نشكر أعضاء مختبر الدكتور كريستوفر هيوز على مساهمتهم القيمة في الإجراءات الموصوفة ، وكذلك المتعاونين معنا في مختبر الدكتور أبراهام لي لمساعدتهم في تصميم المنصة وتصنيعها. تم دعم هذا العمل من خلال المنح التالية: UG3 / UH3 TR002137 و R61 / R33 HL154307 و 1R01CA244571 و 1R01 HL149748 و U54 CA217378 (CCWH) و TL1 TR001415 و W81XWH2110393 (SJH).

Preparing a Microfluidics-Based Vascularized Human Micro-Tumor Model

<ol>
	<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2023.">Cancer statistics, 2023.</a> CA Cancer J Clin. 73 (1), 17-48 (2023).</li><li>Hachey, S. J., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+tumor+chip+technology.">Applications of tumor chip technology.</a> Lab Chip. 18 (19), 2893-2912 (2018).</li><li>Ewald, M. L., Chen, Y. H., Lee, A. P., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vascular+niche+in+next+generation+microphysiological+systems.">The vascular niche in next generation microphysiological systems.</a> Lab Chip. 21 (17), 3615-3616 (2021).</li><li>Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularized+microfluidic+organ-chips+for+drug+screening,+disease+models+and+tissue+engineering.">Vascularized microfluidic organ-chips for drug screening, disease models and tissue engineering.</a> Curr Opin Biotechnol. 52, 116-123 (2018).</li><li>Shirure, V. S., Hughes, C. C. W., George, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+vascularized+organoid-on-a-chip+models.">Engineering vascularized organoid-on-a-chip models.</a> Annu Rev Biomed Eng. 23, 141-167 (2021).</li><li>Del Piccolo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-on-chip+modeling+of+organ-specific+cancer+and+metastasis.">Tumor-on-chip modeling of organ-specific cancer and metastasis.</a> Adv Drug Deliv Rev. 175, 113798 (2021).</li><li>Sontheimer-Phelps, A., Hassell, B. A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+cancer+in+microfluidic+human+organs-on-chips.">Modelling cancer in microfluidic human organs-on-chips.</a> Nat Rev Cancer. 19 (2), 65-81 (2019).</li><li>Sobrino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+microtumors+in+vitro+supported+by+perfused+vascular+networks.">3D microtumors in vitro supported by perfused vascular networks.</a> Sci Rep. 6, 31589 (2016).</li><li>Phan, D. T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vascularized+and+perfused+organ-on-a-chip+platform+for+large-scale+drug+screening+applications.">A vascularized and perfused organ-on-a-chip platform for large-scale drug screening applications.</a> Lab Chip. 17 (3), 511-520 (2017).</li><li>Hachey, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+vascularized+micro-tumor+model+of+human+colorectal+cancer+recapitulates+in+vivo+responses+to+standard-of-care+therapy.">An in vitro vascularized micro-tumor model of human colorectal cancer recapitulates in vivo responses to standard-of-care therapy.</a> Lab Chip. 21 (7), 1333-1351 (2021).</li><li>Hachey, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Human+Vascularized+Micro-Tumor+Model+of+Patient-Derived+Colorectal+Cancer+Recapitulates+Clinical+Disease.">A Human Vascularized Micro-Tumor Model of Patient-Derived Colorectal Cancer Recapitulates Clinical Disease.</a> Transl Res. 255, 97-108 (2023).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+in+vitro+vascularized+micro-organ+and+micro-tumor+models+are+reproducible+organ-on-a-chip+platforms+for+studies+of+anticancer+drugs.">Human in vitro vascularized micro-organ and micro-tumor models are reproducible organ-on-a-chip platforms for studies of anticancer drugs.</a> Toxicology. 445, 152601 (2020).</li><li>Jahid, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-based+Design+of+CDC42+Effector+Interaction+Inhibitors+for+the+Treatment+of+Cancer.">Structure-based Design of CDC42 Effector Interaction Inhibitors for the Treatment of Cancer.</a> Cell Rep. 39 (4), 110760 (2022).</li><li>Hsu, Y. H., Moya, M. L., Hughes, C. C. W., George, S. C., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+platform+for+generating+large-scale+nearly+identical+human+microphysiological+vascularized+tissue+arrays.">A microfluidic platform for generating large-scale nearly identical human microphysiological vascularized tissue arrays.</a> Lab Chip. 13 (15), 2990-2998 (2013).</li><li>Moya, M. L., Hsu, Y. H., Lee, A. P., Christopher, C. W. H., George, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+perfused+human+capillary+networks.">In vitro perfused human capillary networks.</a> Tissue Eng - Part C: Methods. 19 (9), 730-737 (2013).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+on-chip+microfluidic+pressure+regulator+that+facilitates+reproducible+loading+of+cells+and+hydrogels+into+microphysiological+system+platforms.">An on-chip microfluidic pressure regulator that facilitates reproducible loading of cells and hydrogels into microphysiological system platforms.</a> Lab Chip. 16 (5), 868-876 (2016).</li><li>Phan, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier-on-a-chip:+Microphysiological+systems+that+capture+the+complexity+of+the+blood-central+nervous+system+interface.">Blood-brain barrier-on-a-chip: Microphysiological systems that capture the complexity of the blood-central nervous system interface.</a> Exp Biol Med. 242 (17), 1669-1678 (2017).</li><li>Kurokawa, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+endothelial+cells+for+three-dimensional+microphysiological+systems.">Human induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells for three-dimensional microphysiological systems.</a> Tissue Eng Part C: Methods. 23 (8), 474-484 (2017).</li><li>Romero-L&#243;pez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+the+human+tumor+microenvironment:+Colon+tumor-derived+extracellular+matrix+promotes+angiogenesis+and+tumor+cell+growth.">Recapitulating the human tumor microenvironment: Colon tumor-derived extracellular matrix promotes angiogenesis and tumor cell growth.</a> Biomaterials. 116, 118-129 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+Image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: Image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).</li><li>Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+tool+for+quantitative+analysis+of+vascular+networks.">A computational tool for quantitative analysis of vascular networks.</a> PLoS one. 6 (11), e27385 (2011).</li><li>Corliss, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REAVER:+A+program+for+improved+analysis+of+high-resolution+vascular+network+images.">REAVER: A program for improved analysis of high-resolution vascular network images.</a> Microcirculation. 27 (5), e12618 (2020).</li><li>Urban, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+learning+for+drug+discovery+and+cancer+research:+Automated+analysis+of+vascularization+images.">Deep learning for drug discovery and cancer research: Automated analysis of vascularization images.</a> IEEE/ACM Trans Comput Biol Bioinform. 16 (3), 1029-1035 (2019).</li></ol>

