نشكر وي شنغ تان ولوان شيانغ شيويه ين وشيني لي وينغينغ تشونغ على تقديم المساعدة الفنية لإعداد اليوم 32 من أسلاف مستقبلات الضوء المشتقة من hESC بعد الحفظ بالتبريد. تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منح من جائزة منحة أبحاث الباحثين الشباب التابعة للمجلس الوطني للبحوث الطبية (NMRC / OFYIRG / 0042/2017) ومنحة برنامج البحث التنافسي الرابع والعشرين لمؤسسة البحوث الوطنية (CRP24-2020-0083) إلى H.G.T.

تم إجراء التجارب في الجسم الحي وفقا للمبادئ التوجيهية والبروتوكول المعتمد من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام في SingHealth (IACUC) وبيان جمعية الأبحاث في الرؤية وطب العيون (ARVO) لاستخدام في أبحاث العيون والرؤية. تم تثبيط مناعة الجراء من P17 (قبل الزرع) إلى P30 (بعد الزرع) عن طريق إطعامهم مياه الشرب التي تحتوي على السيكلوسبورين (260 جم / لتر).
1. تحضير أسلاف مستقبلات الضوء المشتقة من hESC في اليوم 32 بعد الحفظ بالتبريد
<ol><li>وسط تمايز المستقبلات الضوئية قبل التسخين (PRDM) في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية.</li>
	<li>استرجع كريوفيال يحتوي على اليوم 32 خلية سلف مستقبلات ضوئية مشتقة من hESC من النيتروجين السائل. الحفاظ على الثلج الجاف.</li>
	<li>قم بإذابة الجليد على حرارة 37 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 3-5 دقائق. إعادة تعليق اليوم 32 خلية في 1 مل من PRDM وأجهزة الطرد المركزي في 130 × غرام لمدة 4 دقائق.</li>
	<li>قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل من PRDM.</li>
	<li>إزالة 10 ميكرولتر من الخليط لعد الخلايا. امزج الخلايا باستخدام 0.2٪ تريبان بلو وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. خليط خلية ماصة في شريحة غرفة عد الخلايا. تحديد رقم الخلية وصلاحيتها بواسطة عداد الخلايا الآلي.</li>
	<li>انتقل إلى الخطوة التالية عندما تكون صلاحية الخلية أعلى من 70٪. أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية المتبقية في 130 × ز لمدة 4 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الخلية في PRDM بتركيز 3 × 105 خلايا / ميكرولتر للزرع.</li>
	<li>راقب كتل الخلايا المرئية. أعد تعليق كتل الخلايا بشكل متكرر باستخدام طرف ماصة سعة 10 ميكرولتر في أنبوب الميكروفوج حتى لا يلاحظ أي تكتل خلوي مرئي. قم بالتحميل في حقنة الحقن 33G لمراقبة قذف محلول الخلية من خلال الإبرة.</li>
</ol>2. توصيل تحت الشبكية ل hESCs في الفئران rd10
<ol><li>تحضير<ol><li>تخدير الفأر (P20، ذكر/أنثى، 3-6 جم) باستخدام مزيج من الكيتامين (20 ملغ/كغ من وزن الجسم) والزيلازين (2 ملغ/كغ من وزن الجسم) في حقنة سل سعة 1 مل متصلة بإبرة 27 غرام بالنهج داخل الصفاق. تطبيق حقن تحت الجلد من البوبرينورفين (0.05 ملغ/كغ) للفأر كمسكن وقائي.</li>
		<li>بعد إعطاء التخدير ، غرس قطرة من كل من 1 ٪ تروبيكاميد و 2.5 ٪ فينيليفرين لتوسيع حدقة العين. ضع جل العيون على القرنية لمنع العين من الجفاف وإعتام عدسة العين المرتبط بالتخدير.</li>
		<li>ضع الماوس في قفص فارغ حتى يتم تخديره بالكامل. تقييم مستوى التخدير المناسب عن طريق الضغط على وسادة مخلب وتأكيد ما إذا كان لا يتفاعل مع قرصة الصلبة.</li>
		<li>عندما يتم تخدير الفأر بالكامل ، ضع على وسادة دافئة عند 38 درجة مئوية.</li>
	</ol></li>
	<li>توصيل الخلايا تحت الشبكية<ol><li>لاستخدام نهج pars plana عبر 1 منفذ عبر الجسم الزجاجي ، كما هو الحال هنا ، قم بإجراء حقن تحت الشبكية في بيئة معقمة. استخدم مجهر تشغيل مستقيم مع مسار ضوئي مباشر لإجراء الحقن.</li>
		<li>قم بإعداد المحقنة الزجاجية سعة 10 ميكرولتر عن طريق إزالة محور الإبرة. قم بتركيب الإبرة الحادة 33G على المحقنة الزجاجية. خذ غطاء المحور المعدني وقم بتأمين الإبرة بعناية على المحقنة.</li>
		<li>اغسله بالماء المقطر للتحقق من وجود أي علامات تسرب وسالكية الإبرة. أفرغ المحقنة وضعها على الجانب بعناية.</li>
