يتم دعم مختبر GSCh جزئيا من خلال منحة IN201222 من برنامج دعم ومشاريع البحث والابتكار التكنولوجي (PAPIIT) ، المديرية العامة ل Asuntos del Personal Académico - UNAM.

تم تخطيط هذا الإجراء في الشكل التكميلي 1. يتم سرد الكواشف والمعدات المستخدمة للدراسة في جدول المواد.
1. الكشف عن mRL و dRL في طافات ثقافة P. aeruginosa باستخدام TLC
<ol><li>ابدأ بمرق الطرد المركزي لسلالة P. aeruginosa ذات الأهمية ، المزروعة في وسط سائل لمدة 24 ساعة (للوصول إلى المرحلة الثابتة من النمو حيث يتم إنتاج RL). عادة ، تحتوي هذه الثقافات على 1 × 109 بكتيريا لكل مل.</li>
	<li>اضبط الرقم الهيدروجيني للثقافة على 2 باستخدام حمض الهيدروكلوريك المركز.</li>
	<li>ضع 5 مل من طاف الثقافة المحمض في أنبوب بولي بروبيلين سعة 50 مل وأضف 5 مل من الكلوروفورم 2: 1: خليط الميثانول.</li>
	<li>حرك الأنبوب عن طريق الانقلاب ثلاث مرات ، في كل مرة لمدة 10 ثوان ، واترك الأنبوب بدون انعكاس لمدة 2 دقيقة بين كل تحريض.</li>
	<li>اترك الأنبوب دون تحريكه لمدة 3 ساعات تقريبا حتى يتم فصل المرحلتين ، أو قم بطرد الأنبوب لمدة 10 دقائق عند 3000 × جم عند 4 درجات مئوية.</li>
	<li>انقل المرحلة العضوية (الطبقة السفلية) إلى أنبوب نظيف واترك الأنبوب في شفاط استخراج حتى يحدث الجفاف.</li>
	<li>كرر العملية بدءا من الخطوة 1.3 ، ووضع المرحلة العضوية من الكلوروفورم الثاني: استخراج الميثانول ، في الأنبوب الذي تم استخدامه في الاستخراج الأول.</li>
	<li>تبخر المرحلة العضوية حتى يتبقى 1 مل أو 1.5 مل. انقل هذا الحجم إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل وتبخر المذيب حتى يجف طوال الليل.</li>
	<li>أضف 50 ميكرولتر من الميثانول إلى الأنبوب المجفف لإعادة تعليق RL.</li>
	<li>أداء كروماتوغرافيا طبقة رقيقة على لوحات هلام السيليكا. ملاحظة: يجب قطع حجم لوحة TLC وفقا لعدد العينات التي سيتم تحليلها. يجب تطبيق كل عينة على ارتفاع 1.5 سم ، ويجب أن تكون نقطة التطبيق 1 سم من حافة اللوحة (ارسم خطا أفقيا بقلم رصاص).</li>
	<li>ضع 5 ميكرولتر من كل عينة باستخدام ماصة دقيقة 10 ميكرولتر.</li>
	<li>يتكون الطور السائل TLC من خليط 65: 15: 2 من الكلوروفورم: الميثانول: حمض الخليك. لتحضير 35 mL من هذا الخليط، اخلطي 26 mL من الكلوروفورم، و6 mL من الميثانول، و0.8 mL من محلول مخزون 20٪ من حمض الأسيتيك. امزج هذه المذيبات وضعها في غرفة TLC المغلقة لمدة 10 دقائق على الأقل قبل بدء الكروماتوغرافيا ، بحيث يكون الجو مشبعا بالمذيبات المتطايرة.</li>
	<li>ضع لوحة TLC في الغرفة ، وتجنب ملامسة النقطة التي تم فيها تطبيق العينات.</li>
	<li>أغلق الحجرة واترك TLC حتى يصل المذيب إلى 1 سم قبل حافة اللوحة. في هذه المرحلة ، قم بإزالة اللوحة واتركها تجف (يمكن تطبيق تدفق الهواء لتسريع العملية).</li>
	<li>تحضير محلول α-النفثول عن طريق إذابة 5 غرام من هذا المركب في 33 مل من الإيثانول. بمجرد إذابته ، أضف 127.5 مل من الإيثانول ، و 12.6 مل من الماء ، و 20.5 مل من H2SO4 الباردة.</li>
	<li>للكشف عن وجود mRL و dRL ، رش محلول α-naphthol على اللوحة في شفاط الاستخراج وضع اللوحة التي تم رشها في فرن على حرارة 85 درجة مئوية لعدة دقائق حتى تظهر العلامة الوردية ل RL.</li>