لدى CCWH حصة في الأسهم في شركة Aracari Biosciences، Inc. ، التي تقوم بتسويق نسخة من التكنولوجيا الموصوفة في هذه الورقة. تمت مراجعة شروط هذا الترتيب والموافقة عليها من قبل جامعة كاليفورنيا ، إيرفين ، وفقا لسياسات تضارب المصالح الخاصة بها. لا يوجد تضارب آخر في المصالح.

يتلقى كل نسيج في الجسم تقريبا العناصر الغذائية والأكسجين من خلال الأوعية الدموية ، مما يجعله مكونا حاسما لنمذجة المرض الواقعية وفحص الأدوية في المختبر. علاوة على ذلك ، يتم تعريف العديد من الأورام الخبيثة وحالات المرض من خلال خلل وظيفي في بطانة الأوعية الدموية وفرط النفاذية...

لا يزال السرطان مصدر قلق صحي كبير في جميع أنحاء العالم وهو السبب الرئيسي الثاني للوفاة في الولايات المتحدة. بالنسبة لعام 2023 وحده ، يتوقع المركز الوطني للإحصاءات الصحية حدوث أكثر من 1.9 مليون حالة سرطان جديدة وأكثر من 600000 حالة وفاة بالسرطان في الولايات المتحدة1 ، مما يسلط الضوء على الحاجة الملحة لنهج علاجية فعالة. ومع ذلك ، في الوقت الحالي ، فإن 5.1٪ فقط من العلاجات المضادة للسرطان التي تدخل التجارب السريرية تحصل في النهاية على موافقة إدارة الغذاء والدواء. يمكن أن يعزى فشل المرشحين الواعدين في التقدم بنجاح من خلال التجارب السريرية جزئيا إلى استخدام أنظمة النماذج غير الفسيولوجية ، مثل 2D والثقافات الكروية ، أثناء تطوير الأدوية قبل السريرية2. تفتقر نماذج السرطان الكلاسيكية هذه إلى المكونات الأساسية للبيئة المكروية للورم ، مثل مكانة اللحمة ، والخلايا المناعية المرتبطة بها ، والأوعية الدموية المثقوبة ، والتي تعد محددات رئيسية للمقاومة العلاجية وتطور المرض. وبالتالي ، فإن نظاما نموذجيا جديدا يحاكي بشكل أفضل البيئة المكروية للورم البشري في الجسم الحي ضروري لتحسين الترجمة السريرية للنتائج قبل السريرية.
يتقدم مجال هندسة الأنسجة بسرعة ، مما يوفر طرقا محسنة لدراسة الأمراض البشرية في البيئات المختبرية. أحد التطورات المهمة هو ظهور الأنظمة الفسيولوجية الدقيقة (MPS) ، والمعروفة أيضا باسم رقائق الأعضاء أو رقائق الأنسجة ، وهي أعضاء بشرية وظيفية مصغرة قادرة على تكرار الحالات الصحية أو المريضة3،4،5. في هذا السياق ، تم تطوير رقائق الورم ، وهي نماذج أورام بشرية ثلاثية الأبعاد تعتمد على الموائع الدقيقة في المختبر ، لأبحاث الأورام2،3،4،5،6،7،8،9،10،11،12،13. تتضمن هذه النماذج المتقدمة إشارات كيميائية حيوية وفيزيائية حيوية داخل بيئة دقيقة ديناميكية للورم ، مما يمكن الباحثين من دراسة سلوك الورم والاستجابات للعلاجات في سياق أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية. ومع ذلك ، على الرغم من هذه التطورات ، نجحت مجموعات قليلة في دمج الأوعية الدموية الحية والوظيفية ، لا سيما تلك التي تتبع الأنماط الذاتية استجابة للتدفق الفسيولوجي3،4،5،6. يعد تضمين شبكة الأوعية الدموية الوظيفية أمرا بالغ الأهمية لأنه يسمح بنمذجة الحواجز المادية التي تؤثر على توصيل الدواء أو الخلايا ، وتوجيه الخلايا إلى بيئات دقيقة متميزة ، والهجرة عبر البطانية للورم والخلايا اللحمية والخلايا المناعية. من خلال تضمين هذه الميزة ، يمكن لشريحة الورم أن تمثل بشكل أفضل التعقيدات التي لوحظت في البيئة المكروية للورم في الجسم الحي .
لتلبية هذه الحاجة غير الملباة ، قمنا بتطوير منصة جديدة لفحص الأدوية تمكن شبكات الأوعية الدقيقة من التشكل داخل جهاز الموائع الدقيقة8،9،10،11،12،13،14،15،16. يمكن تكييف منصة رقاقة الأعضاء الأساسية هذه ، والتي يطلق عليها اسم العضو الدقيق الوعائي (VMO) ، مع أي نظام عضوي تقريبا لتكرار فسيولوجيا الأنسجة الأصلية لنمذجة الأمراض وفحص الأدوية وتطبيقات الطب الشخصي. يتم إنشاء VMOs عن طريق الزراعة المشتركة للخلايا البطانية المشتقة من الخلايا المكونة للمستعمرة البطانية (ECFC-EC) ، HUVEC أو iPSC-EC (المشار إليها فيما يلي باسم EC) ، والخلايا اللحمية المتعددة في الغرفة ، بما في ذلك الخلايا الليفية الرئوية البشرية الطبيعية (NHLF) ، التي تعيد تشكيل المصفوفة ، والخلايا المحيطة التي تلف الأوعية وتستقرها. يمكن أيضا إنشاء VMO كنظام نموذجي للسرطان عن طريق زراعة الخلايا السرطانية مع السدى المرتبط بها لإنشاء ورم دقيق وعائي (VMT) 8،9،10،11،12،13 ، أو نموذج رقاقة الورم. من خلال الثقافة المشتركة لأنواع متعددة من الخلايا في بيئة تدفق ديناميكية ، تتشكل شبكات الأوعية الدموية الدقيقة المثقوبة من جديد في غرف الأنسجة بالجهاز ، حيث يتم تنظيم تكوين الأوعية الدموية عن كثب من خلال معدلات التدفق الخلالي14,15. يتم دفع الوسط عبر قنوات الموائع الدقيقة للجهاز بواسطة رأس ضغط هيدروستاتيكي يزود الخلايا المحيطة بغرفة الأنسجة بالمغذيات حصريا من خلال الأوعية الدقيقة ، مع معامل نفاذية يبلغ 1.2 × 10-7 سم / ثانية ، على غرار ما يظهر للشعيرات الدموية في الجسم الحي8.
