우리는 의료 종사자 자원 봉사자들의 기여를 인정합니다. 이 프로젝트는 이탈리아 MUR의 Department of Excellence 2023/2027에서 지원했습니다. AR과 DZ는 PRIN2022(EU 자금 지원; NextGenerationEU)를 참조하십시오

본 의정서는 베로나 대학교 윤리 위원회(승인 의정서 번호 1538)의 승인을 받았으며 지침을 따릅니다. 연구에 참여한 인간 피험자로부터 정보에 입각한 서면 동의를 얻었습니다. 전혈 샘플은 항 SARS-CoV-2 백신을 접종하는 과정에 있는 의료 종사자(HCW) 자원 봉사자로부터 수집되었습니다. 이들 샘플은 혈청15의 후속 분리를 위해 항응고제를 함유하는 플라스틱 튜브에서 수집하였다.
다음 모든 공정은 멸균 조건에서 작동하는 Class-2 생물학적 후드에서 수행되어야 합니다. 바이러스 취급은 주의해서 수행해야 하며 모든 폐기물은 희석된 표백제 용액으로 중화해야 합니다. 프로토콜에 대한 개요는 그림 1에 나와 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65658/65658fig01v2.jpg"> 그림 1: 중화 분석의 그래픽 표현. (A) PV 생산, (B) PV 적정 및 (C) 중화 분석. 모든 절차는 멸균 조건의 클래스 2 생물학적 후드에서 수행됩니다. 중화 분석(C)에 사용하기 전에 PV의 감염성 수준을 표준화하기 위해 적정 단계(B)를 수행해야 합니다. 이 피규어는 BioRender로 제작되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65658/65658fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
1. SARS-CoV-2 PV 생산 및 감염성 테스트
<ol><li>사용된 형질주입 시약과 호환되는 적절한 세포 밀도에 도달하기 위해 6웰 플레이트(6WP)에 완전한 Dulbecco's Modified Eagle 배지(DMEM, 고포도당, 10% 소 태아 혈청(FBS), 1% L-글루타민, 1% 페니실린/스트렙토마이신)에 5 x 105 HEK293T 세포를 파종합니다. 폴리에틸레니민(PEI)으로 transfection을 수행하는 경우(제조업체 지침에 따라 시약 준비) transfection 당일에 세포가 40-60% 밀도에 도달하는지 확인합니다(단계 1.3). 세포를 37°C 및 5%CO2의 가습 인큐베이터에 보관합니다.</li>
	<li>형질주입 전에 사용한 세포 배지를 항생제가 없는 신선한 배지(DMEM, 고포도당, 10% FBS, 1% L-글루타민)로 교체하여 더 높은 형질주입 효율을 달성하십시오. 참고: 파종 다음 날, HEK293T 세포는 transfection할 준비가 됩니다.</li>
	<li>부착 HEK293T 세포를 제조업체의 지침에 따라 적절한 transfection 시약으로 transfection합니다. PEI를 사용하는 경우 두 개의 믹스를 준비하고 아래 단계를 따르십시오.<ol><li>혼합 A를 준비하기 위해 500ng의 pCMV-dR8.91 패키징 플라스미드16, 750ng의 pCSFLW 리포터 플라스미드16 및 100μL의 환원 혈청 배지에 플라스미드를 발현하는 SARS-CoV-2 스파이크 450ng을 추가합니다.</li>
		<li>혼합물 B를 준비하려면 환원 혈청 배지 100μL에 17.5μL의 PEI(농도: 1mg/mL)를 추가합니다.</li>
		<li>두 혼합물을 실온(RT)에서 5분 동안 배양합니다. 다음으로, PEI 믹스 B를 DNA 믹스 A에 첨가하여 두 튜브의 내용물을 함께 혼합합니다.</li>
		<li>RT에서 20-30분 동안 튜브를 배양합니다. 3-4분마다 튜브를 부드럽게 튕겨 혼합을 향상시킵니다. 마지막으로 혼합물을 HEK293T 세포에 추가합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>transfection 후 16-20시간 후, 배양 배지를 신선하고 완전한 DMEM으로 교체합니다. 37 °C 및 5 % CO2 에서 배양하여 transfection된 세포에 의한 PV 생산을 허용합니다.</li>
	<li>형질주입 후 72시간 후, PV가 함유된 상층액을 수확합니다. 그런 다음 실온에서 1600 x g 에서 7분 동안 원심분리하여 세포 파편과 죽은 세포를 제거하고 0.45μm 셀룰로오스 아세테이트 필터를 통해 여과합니다.</li>
	<li>옵션 단계: PV 역가의 최종 수율을 높이려면 여러 transfection을 수행하고, PV가 포함된 세포 배지를 모으고, 농축 튜브를 사용하여 농축합니다.</li>
