Agradecemos a Wei Sheng Tan, Luanne Chiang Xue Yen, Xinyi Lee e Yingying Chung por fornecerem assistência técnica para a preparação do dia 32 progenitores fotorreceptores derivados de hESC após criopreservação. Este trabalho foi apoiado em parte por subsídios do National Medical Research Council Young Investigator Research Grant Award (NMRC/OFYIRG/0042/2017) e National Research Foundation24th Competitive Research Program Grant (CRP24-2020-0083) para H.G.T.

Os experimentos in vivo foram realizados de acordo com as diretrizes e protocolos aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee of SingHealth (IACUC) e pela Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Statement para o uso de animais em Pesquisa Oftalmológica e da Visão. Os filhotes foram imunossuprimidos de P17 (pré-transplante) a P30 (pós-transplante) alimentando-os com água potável contendo ciclosporina (260 g/L).
1. Preparação de progenitores fotorreceptores derivados de hESC do Dia 32 após criopreservação
<ol><li>Meio de diferenciação fotorreceptor pré-aquecido (PRDM) em banho-maria a 37 °C.</li>
	<li>Recuperar um criovial contendo células progenitoras fotorreceptoras derivadas de hESC do dia 32 a partir de nitrogênio líquido. Mantenha no gelo seco.</li>
	<li>Descongelar o criovial a 37 °C em banho-maria por 3-5 min. Ressuspender no dia 32 células em 1 mL de PRDM e centrifugar a 130 x g por 4 min.</li>
	<li>Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 1 mL de PRDM.</li>
	<li>Remover 10 μL da mistura para contagem celular. Misture as células usando 0,2% de azul de tripano de acordo com as instruções do fabricante. Pipetar a mistura de células para a lâmina da câmara de contagem de células. Determine o número e a viabilidade de células por contador de células automatizado.</li>
	<li>Prossiga para a próxima etapa quando a viabilidade celular estiver acima de 70%. Centrifugar a suspensão de células restantes a 130 x g por 4 min. Retirar o sobrenadante e ressuspender o pellet de células em PRDM na concentração de 3 x 105 células/μL para transplante.</li>
	<li>Observe se há aglomerados celulares visíveis. Ressuspenda os aglomerados celulares repetidamente usando uma ponta de pipeta de 10 μL no tubo de microfuga até que nenhum aglomerado celular visível seja observado. Coloque na seringa de injeção 33G para observar a extrusão da solução celular através da agulha.</li>
</ol>2. Liberação sub-retiniana das hESCs em camundongos rd10
<ol><li>Preparo dos animais<ol><li>Anestesiar o camundongo (P20, macho/fêmea, 3-6 g) usando uma combinação de cetamina (20 mg/kg de peso corporal) e xilazina (2 mg/kg de peso corporal) em uma seringa tuberculínica de 1 mL conectada a uma agulha 27G por abordagem intraperitoneal. Administrar uma injeção subcutânea de buprenorfina (0,05 mg/kg) no camundongo como analgésico preventivo.</li>
		<li>Após a administração da anestesia, instilar uma gota cada de tropicamida a 1% e fenilefrina a 2,5% para dilatação pupilar. Aplique um gel oftálmico na córnea para evitar o ressecamento do olho e catarata relacionada à anestesia.</li>
		<li>Coloque o rato numa gaiola vazia até ficar totalmente anestesiado. Avalie o nível anestésico adequado apertando a pata e confirme se o animal não reage ao pinça dura.</li>
		<li>Quando o rato estiver totalmente anestesiado, coloque o animal numa almofada quente regulada a 38 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Entrega sub-retiniana das células<ol><li>Para usar uma abordagem de pars plana transvítrea de 1 porta, como feito aqui, execute a injeção sub-retiniana em um ambiente estéril. Use um microscópio cirúrgico vertical com um caminho de luz direto para realizar a injeção.</li>
		<li>Prepare a seringa de vidro de 10 μL removendo o cubo da agulha. Monte a agulha romba 33G na seringa de vidro. Pegue a tampa do cubo de metal e prenda cuidadosamente a agulha na seringa.</li>
		<li>Lave com água destilada para verificar se há sinais de vazamento e patência da agulha. Esvazie a seringa e coloque-a ao lado com cuidado.</li>
		<li>Coloque o rato anestesiado em um travesseiro, com o olho de tratamento olhando diretamente para a objetiva do microscópio. Aplicar o cloridrato de proparacaína a 0,5% e aguardar 30 s. Aplique 150 μL de gel oftálmico no olho e coloque uma tampa redonda sobre ele.</li>