يمثل دمج الأوعية الدقيقة ذاتية التنظيم في نموذج VMT إنجازا كبيرا لأنه: 1) يحاكي بنية ووظيفة كتل الورم الوعائية في الجسم الحي. 2) يمكن نمذجة الخطوات الرئيسية للورم الخبيث ، بما في ذلك تفاعلات الخلايا البطانية والورم ؛ 3) يضع حواجز انتقائية من الناحية الفسيولوجية لتوصيل المغذيات والأدوية ، وتحسين الفحص الصيدلاني ؛ و 4) يسمح بالتقييم المباشر للأدوية ذات القدرات المضادة لتولد الأوعية ومكافحة النقيلي. من خلال تكرار التسليم في الجسم الحي للمغذيات والأدوية والخلايا المناعية في بيئة دقيقة 3D معقدة ، فإن منصة VMO / VMT هي نموذج ذي صلة من الناحية الفسيولوجية يمكن استخدامه لإجراء فحص الأدوية ودراسة السرطان أو الأوعية الدموية أو البيولوجيا الخاصة بالأعضاء. الأهم من ذلك ، أن VMT يدعم نمو أنواع مختلفة من الأورام ، بما في ذلك سرطان القولون ، وسرطان الجلد ، وسرطان الثدي ، والورم الأرومي الدبقي ، وسرطان الرئة ، وسرطان البريتوني ، وسرطان المبيض ، وسرطان البنكرياس8،9،10،11،12،13. بالإضافة إلى كونها منخفضة التكلفة ، وسهلة التأسيس ، ومصفوفة للتجارب عالية الإنتاجية ، فإن منصة الموائع الدقيقة متوافقة بصريا تماما لتحليل الصور في الوقت الفعلي للتفاعلات بين الورم وانسجة والاستجابة للمنبهات أو العلاجات. يتم تمييز كل نوع من الخلايا في النظام بعلامة فلورسنت مختلفة للسماح بالتصور المباشر وتتبع سلوك الخلية طوال التجربة بأكملها ، مما يخلق نافذة على البيئة المكروية الديناميكية للورم. لقد أظهرنا سابقا أن VMT أكثر دقة في نمو الورم الحي ، والهندسة المعمارية ، وعدم التجانس ، وتوقيعات التعبير الجيني ، واستجابات الأدوية من طرائق الثقافة القياسية10. الأهم من ذلك ، أن VMT يدعم نمو ودراسة الخلايا المشتقة من المريض ، بما في ذلك الخلايا السرطانية ، والتي تقدم نماذج أفضل لأمراض الأورام الأم من الثقافات الكروية القياسية وتزيد من تقدم جهود الطب الشخصي11. توضح هذه المخطوطة طرق إنشاء VMT ، وتعرض فائدتها في دراسة السرطانات البشرية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fabrication</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane, 95%&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>175617-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Bio-One&#160;&#956;Clear Bottom 96-well Polystyrene Microplates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol &#8805;99.8% ACS</td>
			<td>VWR Chemicals BDH</td>
			<td>BDH1135-1LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MILTEX Sterile Disposable Biopsy Punch with Plunger, 1mm diameter,</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>33-31AA-P/25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS membrane</td>
			<td>PAX Industries</td>
			<td>HT-6240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner PDC-001</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smooth-Cast 385</td>
			<td>Smooth-On</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP Bel-Art Lab Companion Clear Polycarbonate Cabinet Style Vacuum Desiccator</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F42400-4031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Lids with Condensation Rings, 96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)</td>
			<td>Dow</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture/Loading</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek Lionheart FX Automated Microscope</td>
			<td>Agilent&#160;</td>
			<td>CYT5MFAW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLvo Human Endothelial Progenitor Cells</td>
			<td>StemBioSys</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum (type 4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Hank&#8217;s Balanced Salt Solution, 1X without calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-021-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10013CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen from bovine plasma</td>
			<td>Neta Scientific</td>
			<td>SIAL-341573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin human plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate&#8211;dextran (70kDa)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>FD70S-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase from sheep testes (type 4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin Mouse Protein</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>23017015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHLF &#8211; Normal Human Lung Fibroblasts</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 4% in 0.1M Phosphate BufferSaline, pH 7.4</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td>15735-90-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBMCs - Peripheral blood mononuclear cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated</td>
			<td>Avantor Seradigm</td>
			<td>97068-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P10144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-RNA Microprep Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (Electrophoresis),</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vasculife</td>
			<td>Lifeline Cell Technology</td>
			<td>LL-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing a physiologic human vascularized micro-tumor model for cancer research