	<li>다음 단계("PV 적정", 섹션 2)를 직접 진행하거나 PV 함유 배지를 적절한 튜브에 분주하여 사용할 때까지 -80°C에서 보관합니다. 적정에 사용할 추가 부분 표본(400-500 μL)을 준비합니다. 참고: 여러 부분 표본을 만들면 과도한 해동-동결 주기를 방지하여 실험 간 재현성을 보장할 수 있습니다.</li>
</ol>2. PV 적정
<ol><li>다음 단계를 위해 새로운 PV 함유 배지를 사용하거나 테스트 부분 표본(단계 1.7)을 해동하여 새로운 바이러스 스톡의 적정을 수행합니다. 동일한 PV 스톡의 부분 표본을 동결하면 재현성이 보장됩니다.</li>
	<li>PV 스톡을 복제하여 테스트하는 데 필요한 96웰 플레이트(96WP)의 모든 웰에 50μL의 완전한 DMEM(또는 사용 중인 표적 세포주와 호환되는 완전한 배지)을 추가하고 "A"행은 비워 둡니다. 100μL의 PV 스톡을 "A" 행에 추가합니다. 테스트할 제제의 수에 따라 바이러스가 없는 컬럼 하나를 "세포 전용" 대조군으로 남겨 둡니다(그림 2).</li>
	<li>A행에서 B행까지 50μL를 피펫팅하고 G행까지 이 과정을 반복하여 초기 스톡의 연속 희석을 얻습니다. 마지막 행에서 초과 볼륨을 버리십시오.</li>
	<li>사용한 배지를 제거하고 DPBS 1x로 세포를 두 번 세척한 후 Dulbecco의 인산염 완충 식염수 1x(DPBS 1x)에 트립신/에틸렌디아민테트라아세트산 1x(EDTA)를 사용하여 세포를 분리합니다. 세포를 4 x 105 cells/mL의 밀도로 준비합니다. 참고: 이 프로토콜에서 PV 감염은 감수성 세포주 HEK293T/ACE2에서 테스트되었습니다. 이러한 세포는 HEK293T로부터 유도하고, ACE2 수용체를 발현하기 위해 렌티바이러스 벡터를 사용하여 형질도입하였다.</li>
	<li>각 웰에 50μL의 세포 현탁액을 추가하여 웰당 2 x 104 개의 세포 수를 보장합니다.</li>
	<li>37 °C 및 5 % CO2 에서 48 시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>배양 후 Luciferase 분석을 수행하여 제조업체의 지침에 따라 판독값을 얻습니다. 루시페라아제 시약 100μL를 웰에 넣고 어두운 곳에서 실온에서 2분 동안 배양합니다. 각 웰의 내용물을 검은색 96웰 플레이트(사용 가능한 플레이트 리더와 호환)로 옮기고 96웰 플레이트 리더에서 플레이트를 판독합니다. 참고: 루시페라아제 판독에 사용되는 광도계는 다운스트림 분석에 사용될 처리되지 않은 원시 데이터가 포함된 스프레드시트 파일을 생성합니다(이 경우 Excel 파일). 바이러스의 감염성은 상대 발광 단위(RLU)로 표현됩니다(단락 4.1에 설명됨).</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65658/65658fig02.jpg"> 그림 2: PV 적정을 위한 96웰 플레이트의 대표 레이아웃. 고정된 부피의 PV 함유 상층액을 열 A, 열 1-11에 첨가하고 순차적으로 희석합니다. 마지막 열은 "셀 전용" 컨트롤로 남습니다. 이 피규어는 BioRender로 제작되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65658/65658fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
3. 중화 분석
<ol><li>환자의 혈청을 얼음 위에서 해동합니다. 혈청 검체를 56°C에서 30분 동안 배양하여 비활성화합니다.</li>
	<li>96웰 플레이트에서 B행(1-10열)에서 H행(1-10열)까지 각 웰에 신선하고 완전한 DMEM(또는 사용된 표적 세포주와 호환되는 완전한 배지) 50μL를 추가합니다. 95μL의 신선하고 완전한 DMEM을 A행(열 1-10)에 넣습니다. 50μL 및 100μL의 전체 DMEM을 각각 컬럼 11 및 12의 웰에 추가합니다. 이들은 각각 감염된(바이러스 제어 또는 VC) 및 감염되지 않은(세포 전용 또는 CC) 제어입니다(그림 3).</li>
	<li>5μL의 열 비활성화 혈청/혈장 샘플을 A행(열 1-10)에 추가합니다. 각 샘플은 중복됩니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 첫 번째 행의 샘플을 혼합하고 혈청이 포함된 배지 50μL를 A행에서 B행으로 이동합니다. 마지막 행까지 이 과정을 반복합니다(그림 3). 나머지 50μL는 폐기합니다.</li>