		<li>ضع الفأر المخدر على وسادة ، مع نظر عين العلاج مباشرة إلى هدف المجهر. تطبيق 0.5 ٪ بروباراكايين هيدروكلوريد وانتظر لمدة 30 ثانية. ضع 150 ميكرولتر من جل العيون على العين وضع غطاء دائري عليه.</li>
		<li>قم بإجراء فحص تقريبي للعين من خلال مراقبة القرنية والقزحية والبؤبؤ والعدسة والملتحمة. من خلال التلميذ ، تصور قاع عين الماوس عن طريق ضبط المستوى البؤري. اضبط الرأس حتى يتم وضع الرأس البصري في وسط التلميذ وتقليل حركة الرأس عن طريق وضعه بشكل صحيح على الوسادة.</li>
		<li>اضغط برفق على قاعدة الأنبوب باستخدام hESCs عدة مرات للحصول على تعليق خلية موحد. باستخدام حقنة زجاجية ميكرولتر سعة 10 ميكرولتر بإبرة حادة 33 جيجا ، اسحب 2 ميكرولتر من الخلايا / الوسائط. اسحب الخلايا قبل الحقن مباشرة لتجنب استقرار / تكتل الخلايا في المحقنة.</li>
		<li>باستخدام إبرة 30G يمكن التخلص منها ، قم بعمل جرح استئصال الصلبة 2 مم خلف الليمبوس. حافظ على زاوية الإبرة عند ~ 45 درجة لتجنب لمس العدسة. بمجرد تصور طرف الإبرة في العين ، اسحب الإبرة برفق. تخلص من الإبرة في الحاوية الحادة بعد الاستخدام لتجنب إصابة وخز الإبرة.</li>
		<li>خذ المحقنة الزجاجية وأدخل الإبرة الحادة في جرح استئصال الصلبة. دون لمس العدسة ، قم بدفع الإبرة الحادة حتى تصل إلى شبكية العين المقابلة لجرح الدخول. تأكد من أن منطقة الحقن خالية من الأوعية الدموية الرئيسية في شبكية العين لتجنب النزيف.</li>
		<li>اخترق الشبكية برفق حتى يظهر فرع ضغط على الصلبة. حافظ على الطرف الحاد للإبرة موازيا للصلبة لتجنب تسرب الخلايا إلى الفضاء الزجاجي.</li>
		<li>حقن ببطء 2 ميكرولتر من تعليق الخلية أو وسائط PRDM (التحكم) في الفضاء تحت الشبكية مع الحفاظ على الضغط اللطيف على المحقنة. مع الحقن الناجح ، يجب تشكيل فقاعة مرئية (أي شبكية مرتفعة مع تعليق / وسائط الخلية فيها) في موقع الحقن. ملاحظة: يجب استخدام الضغط اللطيف فقط أثناء الحقن لتجنب تمزق الشبكية وانسداد الخلايا عند طرف الإبرة.</li>
		<li>بعد التأكد من الفقاعة ، انتظر لمدة 10 ثوان للسماح للخلايا بالاستقرار. اسحب الإبرة برفق من العين.</li>
	</ol></li>
	<li>التصوير المقطعي للتماسك البصري أثناء العملية (OCT) مسح الفقاعة (اختياري)<ol><li>ضع عين الماوس لتصور الفقاعة تحت المجهر عن طريق تحريك الرأس ببطء. تأمين الموقف عن طريق عقد الرأس برفق. لا يلزم توسيع حدقة العين الإضافي. لا تقم بإزالة زلة الغطاء والهلام على العين. يعطي وسائط بصرية واضحة لتصور الفقاعة.</li>
		<li>قم بإجراء OCT أثناء العملية باستخدام وظيفة iOCT المدمجة في مجهر التشغيل.</li>
		<li>اضغط على خيار Cube على شاشة OCT وضع منطقة المسح الضوئي على الفقاعة بالضغط على أزرار السهم . اضبط OCT عن طريق تحريك التوسيط والتركيز للحصول على أفضل جودة OCT. اضغط على Capture/Scan للحصول على مسح OCT لمنطقة الفقاعة. راجع الصور للتحقق من جودة عمليات المسح.</li>
	</ol></li>
	<li>الانتعاش<ol><li>قم بإزالة قسيمة الغطاء وتنظيف الجل من العين بالشاش. تطبيق مرهم مضاد حيوي مرة واحدة بعد الحقن لمنع العدوى.</li>
		<li>اسمح للحيوان بالتعافي من التخدير تحت ضوء دافئ حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي والعودة إلى قفص المنزل. راقب لمدة 3 أيام على الأقل بعد الحقن بحثا عن علامات الالتهاب والعدوى والضيق. ملاحظة: يجب أن يكون الضوء الدافئ 150 واط على بعد 30 سم على الأقل من قفص ، ويجب توخي الحذر لتجنب إصابة الحروق.</li>
		<li>تطبيق حقن تحت الجلد من البوبرينورفين (0.05 ملغ/كغ) 8 كل ساعة لمدة 1 يوم أو حسب توصية الطبيب البيطري. إذا لوحظ التهاب أو عدوى في العين ، استشر أخصائي بيطري للحصول على العلاج المناسب.</li>
	</ol></li>
	<li>تنظيف وتعقيم الأدوات<ol><li>اغسل حقنة ميكرولتر زجاجية سعة 10 ميكرولتر وإبرة حادة 33G بإيثانول 100٪ 10x. اغسل الإيثانول عن طريق وميض المحقنة بالماء المقطر.</li>
		<li>قم بتفكيك المحقنة الزجاجية والإبرة. تجفيف حقنة للتخزين.</li>
	</ol></li>
</ol>