لا يزال الافتقار إلى نماذج السرطان التي تم التحقق من صحتها والتي تلخص البيئة المكروية للورم للسرطانات الصلبة في المختبر يمثل عنق زجاجة كبير لأبحاث السرطان قبل السريرية والتطوير العلاجي. للتغلب على هذه المشكلة ، قمنا بتطوير الورم المجهري الوعائي (VMT) ، أو رقاقة الورم ، وهو نظام فسيولوجي دقيق يقوم بشكل واقعي بنمذجة البيئة المكروية المعقدة للورم البشري. يتشكل VMT من جديد داخل منصة الموائع الدقيقة من خلال الزراعة المشتركة لأنواع متعددة من الخلايا البشرية في ظل ظروف التدفق الفسيولوجي الديناميكي. يشتمل هذا البناء الهندسي للورم الدقيق المصمم على الأنسجة على شبكة أوعية دموية حية تدعم كتلة الورم المتنامية تماما كما تفعل الأوعية المشكلة حديثا في الجسم الحي. الأهم من ذلك ، يجب أن تعبر الأدوية والخلايا المناعية الطبقة البطانية للوصول إلى الورم ، ونمذجة الحواجز الفسيولوجية في الجسم الحي أمام التسليم العلاجي والفعالية. نظرا لأن منصة VMT شفافة بصريا ، يمكن تحقيق تصوير عالي الدقة للعمليات الديناميكية مثل تسرب الخلايا المناعية وورم خبيث من خلال التصور المباشر للخلايا ذات العلامات الفلورية داخل الأنسجة. علاوة على ذلك ، يحتفظ VMT بعدم تجانس الورم في الجسم الحي ، وتوقيعات التعبير الجيني ، والاستجابات الدوائية. يمكن تكييف أي نوع من الأورام تقريبا مع المنصة ، وتنمو الخلايا الأولية من الأنسجة الجراحية الطازجة وتستجيب للعلاج الدوائي في VMT ، مما يمهد الطريق نحو الطب الشخصي حقا. هنا ، يتم تحديد طرق إنشاء VMT واستخدامه لأبحاث الأورام. يفتح هذا النهج المبتكر إمكانيات جديدة لدراسة الأورام والاستجابات الدوائية ، مما يوفر للباحثين أداة قوية لتطوير أبحاث السرطان.