	<li>필요한 수의 PV 부분 표본을 해동하고 ≥ 104 RLU/mL로 희석합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 희석된 PV 함유 배지 50μL를 각 웰(컬럼 1에서 컬럼 11까지)에 추가하여 열 비활성화 혈청/혈장을 바이러스에 1:1로 희석합니다. 혈청 샘플의 항체가 PV의 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 결합할 수 있도록 37°C 및 5%CO2에서 1시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>감수성 세포(HEK293T/ACE2)의 최소 5mL 현탁액을 4 x 105 cells/mL의 세포 밀도로 준비합니다. 세포 현탁액 50μL를 각 웰에 추가하고 37°C 및 5%CO2에서 48시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>배양 후 2.7단계에 설명된 대로 제조업체의 지침에 따라 루시페라아제 분석 판독을 수행합니다. 참고: 루시페라아제 판독에 사용되는 광도계는 스프레드시트 파일(이 경우 .xlsx)을 생성하며, 다운스트림 분석에 사용될 처리되지 않은 원시 데이터(루시페라아제 분석 파일).</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65658/65658fig03.jpg"> 그림 3: 혈청 희석을 기반으로 한 플레이트 표현. 밝은 빨간색은 혈청의 양이 많음을 나타내고 밝은 파란색 레인(열 11)은 감염된 세포 제어(VC, 바이러스 제어)에 해당합니다. 연한 파란색 레인(열 12)은 감염되지 않은 세포(CC, 세포 대조군)에 해당합니다. 이 피규어는 BioRender로 제작되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65658/65658fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
4. 적정 분석
<ol><li>Luciferase 분석 파일에서 해당 샘플에 이름/제목을 할당합니다.</li>
	<li>RLU 측정값에 희석 계수(그리드의 상단에서 하단으로: 20x, 40x, 80x, 160x, 320x, 640x, 1,280x, 2,560x)를 곱하여 RLU/mL를 구합니다. 다른 희석 계수를 사용하는 경우 그에 따라 곱셈 계수를 변경하십시오.</li>
	<li>각 PV 준비에 대한 평균 RLU/mL를 계산합니다.</li>
</ol>5. PVs 중화 분석
<ol><li>Luciferase 분석 스프레드시트 파일(이 경우 .xlsx)에서 테스트된 샘플에 해당 제목을 할당합니다. 샘플의 희석 계수(40초, 80배, 160배, 320배, 640배, 1,280배, 2,560배, 5,120배)를 입력합니다. 희석 계수의 Log10을 계산합니다.</li>
	<li>감염되지 않은 대조군과 감염된 대조군의 평균 RLU를 계산합니다(그림 3, 각각 11열 및 12열). 이러한 값은 5.5단계의 정규화에 유용합니다.</li>
	<li>데이터 분석을 위해 새 문서를 엽니다. X/Y 분석을 선택하고 X를 숫자 로 입력하고 Y를 입력으로 입력 2 반복 횟수 값을 나란히 하위 열에 입력합니다.</li>
	<li>Log10(희석) 값을 X 숫자로 입력합니다. 샘플의 중복 RLU를 입력합니다.</li>
	<li>Analyze( 분석) > Normalize>(정규화) 로 이동하여 동일한 시트의 모든 샘플에 플래그를 지정합니다. 0%는 어떻게 정의됩니까?, 100%는 어떻게 정의됩니까?에 각각 평균 VC 및 CC 값을 입력합니다. 확인을 클릭합니다.</li>
	<li>정규화된 데이터 시트에서 해석 > XY 해석 > 비선형 해석(곡선 맞춤)으로 이동합니다. 모든 샘플에 플래그를 지정하고 확인을 클릭합니다. Dose-response - Inhibition의 경우 log(inhibitor) vs normalized response - variable slope를 선택합니다.</li>
	<li>구속에서 HillSlope를 Must be less than 0으로 변경합니다.</li>
	<li>Output(출력)에서 Create summary table and graph(요약 테이블 및 그래프 생성) 플래그를 지정합니다. 확인을 클릭하여 최종 분석을 얻습니다. 분석을 위한 템플릿이 있는 작업 시트는 보충 파일 1에 제공됩니다.</li>
</ol>