تنشيط البصر: العلاج بالخلايا الجذعية لتنكس الشبكية

هوي غون تاي هو أحد مؤسسي شركة Alder Therapeutics AB. يعلن مؤلفون آخرون عدم وجود مصالح متنافسة.

تم استخدام الحقن تحت الشبكية لزراعة تعليق الخلايا لعلاج RPE وأمراض الشبكية23،25،26،27،28،31،40. هذا النهج ضروري للغاية في دراسات القوارض ليس فقط لزرع الخلايا ونهج العل...

تؤدي أمراض الشبكية الوراثية والتنكس البقعي المرتبط بالعمر إلى فقدان الخلايا المستقبلة للضوء والعمى في نهاية المطاف. المستقبل الضوئي للشبكية هو طبقة الجزء الخارجي من شبكية العين التي تتكون من خلايا متخصصة مسؤولة عن النقل الضوئي (أي تحويل الضوء إلى إشارات عصبية). توجد خلايا مستقبلات الضوء المخروطية والمخروطية بجوار الطبقة المصطبغة في شبكية العين (RPE)1. كان العلاج باستبدال الخلايا المستقبلة للضوء لتعويض فقدان الخلايا نهجا علاجيا ناشئا ومتطورا. تم استخدام الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs)2،3،4 ، والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) المشتقة من RPE ، والخلايا السلفية للشبكية (RPCs) 4،5،6،7،8 لاستعادة الخلايا المستقبلة للضوء التالفة. يعد الفضاء تحت الشبكية ، وهو مساحة محصورة بين الشبكية و RPE ، موقعا جذابا لإيداع هذه الخلايا لتحل محل الخلايا المستقبلة للضوء التالفة ، RPE ، وخلايا مولر نظرا لجوارها9،10،11.
تستخدم العلاجات الجينية والخلوية المساحة تحت الشبكية للطب التجديدي لمختلف أمراض الشبكية في الدراسات قبل السريرية. ويشمل ذلك تسليم نسخ وظيفية من أدوات تحرير الجينات أو الجينات في شكل إما علاج قليل النوكليوتيد المضاد للإحساس12،13 أو CRISPR / Cas9 أو تحرير القاعدة عبر الإستراتيجية القائمة على الفيروسات المرتبطة بالغدي (AAV)14،15،16 ، وزرع المواد (على سبيل المثال ، ورقة RPE ، الأطراف الاصطناعية للشبكية17،18،19) وعضويات الشبكية المتمايزة المشتقة من الخلايا الجذعية20، 21,22 لعلاج أمراض الشبكية والأمراض المرتبطة ب RPE. التجارب السريرية باستخدام hESC-RPE31 في الفضاء تحت الشبكية لعلاج داء ليبر الخلقي المرتبط ب RPE65 (LCA)23,24, أكروماتوبسيا25 المرتبط ب CNGA3, التهاب الشبكية الصباغي26 المرتبط ب MERTK, المشيمية 27,28,29,30 ثبت أنه نهج فعال. الحقن المباشر للخلايا بالقرب من المنطقة المتضررة يحسن بشكل كبير من فرصة استقرار الخلايا في المنطقة المناسبة ، والتكامل المشبكي ، والتحسن البصري في نهاية المطاف.
على الرغم من أن الحقن تحت الشبكية في النماذج البشرية والعيون الكبيرة (أي الخنزير32،33،34،35 ، الأرنب36،37،38،39،40 ، والرئيسيات غير البشرية41،42،43) قد تم تأسيسه ، إلا أن هذا الحقن في نموذج الفئران لا يزال يمثل تحديا بسبب قيود حجم مقلة العين وهائلة. عدسة تحتل عين الفأر44،45،46. ومع ذلك ، فإن النماذج المعدلة وراثيا متاحة بسهولة فقط في الصغيرة وليس في الكبيرة (أي الأرانب والرئيسيات غير البشرية) ، وبالتالي فإن الحقن تحت الشبكية في الفئران يلفت الانتباه إلى التحقيق في الأساليب العلاجية الجديدة في الاضطرابات الوراثية للشبكية. يتم استخدام ثلاثة طرق رئيسية لتوصيل الخلايا أو AAVs إلى الفضاء تحت الشبكية ، وهي الطريق عبر القرنية ، والطريق عبر الصلبة ، وطريق pars plana (انظر الشكل 2). ترتبط الطرق عبر القرنية وعبر الصلبة بتكوين إعتام عدسة العين ، وتزامن ، ونزيف المشيمية ، والارتجاع من موقع الحقن11،44،45،47،48،49. اعتمدنا نهج pars plana كتصور مباشر لعملية الحقن ، ويمكن تحقيق موقع الحقن في الوقت الفعلي تحت المجهر.
لقد وصفنا مؤخرا طريقة يمكنها التمييز بين الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) إلى أسلاف مستقبلات ضوئية في ظل ظروف xenofree ومحددة كيميائيا باستخدام شكل LN523 من الصفيحة البشرية المؤتلف الخاص بشبكية العين. منذ العثور على LN523 ليكون موجودا في شبكية العين ، افترضنا أن مكانة المصفوفة خارج الخلية لشبكية العين البشرية يمكن تلخيصها في المختبر وبالتالي دعم تمايز المستقبلات الضوئية من hESCs36. أظهر تحليل النسخ أحادي الخلية أن أسلاف المستقبلات الضوئية التي تشارك في التعبير عن القضيب المخروطي و recoverin تم إنشاؤها بعد 32 يوما. تم استخدام نموذج فأر متحور تنكس الشبكية 10 (rd10) يحاكي التهاب الشبكية الصباغي البشري الصبغي الجسدي لتقييم فعالية اليوم 32 من أسلاف مستقبلات الضوء المشتقة من hESC في الجسم الحي. تم حقن الخلايا السلفية للمستقبلات الضوئية المشتقة من hESC في الفضاء تحت الشبكية للفئران rd10 في P20 ، حيث يستمر خلل وتنكس المستقبلات الضوئية36. هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا لإعداد أسلاف مستقبلات الضوء المشتقة من hESC المحفوظة بعد التبريد وتسليمها إلى الفضاء تحت الشبكية للفئران rd10 . يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لإدارة AAVs أو معلقات الخلايا أو الببتيدات أو المواد الكيميائية في الفضاء تحت الشبكية في الفئران.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.3% Tobramycin</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>NDC &#160;0078-0813-01</td>
			<td>Tobrex (3.5 g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3% Tobramycin and 0.1% Dexamethasone</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>NDC 0078-0876-01</td>