Cancer remains a major health concern worldwide and is the second leading cause of death in the United States. For the year 2023 alone, the National Center for Health Statistics anticipates more than 1.9 million new cancer cases and over 600,000 cancer deaths occurring in the US1, highlighting the urgent need for effective treatment approaches. However, currently, only 5.1% of anti-cancer therapeutics entering clinical trials ultimately gain FDA approval. Failure of promising candidates to successfully progress through clinical trials can be partially attributed to the use of non-physiological model systems, such as 2D and spheroid cultures, during preclinical drug development2. These classical cancer models lack essential components of the tumor microenvironment, such as a stromal niche, associated immune cells, and perfused vasculature, which are key determinants of therapeutic resistance and disease progression. Thus, a new model system that better mimics the human in vivo tumor microenvironment is necessary to improve the clinical translation of preclinical findings.
The field of tissue engineering is rapidly advancing, providing improved methods for studying human diseases in laboratory settings. One significant development is the emergence of microphysiological systems (MPS), also known as organ chips or tissue chips, which are functional, miniaturized human organs capable of replicating healthy or diseased conditions3,4,5. Within this context, tumor chips, which are three-dimensional microfluidic-based in vitro human tumor models, have been developed for oncology research2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. These advanced models incorporate biochemical and biophysical cues within a dynamic tumor microenvironment, enabling researchers to study tumor behavior and responses to treatments in a more physiologically relevant context. However, despite these advancements, few groups have successfully incorporated a living, functional vasculature, particularly one that self-patterns in response to physiologic flow3,4,5,6. The inclusion of a functional vascular network is crucial as it allows for modeling physical barriers that affect drug or cell delivery, cell homing to distinct microenvironments, and transendothelial migration of tumor, stromal, and immune cells. By including this feature, the tumor chip can better represent the complexities observed in the in vivo tumor microenvironment.
To address this unmet need, we have developed a novel drug-screening platform that enables micro-vessel networks to form within a microfluidic device8,9,10,11,12,13,14,15,16. This base organ chip platform, termed the vascularized micro-organ (VMO), can be adapted to virtually any organ system to replicate original tissue physiology for disease modeling, drug screening, and personalized medicine applications. VMOs are established by co-culturing endothelial colony-forming cell-derived endothelial cells (ECFC-EC), HUVEC or iPSC-EC (hereafter EC), and multiple stromal cells in the chamber, including normal human lung fibroblasts (NHLF), which remodel the matrix, and pericytes that wrap and stabilize the vessels. The VMO can also be established as a cancer model system by co-culturing tumor cells with the associated stroma to create a vascularized micro-tumor (VMT)8,9,10,11,12,13, or tumor chip, model. Through the co-culture of multiple cell types in a dynamic flow environment, perfused microvascular networks form de novo in the tissue chambers of the device, where vasculogenesis is closely regulated by interstitial flow rates14,15. Medium is driven through the microfluidic channels of the device by a hydrostatic pressure head that supplies the surrounding cells of the tissue chamber with nutrients exclusively through the micro-vessels, with a permeability coefficient of 1.2 x 10-7 cm/s, similar to what is seen for capillaries in vivo8.
The incorporation of self-organizing micro-vessels into the VMT model represents a significant breakthrough because it: 1) mimics the structure and function of vascularized tumor masses in vivo; 2) can model key steps of metastasis, including tumor-endothelial and stromal cell interactions; 3) establishes physiologically selective barriers for nutrient and drug delivery, improving pharmaceutical screening; and 4) allows direct assessment of drugs with anti-angiogenic and anti-metastatic capabilities. By replicating the in vivo delivery of nutrients, drugs, and immune cells in a complex 3D microenvironment, the VMO/VMT platform is a physiologically relevant model that can be used to perform drug screening and study cancer, vascular or organ-specific biology. Importantly, the VMT supports the growth of various types of tumors, including colon cancer, melanoma, breast cancer, glioblastoma, lung cancer, peritoneal carcinomatosis, ovarian cancer, and pancreatic cancer8,9,10,11,12,13. In addition to being low-cost, easily established, and arrayed for high throughput experiments, the microfluidic platform is fully optically compatible for real-time image analysis of tumor-stromal interactions and response to stimuli or therapeutics. Each cell type in the system is labeled with a different fluorescent marker to allow direct visualization and tracking of cell behavior throughout the entire experiment, creating a window into the dynamic tumor microenvironment. We have previously shown that the VMT more faithfully models in vivo tumor growth, architecture, heterogeneity, gene expression signatures, and drug responses than standard culture modalities10. Importantly, the VMT supports the growth and study of patient-derived cells, including cancer cells, which better models the pathology of the parent tumors than standard spheroid cultures and further advances personalized medicine efforts11. This manuscript outlines the methods for establishing the VMT, showcasing its utility for studying human cancers.