		<li>Realize um exame áspero do olho observando a córnea, íris, pupila, lente e conjuntiva. Através da pupila, visualize o fundo do olho do mouse ajustando o plano focal. Ajuste a cabeça até que a cabeça óptica esteja posicionada no centro da pupila e minimize o movimento da cabeça posicionando-se adequadamente no travesseiro.</li>
		<li>Bata suavemente na base do tubo com as hESCs várias vezes para obter uma suspensão de célula uniforme. Usando a seringa de microlitro de vidro de 10 μL com uma agulha romba 33G, retire 2 μL de células/meio. Retire as células imediatamente antes da injeção para evitar o assentamento/aglomeração celular na seringa.</li>
		<li>Usando uma agulha descartável 30G, faça uma ferida de esclerectomia 2 mm atrás do limbo. Mantenha o ângulo da agulha em ~45° para evitar tocar na lente. Uma vez que a ponta da agulha é visualizada no olho, retire suavemente a agulha. Descarte a agulha no compartimento afiado após o uso para evitar ferimentos por picada de agulha.</li>
		<li>Pegue a seringa de vidro e insira a agulha romba na ferida de esclerectomia. Sem tocar na lente, avance a agulha romba até atingir a retina oposta da ferida de entrada. Certifique-se de que a área de injeção está livre dos principais vasos sanguíneos da retina para evitar hemorragias.</li>
		<li>Penetre suavemente na retina até que um ramo de pressão na esclera seja visto. Mantenha a extremidade romba da agulha paralela à esclera para evitar o vazamento das células para o espaço vítreo.</li>
		<li>Injete lentamente 2 μL de suspensão celular ou meio PRDM (controle) no espaço sub-retiniano enquanto a pressão suave é mantida na seringa. Com uma injeção bem-sucedida, uma mancha visível (ou seja, retina elevada com a suspensão/mídia celular) deve ser formada no local da injeção. NOTA: Apenas uma pressão suave deve ser usada durante a injeção para evitar o rasgo da retina e o bloqueio das células na ponta da agulha.</li>
		<li>Depois de confirmar a bolha, aguarde 10 s para deixar as células se acomodarem. Retraia suavemente a agulha do olho.</li>
	</ol></li>
	<li>Tomografia de coerência óptica (OCT) intraoperatória (OCT) da bolha (opcional)<ol><li>Posicione o olho do mouse para visualizar a mancha sob o microscópio, movendo lentamente a cabeça. Fixe a posição segurando suavemente a cabeça. Nenhuma dilatação pupilar adicional é necessária. Não retire a tampa e o gel no olho. Ele dá uma mídia óptica clara para visualizar o bleb.</li>
		<li>Execute a OCT intraoperatória usando a função iOCT integrada do microscópio cirúrgico.</li>
		<li>Pressione a opção Cubo na tela da OCT e posicione a área de digitalização no bleb pressionando os botões de seta . Ajuste a OCT deslizando Centralização e Foco para obter a melhor qualidade da OCT. Pressione Capturar/Digitalizar para adquirir a varredura da OCT da área de bleb. Revise as imagens para verificar a qualidade das digitalizações.</li>
	</ol></li>
	<li>Recuperação<ol><li>Retire a tampa e limpe o gel do olho com gaze. Aplique pomada antibiótica uma vez após a injeção para prevenir a infecção.</li>
		<li>Permitir que o animal se recupere da anestesia sob uma luz quente até que recupere a consciência suficiente para manter a decúbito esternal e retornar à gaiola de origem. Monitore o animal por pelo menos 3 dias após a injeção em busca de sinais de inflamação, infecção e angústia. NOTA: A luz quente de 150 W deve estar a pelo menos 30 cm de distância da gaiola do animal, e deve-se tomar cuidado para evitar uma lesão por queimadura.</li>
		<li>Administrar uma injeção subcutânea de buprenorfina (0,05 mg/kg) 8 de hora em hora por 1 dia ou por recomendação do veterinário. Se for observada inflamação ou infecção do olho, consulte um profissional veterinário para o tratamento adequado.</li>
	</ol></li>
	<li>Limpeza e esterilização dos instrumentais<ol><li>Lave a seringa de microlitro de vidro de 10 μL e a agulha romba 33G com etanol 100% 10x. Lave o etanol piscando a seringa com água destilada.</li>
		<li>Dissimule a seringa de vidro e a agulha. Seque a seringa para armazenamento.</li>
	</ol></li>
</ol>

Visão revitalizante: terapia com células-tronco para degeneração da retina

Hwee Goon Tay é co-fundador da Alder Therapeutics AB. Outros autores declaram não haver interesses concorrentes.