			<td>Tobradex (3.5 g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Proparacaine hydrochloride</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>NDC 0998-0016-15</td>
			<td>0.5% Alcaine (15 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Tuberculin syringe</td>
			<td>Turemo</td>
			<td>SS01T2713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Tropicamide</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>NDC 0998-0355-15</td>
			<td>1% Mydriacyl (15 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Phenylephrine hydrochloride</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>NDC 0998-0342-05</td>
			<td>2.5% Mydfrin (5 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G Disposable needle</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>305128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33 G, 20 mm length blunt needles</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Cell Counter</td>
			<td>NanoEnTek</td>
			<td>Model: Eve</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 without Vitamin A</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12587001</td>
			<td>2%36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Ceva</td>
			<td></td>
			<td>Vetergesic vet (0.3 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CKI-7</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0742</td>
			<td>5 &#181;M36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclosporine</td>
			<td>Novartis</td>
			<td></td>
			<td>260 g/L in drinking water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells</td>
			<td>DUKE-NUS Medical School</td>
			<td></td>
			<td>Human embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>Winner Industries Co. Ltd.</td>
			<td>1SNW475-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow Minimum Essential Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11710&#8211;035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hESC cell line H1</td>
			<td>WiCell Research Institute</td>
			<td>WA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02-50</td>
			<td>10 ng/mL36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ciliary neurotrophic factor (CNTF)</td>
			<td>Prospec-Tany Technogene</td>
			<td>CYT-272</td>
			<td>10 ng/mL36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride (100 mg/mL)</td>
			<td>Ceva Sant&#233; Animale</td>
			<td>KETALAB03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LN-521</td>
			<td>Biolamina</td>
			<td>LN521-02</td>
			<td>1 &#181;g36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mFreSR</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlitre glass syringe (10 mL)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7653-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S2215</td>
			<td>10 &#181;M36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A13707-01</td>
			<td>1%36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids (NEAA)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140&#8211;050</td>
			<td>1x36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NutriStem XF Media</td>
			<td>Satorius</td>
			<td>05-100-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>OPMI LUMERA 700</td>
			<td>With Built-in iOCT function</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml)</td>
			<td>DUKE-NUS Medical School</td>
			<td></td>
			<td>See media composition36. Basal Medium, 10 &#181;M DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 &#181;M Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360&#8211;070</td>
			<td>1 mM36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rd10 mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>B6.CXB1-Pde6brd10/J mice</td>
			<td>Gender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>0695/50</td>
			<td>0.5 &#181;M36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Cover Slip (12 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4317</td>
			<td>0.5 &#181;M36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vidisic Gel (10 g)</td>
			<td>Dr. Gerhard Mann</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine hydrochloride (20 mg/mL)</td>
			<td>Troy Laboratories</td>
			<td>LI0605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21985&#8211;023</td>
			<td>0.1 mM36</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sub-retinal delivery of human embryonic stem cell derived photoreceptor progenitors in rd10 mice