	<li>استخدم صورة TLC لحساب نسبة أحادي وثنائي RL الموجودة في كل عينة باستخدام برنامج يكتشف كثافة كل بقعة.</li>
</ol>2. القياس الكمي للكمية الإجمالية ل RL التي تقيس مكافئات rhamnose الموجودة في الفاعل بالسطح الحيوي
<ol><li>ضع 1.2 مل من مزرعة الطور الثابت (نمت لمدة 24 ساعة) في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل وجهاز طرد مركزي لمدة 3 دقائق عند 3000 × جم عند 4 درجات مئوية. جمع طاف في أنبوب نظيف.</li>
	<li>انقل 333 ميكرولتر إلى أنبوب نظيف (نفذ هذه الخطوة في ثلاث نسخ) وأضف 1 مل من الأثير.</li>
	<li>مزيج بقوة في دوامة لمدة 30 ثانية. كرر هذا الإجراء مع أنبوب واحد في كل مرة.</li>
	<li>جهاز طرد مركزي لمدة 2 دقيقة عند 3000 × جم عند 4 درجات مئوية. اجمع المرحلة العضوية (المرحلة العليا) ، وانقلها إلى أنبوب نظيف ، واتركها مفتوحة في غطاء الاستخراج حتى يحدث الجفاف.</li>
	<li>كرر الاستخراج باستخدام الأثير كما هو موضح في الخطوة 2.2. كرر الخطوتين 2.3 و2.4.</li>
	<li>بمجرد أن يجف تماما ، أضف 1 مل من الماء إلى كل أنبوب. اترك الأنابيب لمدة 12 ساعة للسماح ل RL بالترطيب ، ثم قم بتحريكها بقوة في الدوامة.</li>
	<li>ضع قارورة نظيفة في الثلج لمدة 5 دقائق (لأنها تفاعل طارد للحرارة). تحضير محلول 60٪ H2SO4 (حماية القارورة من الضوء).</li>
	<li>في أنبوب نظيف ، قم بإعداد محلول أورسينول بنسبة 1.6٪ في الماء المقطر. لتحضير كاشف الأورسينول ، امزج 4.4 مل من محلول 60٪ H2SO4 مع 0.6 مل من محلول الأورسينول 1.6٪.</li>
	<li>احسب الحجم النهائي لكاشف الأورسينول المطلوب. أضف 900 ميكرولتر من هذا الكاشف إلى كل عينة وإلى كل تركيز من منحنى المعايرة ، باستخدام تركيزات مختلفة من الرامنوز (عادة ، يتم استخدام 9 تركيزات من الرامنوز في نطاق 1 ميكروغرام / مل إلى 9 ميكروغرام / مل) ، وواحد مع 100 ميكرولتر من الماء ، مما يضمن إجراء كل ذلك في ثلاث نسخ.</li>
	<li>أضف 100 ميكرولتر من كل عينة RL إلى 900 ميكرولتر من كاشف الأورسينول في أنبوب زجاجي واخلط المحلولين.</li>
	<li>احتضان لمدة 30 دقيقة في حمام مائي محمى على حرارة 80 درجة مئوية.</li>
	<li>اترك الأنابيب لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>اقرأ امتصاص العينات ومنحنى المعايرة عند 421 نانومتر باستخدام خلية كوارتز.</li>
	<li>احسب تركيز الرامنوز في كل عينة عن طريق استيفاء الامتصاص على منحنى المعايرة والنظر في الحجم المستخدم للتحديد.</li>
	<li>لحساب تركيز ميكرومتر ، اقسم التركيز الذي تم الحصول عليه في ميكروغرام / مل على 182.2 (الوزن الجزيئي للرامنوز) واضربه في 1000.</li>
</ol>

تحليل مقارن لإنتاج الرامنوليبيد في سلالات الزائفة الزنجارية

<ol>
	<li>Moradali, M. F., Ghods, S., Rehm, B. H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+lifestyle:+A+paradigm+for+adaptation,+survival,+and+persistence.">Pseudomonas aeruginosa lifestyle: A paradigm for adaptation, survival, and persistence.</a> Frontiers in Cell Infection and Microbiology. 7, 1-29 (2017).</li><li>Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa:+New+insights+into+pathogenesis+and+host+defenses.">Pseudomonas aeruginosa: New insights into pathogenesis and host defenses.