A injeção sub-retiniana tem sido utilizada para transplante de suspensão celular para tratamento de EPR e doenças retinianas23,25,26,27,28,31,40. Esta abordagem é altamente essencial em estudos com roedores, não apenas para abordagens de transplante celular e terapia gênica, mas tamb?...

Doenças hereditárias da retina e degeneração macular relacionada à idade levam à perda de células fotorreceptoras e eventual cegueira. O fotorreceptor retiniano é a camada do segmento externo da retina composta por células especializadas responsáveis pela fototransdução (isto é, conversão de luz em sinais neuronais). As células fotorreceptoras do bastonete e do cone estão adjacentes à camada pigmentada da retina (EPR)1. A terapia de reposição de células fotorreceptoras para compensar a perda celular tem sido uma abordagem terapêutica emergente e em desenvolvimento. Células-tronco embrionárias (CTEs)2,3,4, células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) derivadas de EPRs e células progenitoras da retina (RPCs)4,5,6,7,8 foram usadas para restaurar as células fotorreceptoras danificadas. O espaço sub-retiniano, um espaço confinado entre a retina e o EPR, é um local atraente para depositar essas células para substituir as células fotorreceptoras danificadas, o EPR e as células de Mueller devido à sua vizinhança9,10,11.
Terapias gênicas e celulares têm utilizado o espaço sub-retiniano para medicina regenerativa para várias doenças retinianas em estudos pré-clínicos. Isso inclui a entrega de cópias funcionais do gene ou ferramentas de edição gênica na forma de terapia anti-senso com oligonucleotídeos12,13 ou CRISPR/Cas9 ou edição de base via estratégia baseada em vírus adenoassociado (AAV) 14,15,16, implantação de materiais (por exemplo, folha de EPR, próteses retinianas 17,18,19) e organoides retinianos derivados de células-tronco diferenciadas 20,21,22 para tratar doenças retinianas e relacionadas à EPR. Ensaios clínicos utilizando hESC-RPE31 no espaço sub-retiniano para tratar amaurose congênita de Leber (LCA) associada ao EPR6523,24, acromatopsia ligada ao CNGA325, retinite pigmentosa associada a MERTK26, coroideremia 27,28,29,30 provaram ser uma abordagem eficaz. A injeção direta de células nas proximidades da área danificada melhora muito a chance de assentamento celular na região apropriada, integração sináptica e eventual melhora visual.
Embora a injeção sub-retiniana em modelos humanos e de olhos grandes (i.e., porco 32,33,34,35, coelho 36,37,38,39,40 e primata não humano 41,42,43) tenha sido estabelecida, tal injeção no modelo murino ainda é desafiadora devido à restrição do tamanho do globo ocular e enorme lente ocupando o olho do rato 44,45,46. No entanto, modelos geneticamente modificados só estão prontamente disponíveis em pequenos animais e não em animais de grande porte (ou seja, coelhos e primatas não humanos), portanto, a injeção sub-retiniana em camundongos chama a atenção para investigar novas abordagens terapêuticas em doenças genéticas da retina. Três abordagens principais estão sendo usadas para entregar células ou AAVs no espaço sub-retiniano: a via transcorneana, a via transescleral e a via pars plana (ver Figura 2). As vias transcórnea e transescleral estão associadas à formação de catarata, sinéquias, sangramento de coroide e refluxo do local da injeção 11,44,45,47,48,49. Adotamos a abordagem pars plana como visualização direta do processo de injeção, e o local de injeção pode ser obtido em tempo real ao microscópio.
Recentemente, descrevemos um método que pode diferenciar células-tronco embrionárias humanas (hESCs) em progenitores fotorreceptores sob condições xenofree, quimicamente definidas, usando a isoforma LN523 recombinante de laminina específica da retina humana. Uma vez que o LN523 estava presente na retina, hipotetizamos que o nicho da matriz extracelular da retina humana poderia ser recapitulado in vitro e, assim, apoiar a diferenciação dos fotorreceptores das hESCs36. A análise transcriptômica de célula única mostrou que progenitores fotorreceptores co-expressando homeobox e recuperatina cone-rod foram gerados após 32 dias. Um modelo mutante de camundongo com degeneração retiniana 10 (rd10) que imita retinose pigmentar humana autossômica foi usado para avaliar a eficácia dos progenitores de fotorreceptores derivados do hESC do dia 32 in-vivo. As células progenitoras do fotorreceptor derivadas do hESC foram injetadas no espaço sub-retiniano de camundongos rd10 em P20, onde a disfunção e a degeneração dos fotoceptores estão em curso36. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a preparação dos progenitores fotorreceptores derivados de hESC pós-criopreservados e liberação no espaço sub-retiniano de camundongos rd10 . Este método também pode ser usado para administrar AAVs, suspensões celulares, peptídeos ou produtos químicos no espaço sub-retiniano em camundongos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.3% Tobramycin</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>NDC &#160;0078-0813-01</td>