يعد تجديد الخلايا المستقبلة للضوء باستخدام الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات علاجا واعدا لعلاج أمراض الشبكية الوراثية والشيخوخة في المراحل المتقدمة. لقد أظهرنا أن مصفوفة اللامينين المتساوية الشكل الخاصة بشبكية العين البشرية قادرة على دعم تمايز الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) إلى أسلاف المستقبلات الضوئية. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر الحقن تحت الشبكية لهذه الخلايا أيضا استعادة جزئية في نماذج القوارض والأرانب rd10 . من المعروف أن الحقن تحت الشبكية هو طريقة راسخة تم استخدامها لتوصيل المركبات الصيدلانية إلى الخلايا المستقبلة للضوء والطبقة الظهارية المصطبغة بالشبكية (RPE) للعين نظرا لقربها من المساحة المستهدفة. كما تم استخدامه لتوصيل النواقل الفيروسية المرتبطة بالغدي إلى الفضاء تحت الشبكية لعلاج أمراض الشبكية. يمثل التوصيل تحت الشبكية للمركبات والخلايا الصيدلانية في نموذج الفئران تحديا بسبب القيود في حجم مقلة عين الفئران. يصف هذا البروتوكول الإجراء التفصيلي لإعداد الخلايا السلفية للمستقبلات الضوئية المشتقة من hESC للحقن وتقنية التوصيل تحت الشبكية لهذه الخلايا في الفئران الطافرة لالتهاب الشبكية الصباغي الوراثي ، rd10 . يسمح هذا النهج بالعلاج الخلوي للمنطقة المستهدفة ، ولا سيما الطبقة النووية الخارجية لشبكية العين ، حيث تحدث الأمراض التي تؤدي إلى تنكس المستقبلات الضوئية.

