103/50103fig2large.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية</a> . <img src="/files/ftp_upload/50103/50103fig3.jpg" alt="الشكل 3"/> الشكل 3. القياس الكمي لقتل E. القولونية بواسطة P. الزنجارية بعد مرور فترة الحضانة ساعة 5. يعرض الرسم البياني عد من CFU E. وصف القولونية في الخطوة 3.4. عرض النتائج هنا تظهر الفرق 3-أضعاف بين T6SS + وT6SS سلالات، مما يشير إلى أن معظم جرائم القتل يجري خلال 5 ساعات الأولي من الاتصال.

Watch this Scientific Journal Video about A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition at JoVE.com

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

نحن تصف مقايسة لمراقبة النوعية البكتيرية المنافسة بوساطة<em&gt; الزائفة الزنجارية</em&gt; إفراز VI نظام نوع (T6SS). الفحص يعتمد على بقاء / قتل الخلايا القولونية القولونية الهدف يحمل<em&gt; lacZ</em&gt; مراسل-. هذه التقنية هو قابل للتعديل لتقييم نشاط مبيد للجراثيم / الجراثيم من T6SS-يتقن الكائنات الحية الدقيقة.

A الفحص المرئي لمراقبة T6SS بوساطة المسابقة الجرثومي

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

a-visual-assay-to-monitor-t6ss-mediated-bacterial-competition

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.4K Views.  Imperial College London. نحن تصف مقايسة لمراقبة النوعية البكتيرية المنافسة بوساطة الزائفة الزنجارية إفراز VI نظام نوع (T6SS). الفحص يعتمد على بقاء / قتل الخلايا القولونية القولونية الهدف يحمل lacZ مراسل-. هذه التقنية هو قابل للتعديل لتقييم نشاط مبيد للجراثيم / الجراثيم من T6SS-ي...

Video: A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes. In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific immune cell types, viral pathogens, parasites and bacteria can be followed in real-time within living animals 1-2. Application of bioluminescence imaging to the study of pathogens has advantages as compared to conventional strategies for analysis of infections in animal models3-4. Infections can be visualized within individual animals over time, without requiring euthanasia to determine the location and quantity of the pathogen. Optical imaging allows comprehensive examination of all tissues and organs, rather than sampling of sites previously known to be infected. In addition, the accuracy of inoculation into specific tissues can be directly determined prior to carrying forward animals that were unsuccessfully inoculated throughout the entire experiment. Variability between animals can be controlled for, since imaging allows each animal to be followed individually. Imaging has the potential to greatly reduce animal numbers needed because of the ability to obtain data from numerous time points without having to sample tissues to determine pathogen load3-4.
This protocol describes methods to visualize infections in live animals using bioluminescence imaging for recombinant strains of bacteria expressing luciferase. The click beetle (CBRLuc) and firefly luciferases (FFluc) utilize luciferin as a substrate5-6. The light produced by both CBRluc and FFluc has a broad wavelength from 500 nm to 700 nm, making these luciferases excellent reporters for the optical imaging in living animal models7-9. This is primarily because wavelengths of light greater than 600 nm are required to avoid absorption by hemoglobin and, thus, travel through mammalian tissue efficiently. Luciferase is genetically introduced into the bacteria to produce light signal10. Mice are pulmonary inoculated with bioluminescent bacteria intratracheally to allow monitoring of infections in real time. After luciferin injection, images are acquired using the IVIS Imaging System. During imaging, mice are anesthetized with isoflurane using an XGI-8 Gas Anethesia System. Images can be analyzed to localize and quantify the signal source, which represents the bacterial infection site(s) and number, respectively. After imaging, CFU determination is carried out on homogenized tissue to confirm the presence of bacteria. Several doses of bacteria are used to correlate bacterial numbers with luminescence. Imaging can be applied to study of pathogenesis and evaluation of the efficacy of antibacterial compounds and vaccines.

Methods for bioluminescence imaging of bacterial infections in living animals are decribed. Pathogens are modified to express luciferase allowing optical whole body imaging of infections in live animals. Animal models can be infected with luciferase expressing pathogens and the resulting course of disease visualized in real-time by bioluminescence imaging.

Luciferase به لالتهابات جرثومية في صورة الفئران

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&amp;#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

Ligated تطبيق ماوس الفحص باير لتصحيح حلقة لتقييم امتصاص الأمعاء البكتيرية بواسطة خلايا M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.

Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.&#160; Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.

باستخدام تراكب الفحص لقياس نوعيا الإنتاج الجرثومي من والحساسية للالرئوية Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to extrapolate viral replication fitness, ranging from the number of viral particles per infectious unit, growth rate in cell culture, and relative fitness derived from multiple-cycle growth competition assays. Growth competition assays provide a particularly sensitive measurement of fitness since the viruses are competing for cellular targets under identical growth conditions. There are several experimental factors to consider when conducting growth competition assays, including the multiplicity of infection (MOI), sampling times, and viral detection and fitness calculation methods. Each factor can affect the end result and hence must be considered carefully during the experimental design. The protocol presented here includes steps from constructing a new recombinant HIV-1 clone to performing growth competition assays and analyzing the experimental results. This protocol utilizes experimental parameter values previously shown to yield consistent and robust results. Alternatives are discussed, as some parameters need to be adjusted according to the cell type and viruses being studied. The protocol contains two alternative viral detection methods to provide flexibility as the availability of instruments, reagents and expertise varies between laboratories.