			<td>Tobrex (3.5 g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3% Tobramycin and 0.1% Dexamethasone</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>NDC 0078-0876-01</td>
			<td>Tobradex (3.5 g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Proparacaine hydrochloride</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>NDC 0998-0016-15</td>
			<td>0.5% Alcaine (15 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Tuberculin syringe</td>
			<td>Turemo</td>
			<td>SS01T2713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Tropicamide</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>NDC 0998-0355-15</td>
			<td>1% Mydriacyl (15 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Phenylephrine hydrochloride</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>NDC 0998-0342-05</td>
			<td>2.5% Mydfrin (5 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G Disposable needle</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>305128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33 G, 20 mm length blunt needles</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Cell Counter</td>
			<td>NanoEnTek</td>
			<td>Model: Eve</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 without Vitamin A</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12587001</td>
			<td>2%36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Ceva</td>
			<td></td>
			<td>Vetergesic vet (0.3 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CKI-7</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0742</td>
			<td>5 &#181;M36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclosporine</td>
			<td>Novartis</td>
			<td></td>
			<td>260 g/L in drinking water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells</td>
			<td>DUKE-NUS Medical School</td>
			<td></td>
			<td>Human embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>Winner Industries Co. Ltd.</td>
			<td>1SNW475-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow Minimum Essential Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11710&#8211;035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hESC cell line H1</td>
			<td>WiCell Research Institute</td>
			<td>WA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02-50</td>
			<td>10 ng/mL36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ciliary neurotrophic factor (CNTF)</td>
			<td>Prospec-Tany Technogene</td>
			<td>CYT-272</td>
			<td>10 ng/mL36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride (100 mg/mL)</td>
			<td>Ceva Sant&#233; Animale</td>
			<td>KETALAB03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LN-521</td>
			<td>Biolamina</td>
			<td>LN521-02</td>
			<td>1 &#181;g36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mFreSR</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlitre glass syringe (10 mL)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7653-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S2215</td>
			<td>10 &#181;M36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A13707-01</td>
			<td>1%36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids (NEAA)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140&#8211;050</td>
			<td>1x36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NutriStem XF Media</td>
			<td>Satorius</td>
			<td>05-100-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>OPMI LUMERA 700</td>
			<td>With Built-in iOCT function</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml)</td>
			<td>DUKE-NUS Medical School</td>
			<td></td>
			<td>See media composition36. Basal Medium, 10 &#181;M DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 &#181;M Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360&#8211;070</td>
			<td>1 mM36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rd10 mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>B6.CXB1-Pde6brd10/J mice</td>
			<td>Gender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>0695/50</td>
			<td>0.5 &#181;M36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Cover Slip (12 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4317</td>
			<td>0.5 &#181;M36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vidisic Gel (10 g)</td>
			<td>Dr. Gerhard Mann</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine hydrochloride (20 mg/mL)</td>
			<td>Troy Laboratories</td>
			<td>LI0605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21985&#8211;023</td>
			<td>0.1 mM36</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sub-retinal delivery of human embryonic stem cell derived photoreceptor progenitors in rd10 mice