Inherited retinal diseases and age-related macular degeneration lead to photoreceptor cell loss and eventual blindness. The retinal photoreceptor is the outer segment layer of the retina comprised of specialized cells responsible for phototransduction (i.e., conversion of light to neuronal signals). The rod and cone photoreceptor cells are adjacent to the retinal pigmented layer (RPE)1. Photoreceptor cell replacement therapy to compensate the cell loss has been an emerging and developing therapeutic approach. Embryonic stem cells (ESCs)2,3,4, induced pluripotent stem cells (iPSCs)-derived RPE cells, and retinal progenitor cells (RPCs)4,5,6,7,8 were used to restore the damaged photoreceptor cells. Sub-retinal space, a confined space between the retina and the RPE, is an attractive location to deposit these cells to replace damaged photoreceptor cells, RPE, and Mueller cells due to its vicinity9,10,11.
Gene and cell therapies have been utilizing the sub-retinal space for regenerative medicine for various retinal diseases in pre-clinical studies. This includes the delivery of functional copies of the gene or gene editing tools in the form of either anti-sense oligonucleotide therapy12,13 or CRISPR/Cas9 or base editing via adeno-associated virus (AAV) based strategy14,15,16, implantation of materials (e.g., RPE sheet, retinal prosthetics17,18,19) and differentiated stem cell-derived retinal organoids20,21,22 to treat retinal and RPE-related diseases. Clinical trials using hESC-RPE31 in the sub-retinal space to treat RPE65-associated Leber congenital amaurosis (LCA)23,24, CNGA3-linked achromatopsia25, MERTK-associated retinitis pigmentosa26, choroideremia27,28,29,30 have been proven to be an effective approach. Direct injection of cells to the vicinity of the damaged area greatly improves the chance of cell settlement at the appropriate region, synaptic integration, and eventual visual improvement.
Even though sub-retinal injection in human and large-eyed models (i.e., pig32,33,34,35, rabbit36,37,38,39,40, and non-human primate41,42,43) has been&#160;established, such injection in the murine model is still challenging due to the constrain of the eyeball size and enormous lens occupying the mouse eye44,45,46. However, genetically modified models are only readily available in small animals and not in large animals (i.e., rabbits and non-human primates), therefore sub-retinal injection in mice draws attention to investigate novel therapeutic approaches in retinal genetic disorders. Three major approaches are being used to deliver cells or AAVs into the sub-retinal space, namely the trans-corneal route, trans-scleral route, and the pars plana route (See Figure 2). Trans-corneal and trans-scleral routes are associated with cataract formation, synechiae, choroidal bleeding, and reflux from the injection site11,44,45,47,48,49. We adopted the pars plana approach as a direct visualization of the injection process, and the injection site can be achieved in real-time under the microscope.
We recently described a method that can differentiate human embryonic stem cells (hESCs) into photoreceptor progenitors under xenofree, chemically defined conditions using recombinant human retina-specific laminin isoform LN523. Since LN523 was found to be present in the retina, we hypothesized that the extracellular matrix niche of the human retina could be recapitulated in vitro and thereby support photoreceptor differentiation from the hESCs36. Single-cell transcriptomic analysis showed that photoreceptor progenitors co-expressing cone-rod homeobox and recoverin were generated after 32 days. A retinal degeneration 10 (rd10) mutant mouse model that mimics autosomal human retinitis pigmentosa was used to evaluate the efficacy of the day 32 hESC-derived photoreceptor progenitors in-vivo. The hESC-derived photoreceptor progenitor cells were injected into the sub-retinal space of rd10 mice at P20, where photoceptor dysfunction and degeneration are ongoing36. Here, we describe a detailed protocol for the preparation of the post-cryopreserved hESC-derived photoreceptor progenitors and delivery into the sub-retinal space of rd10 mice. This method can also be used to administer AAVs, cell suspensions, peptides, or chemicals into the sub-retinal space in mice.

تسليط الضوء على المؤلف: النهوض باستعادة الرؤية - العلاج القائم على الخلايا الجذعية لأمراض الشبكية 

توصيل تحت الشبكية لأسلاف مستقبلات الضوء المشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في الفئران RD10

My research focuses on the development of stem cell based therapy for advanced stages of retinal diseases that cause photoreceptor degeneration. The goal of our research is to replace the loss of photoreceptors in patients with clinically safe and functional photoreceptor progenitors with the aim of improving their visual acuity or even restoring their vision. The main preclinical model is mice, but their small sized eyeball make it challenging to inject materials, especially under the retina.Developing the skill to perform successful subretinal injections requires patience and perseverance. We have successfully developed a laminin base for the receptor differentiation method that is able to generate photoreceptor progenitors in 32 days. The subretinal transplantations of this photoreceptor progenitors cell suspensions in the rodents resulted in synaptic connectivity between the holes and graft in the eyes.This has led to partial visual restoration. Our approach is simple, the right visualization helps the surgeon handle the needle to the area of interest.