Author Spotlight: Creating Human Vascularized Micro-Tumors as Models for Translational Cancer Research 

إنشاء نموذج فسيولوجي للأورام الدقيقة الوعائية البشرية لأبحاث السرطان

باتباع البروتوكولات الموضحة هنا ، تم إنشاء VMOs و VMTs باستخدام EC و NHLF المشتراة تجاريا ، وبالنسبة ل VMT ، خط خلايا سرطان الثدي الثلاثي السلبي MDA-MB-231. كما تم دمج VMOs الراسخة مع الخلايا السرطانية لتقليد ورم خبيث. في كل نموذج ، بحلول اليوم 5 من الثقافة المشتركة ، تتجمع شبكة الأوعية الدموية ذاتيا استجا?...

Watch this Scientific Journal Video about Creating Human Vascularized Micro-Tumors as Models for Translational Cancer Research at JoVE.com

يقدم هذا البروتوكول نموذجا ذا صلة من الناحية الفسيولوجية للورم على الرقاقة لإجراء أبحاث السرطان البشري الأساسية والتحويلية عالية الإنتاجية ، وتطوير فحص الأدوية ، ونمذجة الأمراض ، ومناهج الطب الشخصي مع وصف لإجراءات التحميل والصيانة والتقييم.

A lack of validated cancer models that recapitulate the tumor microenvironment of solid cancers in vitro remains a significant bottleneck for preclinical ...