A regeneração de células fotorreceptoras utilizando células-tronco pluripotentes humanas é uma terapia promissora para o tratamento de doenças retinianas hereditárias e envelhecidas em estágios avançados. Mostramos que a matriz isoforme de laminina recombinante específica da retina humana é capaz de apoiar a diferenciação de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) em progenitores fotorreceptores. Além disso, a injeção sub-retiniana dessas células também mostrou restauração parcial nos modelos rd10 de roedores e coelhos. A injeção sub-retiniana é conhecida por ser um método estabelecido que tem sido usado para entregar compostos farmacêuticos às células fotorreceptoras e à camada epitelial pigmentada da retina (EPR) do olho devido à sua proximidade com o espaço alvo. Ele também tem sido usado para entregar vetores virais adenoassociados no espaço sub-retiniano para tratar doenças da retina. A entrega sub-retiniana de compostos farmacêuticos e células no modelo murino é desafiadora devido à restrição no tamanho do globo ocular murino. Este protocolo descreve o procedimento detalhado para a preparação de células progenitoras fotorreceptoras derivadas de hESC para injeção e a técnica de liberação sub-retiniana dessas células em camundongos mutantes genéticos da retinose pigmentosa, rd10. Esta abordagem permite a terapia celular para a área alvo, em particular a camada nuclear externa da retina, onde ocorrem doenças que levam à degeneração dos fotorreceptores.

Inherited retinal diseases and age-related macular degeneration lead to photoreceptor cell loss and eventual blindness. The retinal photoreceptor is the outer segment layer of the retina comprised of specialized cells responsible for phototransduction (i.e., conversion of light to neuronal signals). The rod and cone photoreceptor cells are adjacent to the retinal pigmented layer (RPE)1. Photoreceptor cell replacement therapy to compensate the cell loss has been an emerging and developing therapeutic approach. Embryonic stem cells (ESCs)2,3,4, induced pluripotent stem cells (iPSCs)-derived RPE cells, and retinal progenitor cells (RPCs)4,5,6,7,8 were used to restore the damaged photoreceptor cells. Sub-retinal space, a confined space between the retina and the RPE, is an attractive location to deposit these cells to replace damaged photoreceptor cells, RPE, and Mueller cells due to its vicinity9,10,11.
Gene and cell therapies have been utilizing the sub-retinal space for regenerative medicine for various retinal diseases in pre-clinical studies. This includes the delivery of functional copies of the gene or gene editing tools in the form of either anti-sense oligonucleotide therapy12,13 or CRISPR/Cas9 or base editing via adeno-associated virus (AAV) based strategy14,15,16, implantation of materials (e.g., RPE sheet, retinal prosthetics17,18,19) and differentiated stem cell-derived retinal organoids20,21,22 to treat retinal and RPE-related diseases. Clinical trials using hESC-RPE31 in the sub-retinal space to treat RPE65-associated Leber congenital amaurosis (LCA)23,24, CNGA3-linked achromatopsia25, MERTK-associated retinitis pigmentosa26, choroideremia27,28,29,30 have been proven to be an effective approach. Direct injection of cells to the vicinity of the damaged area greatly improves the chance of cell settlement at the appropriate region, synaptic integration, and eventual visual improvement.
Even though sub-retinal injection in human and large-eyed models (i.e., pig32,33,34,35, rabbit36,37,38,39,40, and non-human primate41,42,43) has been&#160;established, such injection in the murine model is still challenging due to the constrain of the eyeball size and enormous lens occupying the mouse eye44,45,46. However, genetically modified models are only readily available in small animals and not in large animals (i.e., rabbits and non-human primates), therefore sub-retinal injection in mice draws attention to investigate novel therapeutic approaches in retinal genetic disorders. Three major approaches are being used to deliver cells or AAVs into the sub-retinal space, namely the trans-corneal route, trans-scleral route, and the pars plana route (See Figure 2). Trans-corneal and trans-scleral routes are associated with cataract formation, synechiae, choroidal bleeding, and reflux from the injection site11,44,45,47,48,49. We adopted the pars plana approach as a direct visualization of the injection process, and the injection site can be achieved in real-time under the microscope.
We recently described a method that can differentiate human embryonic stem cells (hESCs) into photoreceptor progenitors under xenofree, chemically defined conditions using recombinant human retina-specific laminin isoform LN523. Since LN523 was found to be present in the retina, we hypothesized that the extracellular matrix niche of the human retina could be recapitulated in vitro and thereby support photoreceptor differentiation from the hESCs36. Single-cell transcriptomic analysis showed that photoreceptor progenitors co-expressing cone-rod homeobox and recoverin were generated after 32 days. A retinal degeneration 10 (rd10) mutant mouse model that mimics autosomal human retinitis pigmentosa was used to evaluate the efficacy of the day 32 hESC-derived photoreceptor progenitors in-vivo. The hESC-derived photoreceptor progenitor cells were injected into the sub-retinal space of rd10 mice at P20, where photoceptor dysfunction and degeneration are ongoing36. Here, we describe a detailed protocol for the preparation of the post-cryopreserved hESC-derived photoreceptor progenitors and delivery into the sub-retinal space of rd10 mice. This method can also be used to administer AAVs, cell suspensions, peptides, or chemicals into the sub-retinal space in mice.