تم تجميع المحقنة الزجاجية سعة 10 ميكرولتر وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (الشكل 1) ، وتظهر الإبرة الحادة المستخدمة لتوصيل تعليق / وسائط الخلية في الشكل 1 ب. يوضح الشكل 2 طرقا مختلفة للحقن تحت الشبكية. نصف نهج pars plana في هذا البروتوكول (ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Advancing Vision Restoration — Stem Cell-Based Therapy for Retinal Diseases at JoVE.com

وصفنا بروتوكولا مفصلا لإعداد الخلايا السلفية للمستقبلات الضوئية المشتقة من hESC المحفوظة بعد التبريد والتوصيل تحت الشبكية لهذه الخلايا في الفئران rd10 .

Regeneration of photoreceptor cells using human pluripotent stem cells is a promising therapy for the treatment of both hereditary and aging retinal ...

يركز بحثي على تطوير العلاج القائم على الخلايا الجذعية للمراحل المتقدمة من أمراض الشبكية التي تسبب تنكس المستقبلات الضوئية. الهدف من بحثنا هو استبدال فقدان المستقبلات الضوئية في المرضى الذين يعانون من أسلاف مستقبلات ضوئية آمنة سريريا ووظيفية بهدف تحسين حدة البصر أو حتى استعادة رؤيتهم. النموذج الرئيسي قبل السريري هو الفئران ، لكن مقلة العين الصغيرة الحجم تجعل من الصعب حقن المواد ، خاصة تحت شبكية العين.يتطلب تطوير المهارة لإجراء الحقن الناجحة تحت الشبكية الصبر والمثابرة. لقد نجحنا في تطوير قاعدة لامينين لطريقة تمايز المستقبلات القادرة على توليد أسلاف مستقبلات ضوئية في 32 يوما. أدت عمليات زرع تحت الشبكية لمعلقات خلايا أسلاف مستقبلات الضوء هذه في القوارض إلى اتصال متشابك بين الثقوب والكسب غير المشروع في العينين.وقد أدى ذلك إلى استعادة بصرية جزئية. نهجنا بسيط ، والتصور الصحيح يساعد الجراح على التعامل مع الإبرة في منطقة الاهتمام.

sub-retinal-delivery-human-embryonic-stem-cell-derived-photoreceptor

Research

JoVE Journal

Medicine

Sub-Retinal Delivery of Human Embryonic Stem Cell Derived Photoreceptor Progenitors in rd10 Mice

672 Views.  Singapore Eye Research Institute. يركز بحثي على تطوير العلاج القائم على الخلايا الجذعية للمراحل المتقدمة من أمراض الشبكية التي تسبب تنكس المستقبلات الضوئية. الهدف من بحثنا هو استبدال فقدان المستقبلات الضوئية في المرضى الذين يعانون من أسلاف مستقبلات ضوئية آمنة سريريا ووظيفية بهدف تحسين حدة البصر أو حتى اس...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: النهوض باستعادة الرؤية - العلاج القائم على الخلايا الجذعية لأمراض الشبكية 

Regeneration of photoreceptor cells using human pluripotent stem cells is a promising therapy for the treatment of both hereditary and aging retinal diseases at advanced stages. We have shown human recombinant retina-specific laminin isoform matrix is able to support the differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) to photoreceptor progenitors. In addition, sub-retinal injection of these cells has also shown partial restoration in the rd10 rodent and rabbit models. Sub-retinal injection is known to be an established method that has been used to deliver pharmaceutical compounds to the photoreceptor cells and retinal pigmented epithelial (RPE) layer of the eye due to its proximity to the target space. It has also been used to deliver adeno-associated viral vectors into the sub-retinal space to treat retinal diseases. The sub-retinal delivery of pharmaceutical compounds and cells in the murine model is challenging due to the constraint in the size of the murine eyeball. This protocol describes the detailed procedure for the preparation of hESC-derived photoreceptor progenitor cells for injection and the sub-retinal delivery technique of these cells in genetic retinitis pigmentosa mutant, rd10 mice. This approach allows cell therapy to the targeted area, in particular the outer nuclear layer of the retina, where diseases leading to photoreceptor degeneration occur.