تم تطوير منصة الورم على الرقاقة الخاصة بنا لنمذجة نمو الأورام الدقيقة الوعائية البشرية من الناحية الفسيولوجية ، وتسمح لنا بالإجابة على أسئلة البحث الأساسية والانتقالية. الأسئلة التي تركز على بيولوجيا الورم الأساسية ، وفعالية الدواء ، واستجابة الورم ، والعمليات المناعية الأساسية ، والتدخل المناعي المحتمل ، ونهج العلاج الشخصي. تتوقف الترجمة الفعالة للاكتشافات قبل السريرية إلى علاجات قوية للسرطان على تكرار حالة المرض وأنظمة النماذج بأمانة.يحدد هذا البروتوكول إنشاء الورم المجهري الوعائي ، أو VMT ، لتقليد البيئة المكروية للورم في المختبر. يستنسخ VMT بأمانة الجوانب الرئيسية للورم البشري ، مما يؤدي إلى نتائج ذات صلة سريريا. يسمح لنا نموذجنا بإجراء أبحاث السرطان البشري ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية.على وجه التحديد ، يتضمن بروتوكولنا ، على عكس النماذج الأخرى ، ظروف التدفق الديناميكية ، ويتيح تكامل الخلايا المناعية والعلاج المناعي ، ويسمح لنا أيضا بدمج مناهج الطب الشخصي. نحن نستخدم نموذج VMT لدفع مبادرات الطب الشخصي إلى الأمام في كل من المجالات قبل السريرية والسريرية. يعمق هذا النموذج فهمنا للعوامل البيئية الدقيقة في تفاعلات الخلايا ، مما يؤثر على المقاومة العلاجية وتطور السرطان.علاوة على ذلك ، فإن VMT يبشر بالخير في اكتشاف علاجات مخصصة خاصة بالمريض لتعزيز الرعاية السريرية.

establishing-physiologic-human-vascularized-micro-tumor-model-for

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacokinetics and Pharmacodynamics

Cancer Research

Unit 1

Establishing a Physiologic Human Vascularized Micro-Tumor Model for Cancer Research

Pharmacokinetics: Drug Biotransformation

SCIENTISTS IN ACTION

1.2K Views.  University of California, Irvine. تم تطوير منصة الورم على الرقاقة الخاصة بنا لنمذجة نمو الأورام الدقيقة الوعائية البشرية من الناحية الفسيولوجية ، وتسمح لنا بالإجابة على أسئلة البحث الأساسية والانتقالية. الأسئلة التي تركز على بيولوجيا الورم الأساسية ، وفعالية الدواء ، واستجابة الورم ، والعمليات المناعية ...

Video: Author Spotlight: Creating Human Vascularized Micro-Tumors as Models for Translational Cancer Research 

A lack of validated cancer models that recapitulate the tumor microenvironment of solid cancers in vitro remains a significant bottleneck for preclinical cancer research and therapeutic development.&#160;To overcome this problem, we have developed the vascularized microtumor (VMT), or tumor chip, a microphysiological system that realistically models the complex human tumor microenvironment. The VMT forms de novo within a microfluidic platform by co-culture of multiple human cell types under dynamic, physiological flow conditions. This tissue-engineered micro-tumor construct incorporates a living perfused vascular network that supports the growing tumor mass just as newly formed vessels do in vivo. Importantly, drugs and immune cells must cross the endothelial layer to reach the tumor, modeling in vivo physiological barriers to therapeutic delivery and efficacy. Since the VMT platform is optically transparent, high-resolution imaging of dynamic processes such as immune cell extravasation and metastasis can be achieved with direct visualization of fluorescently labeled cells within the tissue. Further, the VMT retains in vivo tumor heterogeneity, gene expression signatures, and drug responses. Virtually any tumor type can be adapted to the platform, and primary cells from fresh surgical tissues grow and respond to drug treatment in the VMT, paving the way toward truly personalized medicine. Here, the methods for establishing the VMT and utilizing it for oncology research are outlined. This innovative approach opens new possibilities for studying tumors and drug responses, providing researchers with a powerful tool to advance cancer research.

This protocol presents a physiologically relevant tumor-on-a-chip model to perform high-throughput basic and translational human cancer research, advancing drug screening, disease modeling, and personalized medicine approaches with a description of loading, maintenance, and evaluation procedures.