Growth competition between nearly isogenic viruses provides a sensitive measurement for determining relative replication fitness. The protocols described here include the construction of recombinant HIV-1 clones, virus propagation and growth competition and analysis methods optimized to yield sensitive and consistent results.

زوجيا النمو الفحص التنافس على تحديد النسخ المتماثل للياقة البدنية من الفيروسات نقص المناعة البشرية

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is controlled up to 95 % of the T cells generated during the expansion phase are eliminated (i.e., contraction phase) and memory T cells remain, sometimes for a lifetime. In humans, two functionally distinct subsets of memory T cells have been described based on the expression of lymph node homing receptors. Central memory T cells express C-C chemokine receptor 7 and CD45RO and are mainly located in T-cell areas of secondary lymphoid organs. Effector memory T cells express CD45RO, lack CCR7 and display receptors associated with lymphocyte homing to peripheral or inflamed tissues. Effector T cells do not express either CCR7 or CD45RO but upon encounter with antigen produce effector cytokines, such as interferon-&#947;. Interferon-&#947; release assays are used for the diagnosis of bovine and human tuberculosis and detect primarily effector and effector memory T cell responses. Central memory T cell responses by CD4+ T cells to vaccination, on the other hand, may be used to predict vaccine efficacy, as demonstrated with simian immunodeficiency virus infection of non-human primates, tuberculosis in mice, and malaria in humans. Several studies with mice and humans as well as unpublished data on cattle, have demonstrated that interferon-&#947; ELISPOT assays measure central memory T cell responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are cultured in decreasing concentration of antigen for 10 to 14 days (long-term culture), allowing effector responses to peak and wane; facilitating central memory T cells to differentiate and expand within the culture.

Application of Long-term cultured Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Long-term cultured interferon-&#947; enzyme-linked immunospot assay is used as a measure of central memory responses and correlates with protective anti-mycobacterial vaccine responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are stimulated with mycobacterial antigens and interleukin-2 for 14 days, enabling differentiation and expansion of central memory T cells.

تطبيق على المدى الطويل مثقف انترفيرون γ انزيم مرتبط Immunospot الفحص لتقييم المستجيب والذاكرة T الردود خلية في الماشية

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

جيل ومتعدد المظهري فحص عالية المحتوى من<em&gt; الكوكسيلا البورنيتية</em&gt; المسوخ ينقول

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming bacterium, Bacillus subtilis. Germination is triggered by small molecule germinants and occurs without the need for macromolecular synthesis. Though differences exist between the mechanisms of spore germination in species of Bacillus and Clostridium, a common requirement is the hydrolysis of the peptidoglycan-like cortex which allows the spore core to swell and rehydrate. After rehydration, metabolism can begin and this, eventually, leads to outgrowth of a vegetative cell. The detection of hydrolyzed cortex fragments during spore germination can be difficult and the modifications to the previously described assays can be confusing or difficult to reproduce. Thus, based on our recent report using this assay, we detail a step-by-step protocol for the colorimetric detection of cortex fragments during bacterial spore germination.

Herein, we describe a colorimetric assay to detect the presence of reducing sugars during bacterial spore germination.

كشف اللحاء شظايا خلال البكتيرية سبور الإنبات

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of antibiotics and other secondary metabolites. Streptomyces coelicolor is a well-characterized, non-pathogenic species that is amenable to a variety of analyses in the lab. The phenotyping methods described here use S. coelicolor as a model streptomycete; however, the methods are applicable to all members of this large genus as well as some closely related actinomycetes. Phenotyping is necessary to characterize new species of Streptomyces identified in the environment, and it is also a vital first step in characterizing newly isolated mutant strains of Streptomyces. Proficiency in phenotyping is important for the many new researchers who are entering the field of Streptomyces research, which includes the study of bacterial development, cell division, chromosome segregation, and second messenger signaling. The recent crowdsourcing of antibiotic discovery through the isolation of new soil microbes has resulted in an increased need for training in phenotyping for instructors new to the field of Streptomyces research and their college or high school students. This manuscript describes methods for bacterial strain propagation, storage, and characterization through visual and microscopic examination. After reading this article, new researchers (microbiology education laboratories and citizen scientists) should be able to manipulate Streptomyces strains and begin visual characterization experiments.

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Here we present protocols for novice researchers to initiate phenotyping for the pharmacologically important bacterial genus Streptomyces.

التقييم المرئية والمجهرية من طفرات إنمائية متسلسلة

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

الفائق دوسنتاريا-مقايسة جراثيم معينة

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

أوبسونوفاجوسيتيك قتل المقايسة لتقييم الاستجابات المناعية ضد مسببات الأمراض البكتيرية

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...