We describe a detailed protocol for the preparation of post-cryopreserved hESC-derived photoreceptor progenitor cells and the sub-retinal delivery of these cells in rd10 mice.

Reviving the Cryopreserved Day 32 hESC-Derived Photoreceptor Progenitors

Begin by placing PRDM in a water bath set at 37 degrees Celsius. Remove a cryovial containing day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells from liquid nitrogen, and keep it on dry ice. Then thaw the cryovial in a water bath at 37 degrees Celsius for three to five minutes.Re-suspend the cells in one milliliter of PRDM. Centrifuge them at 130G for four minutes After removing the supernatant, re-suspend the pellet in one milliliter of PRDM. To count the cells, take 10 microliters of the cell suspension and mix with 0.2%trypan blue, following the manufacturer's instructions.Pipette the cell mixture into the cell counting chamber slide, and determine the cell number and viability using an automated cell counter. If cell viability is above 70%centrifuge the remaining cell suspension at 130G for four minutes. Remove the supernatant and re-suspend the cell pellet in PRDM for transplantation.Using a 10 microliter pipette tip, re-suspend cell clumps in the microfuge tube until no clumps are visible. Load the suspension into a 33-gauge injection syringe and confirm the extrusion of cell solution through the needle.

إحياء اليوم 32 من أسلاف مستقبلات الضوء المشتقة من hESC

Sub-Retinal Delivery of the hESC-Derived Photoreceptor Progenitor Cells in rd10 Mice

Sub-Retinal Delivery of the hESC-Derived Photoreceptor Progenitor Cells in  rd10  Mice  

To begin, take an anesthetized mouse and apply one drop of 1%tropicamide and 2.5%phenylephrine into the eye to dilate the pupil. Then apply an ophthalmic gel to the cornea to prevent dryness and anesthesia induced cataracts. Next, set up an upright operating microscope with a direct light path in a sterile environment to perform the subretinal injection.To prepare the 10 microliter glass syringe, detach the needle hub and attach the 33 gauge blunt needle. Take the metal hub cover and securely fasten the needle onto the syringe. Flush the needle with distilled water to test leakage and needle patency.Then empty the syringe and set it aside carefully. Next, position the anesthetized mouse on a cushion and orient the treatment eye toward the microscope's objective. Apply 0.5%proparacaine hydrochloride and wait for 30 seconds.Then apply 150 microliters of ophthalmic gel to the eye and affix a round cover slip. Perform a preliminary eye examination observing the cornea, iris, pupil, lens, and conjunctiva. Adjust the focal plane to visualize the fundus of the mouse eye through the pupil.Then align the head so that the optic head aligns with the center of the pupil. Afterwards, tap the base of the tube containing HESC derived photoreceptor progenitors to get a uniform cell suspension. Using a 10 microliter glass microliter syringe with a 33 gauge blunt needle, draw two microliters of cell mixture.Use a 30 gauge disposable needle to create a sclerectomy wound positioned two millimeters behind the limbus. Maintain the needle's angle at approximately 45 degrees to prevent contact with the lens. Once the needle tip becomes visible within the eye, carefully retract the needle.Discard the used needle into a sharp bin to prevent needle prick injuries. Now take the glass syringe and insert the blunt needle into the sclerectomy wound. Advance the blunt needle without touching the lens until it reaches the opposite retina of the entry wound.Gently penetrate the retina until a pressure branch on the sclera is seen. Then inject two microliters of the cell suspension or PRDM media into the subretinal space while maintaining gentle pressure on the syringe. The formation of a visible bleb indicates successful injection.Wait 10 seconds to allow the cells to settle down. Gently retract the needle from the eye. To visualize the bleb, move the mouse head to position the eye under the microscope and secure the position by gently holding the head.For intraoperative OCT, use the IOCT function on the operating microscope and select cube on the OCT screen. Position the scanning area on the bleb by pressing the arrow buttons. To adjust the OCT, slide centering and focus for the best OCT quality, press capture or scan to acquire the OCT scan of the bleb area and review the images to check the quality of the scans.Finally, remove the cover slip and gently clean the gel from the eye using gauze. Administer antibiotic ointment once after the injection to prevent infection. The OCT scan revealed distinct HESC entities suspended in the cell treated eye.In contrast, the media treated eye displayed unclouded fluid, void of cells within the subretinal space.