유사형 바이러스를 이용한 SARS-CoV-2에 대한 혈청 중화도 평가

<ol>
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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+impact+of+the+first+year+of+COVID-19+vaccination:+a+mathematical+modelling+study.">Global impact of the first year of COVID-19 vaccination: a mathematical modelling study.</a> The Lancet Infectious Diseases. 22 (9), 1293-1302 (2022).</li><li>Cantoni, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+antibody+neutralisation+activity+against+SARS-CoV-2+variants+and+seasonal+human+coronaviruses+NL63,+HKU1,+and+229E+induced+by+three+different+COVID-19+vaccine+olatforms.">Analysis of antibody neutralisation activity against SARS-CoV-2 variants and seasonal human coronaviruses NL63, HKU1, and 229E induced by three different COVID-19 vaccine olatforms.</a> Vaccines. 11 (1), 58 (2023).</li><li>Siracusano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+decay+of+antibody+response+and+VOC+sensitivity+in+na&#239;ve+and+previously+infected+subjects+at+15+weeks+following+vaccination+with+BNT162b2.">Different decay of antibody response and VOC sensitivity in na&#239;ve and previously infected subjects at 15 weeks following vaccination with BNT162b2.</a> Journal of Translational Medicine. 20 (1), 22 (2022).</li><li>Ruggiero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+vaccination+elicits+unconventional+IgM+specific+responses+in+na&#239;ve+and+previously+COVID-19-infected+individuals.">SARS-CoV-2 vaccination elicits unconventional IgM specific responses in na&#239;ve and previously COVID-19-infected individuals.</a> eBioMedicine. 77, (2022).</li><li>Piubelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subjects+who+developed+SARS-CoV-2+specific+IgM+after+vaccination+show+a+longer+humoral+immunity+and+a+lower+frequency+of+infection.">Subjects who developed SARS-CoV-2 specific IgM after vaccination show a longer humoral immunity and a lower frequency of infection.</a> eBioMedicine. 89, 104471 (2023).</li><li>Zhang, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectivity+of+pseudotyped+SARS-CoV-2+variants+of+concern+in+different+human+cell+types+and+inhibitory+effects+of+recombinant+spike+protein+and+entry-related+cellular+factors.">Infectivity of pseudotyped SARS-CoV-2 variants of concern in different human cell types and inhibitory effects of recombinant spike protein and entry-related cellular factors.</a> Journal of Medical Virology. 95 (1), e28437 (2023).</li><li>da Costa, K. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+A+(N1-N9)+and+Influenza+B+(B/Victoria+and+B/Yamagata)+neuraminidase+pseudotypes+as+tools+for+pandemic+preparedness+and+improved+influenza+vaccine+design.">Influenza A (N1-N9) and Influenza B (B/Victoria and B/Yamagata) neuraminidase pseudotypes as tools for pandemic preparedness and improved influenza vaccine design.</a> Vaccines. 10 (9), 1520 (2022).</li><li>Condor Capcha, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+SARS-CoV-2+spike+pseudotyped+virus+for+viral+entry+and+neutralization+assays:+a+1-week+protocol.">Generation of SARS-CoV-2 spike pseudotyped virus for viral entry and neutralization assays: a 1-week protocol.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 618651 (2021).</li><li>Diomede, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxycycline+inhibition+of+a+pseudotyped+virus+transduction+does+not+translate+to+inhibition+of+SARS-CoV-2+infectivity.">Doxycycline inhibition of a pseudotyped virus transduction does not translate to inhibition of SARS-CoV-2 infectivity.</a> Viruses. 13 (9), 1745 (2021).</li></ol>

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

야생형 바이러스를 사용하면 실제 감염을 시뮬레이션할 수 있지만, 렌티바이러스 PV는 병원성 바이러스를 다루는 데 필요한 엄격한 안전 요건 없이 바이러스 유입 및 감염과 관련된 메커니즘을 연구하는 데 더 안전한 옵션입니다 4,20,21. PV는 연구의 목적인 병원성 바이러스의 표면 외피 당단백질로 둘러싸인 복제 결함 바이러?...