Autor em destaque: Avançando na restauração da visão - terapia baseada em células-tronco para doenças da retina 

Liberação Sub-Retiniana de Progenitores de Fotorreceptores Derivados de Células-Tronco Embrionárias Humanas em Camundongos rd10

My research focuses on the development of stem cell based therapy for advanced stages of retinal diseases that cause photoreceptor degeneration. The goal of our research is to replace the loss of photoreceptors in patients with clinically safe and functional photoreceptor progenitors with the aim of improving their visual acuity or even restoring their vision. The main preclinical model is mice, but their small sized eyeball make it challenging to inject materials, especially under the retina.Developing the skill to perform successful subretinal injections requires patience and perseverance. We have successfully developed a laminin base for the receptor differentiation method that is able to generate photoreceptor progenitors in 32 days. The subretinal transplantations of this photoreceptor progenitors cell suspensions in the rodents resulted in synaptic connectivity between the holes and graft in the eyes.This has led to partial visual restoration. Our approach is simple, the right visualization helps the surgeon handle the needle to the area of interest.

A seringa de vidro de 10 μL foi montada de acordo com as instruções do fabricante (Figura 1), e a agulha romba usada para entregar a suspensão/meio celular é mostrada na Figura 1B. Diferentes abordagens para injeção sub-retiniana são ilustradas na Figura 2. Descrevemos a abordagem pars plana neste protocolo (Figura 2C). A agulha romba montada em uma seringa de vidro foi inserida através de uma ...

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Descrevemos um protocolo detalhado para a preparação de células progenitoras fotorreceptoras derivadas de hESC pós-criopreservadas e a liberação sub-retiniana dessas células em camundongos rd10 .

Regeneration of photoreceptor cells using human pluripotent stem cells is a promising therapy for the treatment of both hereditary and aging retinal ...

Minha pesquisa se concentra no desenvolvimento de terapia baseada em células-tronco para estágios avançados de doenças da retina que causam degeneração de fotorreceptores. O objetivo de nossa pesquisa é repor a perda de fotorreceptores em pacientes com progenitores fotorreceptores clinicamente seguros e funcionais, com o objetivo de melhorar sua acuidade visual ou mesmo restaurar sua visão. O principal modelo pré-clínico são camundongos, mas seu globo ocular de tamanho pequeno torna difícil injetar materiais, especialmente sob a retina.Desenvolver a habilidade para realizar injeções sub-retinianas bem-sucedidas requer paciência e perseverança. Desenvolvemos com sucesso uma base de laminina para o método de diferenciação de receptores capaz de gerar progenitores fotorreceptores em 32 dias. Os transplantes sub-retinianos das suspensões de células progenitoras deste fotorreceptor nos roedores resultaram em conectividade sináptica entre os orifícios e o enxerto nos olhos.Isso levou à restauração visual parcial. Nossa abordagem é simples, a visualização correta ajuda o cirurgião a manusear a agulha até a área de interesse.

sub-retinal-delivery-human-embryonic-stem-cell-derived-photoreceptor

Research

JoVE Journal

Medicine

Sub-Retinal Delivery of Human Embryonic Stem Cell Derived Photoreceptor Progenitors in rd10 Mice

665 visualizações.  Singapore Eye Research Institute. Minha pesquisa se concentra no desenvolvimento de terapia baseada em células-tronco para estágios avançados de doenças da retina que causam degeneração de fotorreceptores. O objetivo de nossa pesquisa é repor a perda de fotorreceptores em pacientes com progenitores fotorreceptores clinicamente seguros e funcionais, com o objetivo de melhorar sua acuidade visual ou mesmo restaurar sua visão. O principal modelo pré-clínico são camundongos, mas seu globo ocular de tamanho pequeno torn...