Preparing a Vascularized Micro-Tumor System Using Human Cells for Studying Tumors and Drug Responses 

To begin, place the HBSS cell dissociation reagent EGM-2 and DMEM in a 37 degree Celsius water bath for 10 to 15 minutes. Thaw thrombin and laminin overnight at 4 degrees Celsius and fibrinogen at room temperature. Add 1.5 microliters of thrombin into a 500 microliter microcentrifuge tube.Place a UV sterilized high-throughput plates into a desiccator for 30 minutes to remove air trapped in the microfluidics. Place the T75 flask under the microscope at 4x magnification to confirm cell confluency and transduction efficiency. Wash the cells twice with five milliliters of HBSS.Then, add one milliliter of dissociation reagent to the flask and incubate at 37 degrees Celsius with 5%carbon dioxide for one to two minutes. Gently tap the flask using the palm and observe under the microscope that all cells have been lifted. Wash the cells with nine milliliters of appropriate media and collect suspension to a 15-milliliter conical tube.Immediately remove a small aliquot and count the cells. Centrifuge the cell suspension at 300G and four degrees Celsius for three to five minutes. Then, remove the supernatant and resuspend the pellet in appropriate media on ice.Using the given equation, calculate the number of cells needed. Resuspend the cells at a concentration of 1 times 10 to the 6 cells per milliliter, and calculate the volume of cells needed using the following equation. Centrifuge the required volume of cell suspension as demonstrated.Then, in a calculated volume of fibrinogen, resuspend the pellet on ice.

تحضير نظام الأورام الدقيقة الوعائية باستخدام الخلايا البشرية لدراسة الأورام والاستجابات الدوائية 

Introducing Human Cells into a Microfluidic Device to Investigate Tumor Progression in a Vascularized Micro-Tumor System

To begin, place the UV-sterilized high-throughput plates and thrombin aliquots into the tissue culture hood. Place the prepared cell fibrin mix on ice to slow clotting. Using a P20 pipette, draw six microliters of the cell fibrin mix.Then gently place the pipette tip into the thrombin aliquot and mix twice without introducing air bubbles. Lift the high-throughput plate at an angle and quickly insert the pipette tip into one of the loading ports. Push the pipette plunger to the first stop in a smooth and fluid motion and inject the cell fibrin mix into the tissue chamber.Ensure the gel crosses entirely through the chamber. Gently place the plate flat without removing the pipette tip or displacing the pipette. Remove the pipette tip using a hand from the P20 and leave it in the loading port hole.After two minutes, remove the pipette tips with gentle twisting motions from the loading ports and place the lid on the plate. Incubate the plate for 15 to 20 minutes at 37 degrees Celsius for gel polymerization. Place the microfluidic device on the microscope stage to observe the even distribution of cells throughout the chamber without any air bubbles.Insert the P20 pipette tip into M1 or M3 and expel four microliters of laminin slowly to coat the entire top panel. Remove the pipette tip as demonstrated previously and incubate the plate at 37 degrees Celsius in 5%carbon dioxide for 10 minutes. Add 275 microliters of EGM-2 complete media to the uncoupled reservoirs of wells located in rows A and B.Insert the P200 pipette tip into the media inlet hole of the wells containing 275 microliters of EGM-2 and slowly expel 75 microliters of medium, watching the media travel through the channel and bubble up on the other side.After removing the pipette tip, push the remaining media from the tip into the media reservoir. Add 50 microliters of media to entirely cover the low side wells in rows G and H.Incubate the plates for one to two hours as demonstrated. Under a microscope, identify any bubbles in the media channels and remove them by reintroducing 75 microliters of media into the channels.Check medium inlets or outlets for air bubbles using the naked eye. Then insert the P200 pipette tip into the hole and pull the bubble out by lifting the plunger. In vascularized micro-organs or VMOs, endothelial cells initially distributed evenly within the tissue chamber but by day two, they began to stretch out and luminize.By day four, the endothelial cells anastomosed with the outer microfluidic channels, forming a continuous vascular network. The tight vascular barrier function was confirmed by perfusing FITC-dextran through the microvascular network with minimal leakage. Perfusing MDA-MB-231 cancer cells into the VMOs resulted in their adherence to the endothelial lining and subsequent extravasation into the extracellular space, forming multiple micrometastases within 24 hours post-perfusion.Through time-lapse microscopic imaging, the extravasation of T-cells into the extracellular space of the VMOs was observed over 45 minutes. In vascularized micro-tumors with fully-formed vessels, T-cells rapidly adhered to the vascular wall upon perfusion.