유사형 바이러스(PV)는 숙주-바이러스 및 병원체-병원체 상호 작용을 연구하기 위해 미생물학에서 사용되는 분자 도구입니다 1,2,3,4. PV는 바이러스 게놈을 보호하는 바이러스 코어인 내부 부분과 트로피즘을 정의하는 바이러스 표면의 외피 당단백질인 외부 부분으로 구성된다5. 유사 바이러스는 새로운 바이러스 입자를 생성하기 위한 모든 유전 정보를 포함하지 않기 때문에 표적 세포에서 복제가 불가능합니다. 이러한 특이한 특징의 조합으로 인해 PV는 야생형 바이러스에 대한 안전한 대안이 될 수 있습니다. 반면에 야생형 바이러스는 병원성이 높아 BSL 2 실험실에서 분석을 위해 사용할 수 없다6.
PV의 감염성은 일반적으로 형광 단백질(GFP, RFP, YFP) 또는 화학발광 산물(루시페라아제)을 생산하는 효소를 코딩하는 리포터 유전자에 의해 모니터링될 수 있습니다. 이것은 PV 생산에 사용되는 플라스미드 중 하나에 포함되어 있으며 유사 바이러스7의 게놈에 통합됩니다.
현재 HIV-1 게놈을 기반으로 하는 렌티바이러스 유래 입자를 포함하여 여러 유형의 PV 코어가 존재합니다. 다른 플랫폼에 비해 HIV-1 기반 PV의 가장 큰 장점은 표적 세포 게놈8에 내재된 통합 프로세스입니다. HIV-1은 전염성이 매우 높은 바이러스이고 AIDS의 원인균이지만, 이러한 렌티바이러스 벡터는 수년에 걸친 광범위한 최적화 단계 덕분에 안전하게 사용할 수 있습니다. 형질도입 능력에 영향을 주지 않으면서 바이러스 유전자가 고갈된 2세대 렌티바이러스 벡터의 도입으로 최적의 안전성 조건이 달성되었다9. 3세대 및 4세대는 바이러스 게놈을 별도의 플라스미드10,11로 추가로 분할하여 렌티바이러스 벡터 처리의 안전성을 높이는 데 기여했습니다. 최신 세대의 PV는 일반적으로 유전자 치료를 위한 렌티바이러스 벡터를 생산하는 데 사용됩니다.
PV는 생산 및 감염 단계에서 바이러스와 숙주 세포 간의 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. PV는 특히 유사 바이러스 중화 분석(PVNA)에 사용됩니다. PVNA는 PV의 외피12,13에 있는 바이러스 당단백질을 표적으로 하여 혈청 또는 혈장의 중화 가능성을 평가하도록 널리 검증되었습니다. 억제 농도(50, IC50)로 표현되는 중화 활성은 바이러스 입자 진입의 50%를 차단하는 혈청/혈장의 희석으로 정의된다14. 이 프로토콜에서는 부스터 백신 접종을 받기 전후에 수집된 혈청에서 중증 급성 호흡기 증후군 - 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)에 대한 항체 활성을 테스트하기 위한 PVNA 설정에 대해 설명했습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m filter</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83 1826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83 3920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>8,33,924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10403892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Opaque 96-well Microplate</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>60005270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium&#160;</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>D6546 - 500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (PBS 1x)</td>
			<td>AUROGENE</td>
			<td>AU-L0615-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum</td>
			<td>AUROGENE</td>
			<td>AU-S1810-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism version 7</td>
			<td>graphpad dotmatics</td>
			<td>NA</td>
			<td>In the manuscript, we replace the commercial name with &#39;data analysis program&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T/ACE2 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>HEK293T has been transduced to overexpress ACE2 with a lentiviral vector.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine&#160;</td>
			<td>AUROGENE</td>
			<td>AU-X0550-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer - Victor3</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>HH35000500</td>
			<td>In the manuscript, we replace the commercial name with&#160; &#39;luminometer&#39;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td>In the manuscript, we replace the commercial name with &#39;reduced serum medium&#39;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p8.91 packaging plasmid</td>
			<td>Di Genova et al., 2021</td>
			<td></td>
			<td>A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCSFLW reporter plasmid</td>
			<td>Di Genova et al., 2021</td>
			<td></td>
			<td>A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>AUROGENE</td>
			<td>AU-L0022-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine, branched (PEI) (25 kDa)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>408727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>145839</td>
			<td>This plasmid was used to generate HEK293Tcells/ACE2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 Spike expressing plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>pGBW-m4137382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>steadylite plus Reporter Gene Assay System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6066759</td>
			<td>In the manuscript, we replaced the commercial name with &#39;luciferase reading reagent&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA 1x</td>
			<td>AUROGENE</td>
			<td>AU-L0949-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pseudotyped viruses as a molecular tool to monitor humoral immune responses against sars-cov-2 via neutralization assay

유사형 바이러스(PV)는 관심 유전자 전달을 위한 유전자 치료에 더 잘 알려진 용도 외에도 숙주-바이러스 상호 작용을 연구하고 혈청 샘플의 중화 능력을 테스트하는 데 사용할 수 있는 분자 도구입니다. PV는 바이러스 게놈이 PV에 통합되지 않은 서로 다른 플라스미드로 나뉘기 때문에 복제 결함이 있습니다. 이 안전하고 다재다능한 시스템을 통해 생물 안전 레벨 2 실험실에서 PV를 사용할 수 있습니다. 여기에서, 우리는 여기에 언급된 바와 같이 3개의 플라스미드를 기반으로 렌티바이러스 PV를 생산하기 위한 일반적인 방법론을 제시한다: (1) 감염을 모니터링하는 데 필요한 리포터 유전자를 운반하는 백본 플라스미드; (2) PV를 생성하는 데 필요한 모든 구조 단백질에 대한 유전자를 운반하는 패키징 플라스미드; (3) 바이러스 tropism을 결정하고 숙주 세포로의 바이러스 진입을 매개하는 envelope surface glycoprotein 발현 플라스미드. 이 연구에서 SARS-CoV-2 스파이크는 비복제성 SARS-CoV-2 유사형 렌티바이러스 생산에 사용되는 외피 당단백질입니다.
간단히 말해서, 패키징 셀(HEK293T)은 표준 방법을 사용하여 3개의 서로 다른 플라스미드와 co-transfection되었습니다. 48시간 후, PV를 함유하는 상층액을 수거, 여과하고, -80°C에서 보관하였다. SARS-CoV-2 PV의 감염성은 감염 후 48시간 후 표적 세포주에서 리포터 유전자(루시페라아제)의 발현을 연구하여 테스트되었습니다. 상대 발광 단위(RLU) 값이 높을수록 감염/전달률이 높아집니다. 또한, 감염성 PV를 연속적으로 희석된 혈청 샘플에 첨가하여 유사 바이러스가 표적 세포에 진입하는 중화 과정을 연구했으며, RLU 강도의 감소로 측정되었습니다: 높은 중화 활성에 해당하는 낮은 값.

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools used in microbiology to study host-virus and pathogen-pathogen interactions1,2,3,4. PVs consist of an inner part, the viral core that protects the viral genome, and an outer part, the envelope glycoproteins on the surface of the virus that defines the tropism5. A pseudovirus is replication-incompetent in the target cell because it does not contain all the genetic information to generate new viral particles. This combination of peculiar features makes PVs a safe alternative to a wildtype virus. Wildtype viruses, on the other hand, are highly pathogenic and cannot be used in BSL 2 laboratories for analysis6.
The infectivity of PVs can be monitored by a reporter gene, usually coding for a fluorescent protein (GFP, RFP, YFP) or an enzyme that produces chemiluminescent products (luciferase). This is contained in one of the plasmids used for PV production and incorporated in the genome of the pseudovirus7.
Several types of PV cores currently exist, including lentiviral-derived particles based on the HIV-1 genome. The great advantage of HIV-1-based PVs over other platforms is their intrinsic integration process in the target cell genome8. Although HIV-1 is a highly contagious virus and is the causative agent of AIDS, these lentiviral vectors are safe to use because of the extensive optimization steps over the years. Optimal safety conditions were achieved with the introduction of 2nd-generation lentiviral vectors, in which viral genes were depleted without influencing transduction capabilities9. The 3rd and 4th generations contributed to the increased safety of lentiviral vector handling with the further splitting of the viral genome into separate plasmids10, 11. The latest generations of PVs are generally employed to produce lentiviral vectors for gene therapy.
PVs can be used to study interactions between viruses and host cells, during both the production and the infection phases. PVs are especially employed in pseudovirus neutralization assays (PVNA). PVNAs are widely validated to assess the neutralization potential of serum or plasma by targeting the viral glycoprotein on the PV&#39;s envelope12,13. Neutralization activity, expressed as the inhibitory concentration 50 (IC50), is defined as the dilution of serum/plasma that blocks 50% of viral particle entry14. In this protocol, we described the set-up of a PVNA to test the antibody activity against Severe Acute Respiratory Syndrome - Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) in sera collected before and after receiving a booster vaccine dose.

저자 스포트라이트: Studying Host-Virus Interactions with Pseudotyped Viruses (유사형 바이러스와의 숙주 바이러스 상호 작용 연구) 

중화 분석을 통해 SARS-CoV-2에 대한 체액성 면역 반응을 모니터링하기 위한 분자 도구로서의 유사형 바이러스

Pseudotyped viruses are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test neutralizing activity of serum samples. In the work we present today, a general methodology to produce pseudotyped viruses, based on free plasmid, will be presented. For neutralization assays, Y-type viruses are generally used, but they are highly pathogenic and cannot be handled in a BSL-2 laboratories, rendering this system purely applicable on large scale.The technology of pseudo viruses can be a safer alternative compared to live virus to allow the study of pathogen to host interaction and to test neutralizing activity of antibodies. Future experiments will investigate the role of specific antibodies in the maintenance of immunity after vaccination using the technology of pseudo viruses.

이 프로토콜은 SARS-CoV-2 PV의 생산 및 항COVID-19 백신 접종을 받는 피험자의 혈청/혈장의 중화 활성을 분석하기 위한 이러한 PV의 다운스트림 적용에 대해 설명합니다17. 또한 이 프로토콜은 중화 반응의 진화를 테스트하기 위해 각 SARS-CoV-2 우려 변이체(VOC)의 유사형을 생성하는 데 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 COVID-19 백신 접종 후 체액성 면역 반응에 대한 연구를 용이하게 함?...

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유사형 바이러스(PV)는 실제 바이러스를 취급하는 것보다 더 안전한 조건에서 숙주-바이러스 상호 작용을 연구하는 데 사용되는 복제 결함 바이러스입니다. 여기에 제시된 자세한 프로토콜은 SARS-CoV-2 PV를 사용하여 COVID-19 백신 접종 후 환자 혈청의 중화 능력을 테스트하는 방법을 보여줍니다.

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...

유사형 바이러스는 숙주-바이러스 상호 작용을 연구하고 혈청 샘플의 중화 활성을 테스트하는 데 사용할 수 있는 분자 도구입니다. 오늘 발표하는 연구에서는 유리 플라스미드를 기반으로 pseudotyped 바이러스를 생성하는 일반적인 방법론을 제시할 것입니다. 중화 분석의 경우 일반적으로 Y형 바이러스가 사용되지만 병원성이 높고 BSL-2 실험실에서 처리할 수 없으므로 이 시스템은 대규모로만 적용할 수 있습니다.유사 바이러스의 기술은 병원체와 숙주 상호 작용을 연구하고 항체의 중화 활성을 테스트할 수 있도록 살아있는 바이러스에 비해 더 안전한 대안이 될 수 있습니다. 향후 실험에서는 유사 바이러스 기술을 사용하여 백신 접종 후 면역 유지에 대한 특정 항체의 역할을 조사할 것입니다.

pseudotyped-viruses-as-molecular-tool-to-monitor-humoral-immune

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

1.3K 조회수.  University of Verona. 유사형 바이러스는 숙주-바이러스 상호 작용을 연구하고 혈청 샘플의 중화 활성을 테스트하는 데 사용할 수 있는 분자 도구입니다. 오늘 발표하는 연구에서는 유리 플라스미드를 기반으로 pseudotyped 바이러스를 생성하는 일반적인 방법론을 제시할 것입니다. 중화 분석의 경우 일반적으로 Y형 바이러스가 사용되지만 병원성이 높고 BSL-2 실험실에서 처리할 수 없으므로 이 시스...

비디오: 저자 스포트라이트: Studying Host-Virus Interactions with Pseudotyped Viruses (유사형 바이러스와의 숙주 바이러스 상호 작용 연구) 

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in addition to their better-known use in gene therapy for the delivery of a gene of interest. PVs are replication defective because the viral genome is divided into different plasmids that are not incorporated into the PVs. This safe and versatile system allows the use of PVs in biosafety level 2 laboratories. Here, we present a general methodology to produce lentiviral PVs based on three plasmids as mentioned here: (1) the backbone plasmid carrying the reporter gene needed to monitor the infection; (2) the packaging plasmid carrying the genes for all the structural proteins needed to generate the PVs; (3) the envelope surface glycoprotein expression plasmid that determines virus tropism and mediates viral entry into the host cell. In this work, SARS-CoV-2 Spike is the envelope glycoprotein used for the production of non-replicative SARS-CoV-2 pseudotyped lentiviruses.
Briefly, packaging cells (HEK293T) were co-transfected with the three different plasmids using standard methods. After 48 h, the supernatant containing the PVs was harvested, filtered, and stored at -80 &#176;C. The infectivity of SARS-CoV-2 PVs was tested by studying the expression of the reporter gene (luciferase) in a target cell line 48 h after infection. The higher the value for relative luminescence units (RLUs), the higher the infection/transduction rate. Furthermore, the infectious PVs were added to the serially diluted serum samples to study the neutralization process of pseudoviruses' entry into target cells, measured as the reduction in RLU intensity: lower values corresponding to high neutralizing activity.

Pseudotyped viruses (PVs) are replication-defective virions that are used to study host-virus interactions under safer conditions than handling authentic viruses. Presented here is a detailed protocol that shows how SARS-CoV-2 PVs can be used to test the neutralizing ability of patients' serum after COVID-19 vaccination.

연구

면역학 및 감염병학

SARS-CoV-2 Pseudotype Virus Production and Serum Neutralization Assay

To begin, in a six-well plate, seed one milliliter of human embryonic kidney 293T cells. Add two milliliters of complete DMEM. The next day, replace the medium with fresh antibiotic-free medium to prepare the cells for transfection.To transfect the adherent cells, first, prepare mix A by adding plasmid DNA to 100 microliters of Opti-MEM. Next, add 17.5 microliters of polyethylenimine to 100 microliters of Opti-MEM. Mix the contents of the mix A and B, then incubate.During incubation, gently flick the tube every three to four minutes to enhance mixing. Add the whole volume of the mixture to the plate with the HEK 293T cells. After 16 to 20 hours of transfection, replace the culture medium with fresh complete DMEM.Incubate the plate at 37 degrees Celsius under 5%carbon dioxide to produce the pseudotype viruses. After 72 hours of transfection, harvest the supernatant into a collection tube. Centrifuge the supernatant at 1, 600 G for seven minutes at room temperature.Then filter the supernatant through a 0.45 micrometer cellulose acetate filter. Distribute 50 microliters of complete DMEM in the wells of a 96-well plate. Leave row A empty.Add 100 microliters of the pseudovirus stock to the wells in row A.Next, pipette 50 microliters of the solution from row A to B.Repeat this process up to row G to obtain serial dilutions. Remove the exhausted medium from a plate with cultured susceptible HEK 293T ACE2 cells, and wash the cells with four milliliters of DPBS. Then detach the cells with one milliliter of trypsin EDTA in DPBS saline.Now add 50 microliters of the susceptible cell suspension into each well containing the pseudotype viruses. Incubate the plate at 37 degrees Celsius under 5%carbon dioxide for 48 hours. Add 100 microliters of the luciferase reagent to each well.After incubation, transfer the contents of each well into a black 96-well plate. Then read the plate in a plate reader. In a 96-well plate, add 50 microliters of fresh complete DMEM to columns one to 10 from rows B to H.Add 95 microliters of fresh complete DMEM to the corresponding wells of row A.Now add 50 microliters of complete DMEM to the wells in column 11 and 100 microliters of DMEM to column 12.Pipette five microliters of heat-inactivated serum samples to row A.With a multi-channel pipette, mix the samples in the first row and transfer 50 microliters of medium-containing serum from row A to B up to row H.Distribute 50 microliters of dilute pseudovirus containing medium to each well from columns one to 11. Incubate the plate at 37 degrees Celsius under 5%carbon dioxide for one hour. Prepare a suspension of susceptible HEK293T ACE2 cells in five milliliters.Add 50 microliters of the cell suspension to each well, then incubate before performing the luciferase assay. Lower serum dilution resulted in decreased viral entry into the cells. This is confirmed by the increased percentage of neutralization.