</a> Pathogens and Disease. 67 (3), 159-173 (2013).</li><li>Williams, P., C&#225;mara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing+and+environmental+adaptation+in+Pseudomonas+aeruginosa:+a+tale+of+regulatory+networks+and+multifunctional+signal+molecules.">Quorum sensing and environmental adaptation in Pseudomonas aeruginosa: a tale of regulatory networks and multifunctional signal molecules.</a> Current Opinion in Microbiology. 12 (2), 182-191 (2009).</li><li>Sober&#243;n-Ch&#225;vez, G., Gonz&#225;lez-Valdez, A., Soto-Aceves, M. P., Cocotl-Ya&#241;ez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhamnolipids+produced+by+Pseudomonas:+From+molecular+genetics+to+the+market.">Rhamnolipids produced by Pseudomonas: From molecular genetics to the market.</a> Microbial Biotechnology (MBT). 14 (1), 136-146 (2021).</li><li>Freschi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pseudomonas+aeruginosa+pan-genome+provides+new+insights+on+its+population+structure,+horizontal+gene+transfer,+and+pathogenicity.">The Pseudomonas aeruginosa pan-genome provides new insights on its population structure, horizontal gene transfer, and pathogenicity.</a> Genome Biology and Evolution. 11 (1), 109-120 (2019).</li><li>Quiroz-Morales, S. E., Garc&#237;a-Reyes, S., Ponce-Soto, G. Y., Servin-Gonzalez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+origins+of+Pseudomonas+aeruginosa+phylogroups+by+diversity+and+evolutionary+analysis+of+important+pathogenic+marker+genes.">Tracking the origins of Pseudomonas aeruginosa phylogroups by diversity and evolutionary analysis of important pathogenic marker genes.</a> Diversity. 14 (5), 345 (2022).</li><li>D&#233;ziel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+chromatography/mass+spectrometry+analysis+of+mixtures+of+rhamnolipids+produced+by+Paeudomonas+aeruginosa+strain+57RP+grown+on+mannitol+or+naphthalene.">Liquid chromatography/mass spectrometry analysis of mixtures of rhamnolipids produced by Paeudomonas aeruginosa strain 57RP grown on mannitol or naphthalene.</a> Biochemistry and Biophysic Acta. 1440 (2-3), 244-252 (1999).</li><li>Abdel-Mawgoud, A. M., L&#233;pine, F., D&#233;ziel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhamnolipids:+Diversity+of+structures,+microbial+origins,+and+roles.">Rhamnolipids: Diversity of structures, microbial origins, and roles.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 86 (5), 1323-1336 (2010).</li><li>Toribio, J., Escalante, A. E., Sober&#243;n-Ch&#225;vez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+rhamnolipids+in+bacteria+other+than+Pseudomonas+aeruginosa.">Production of rhamnolipids in bacteria other than Pseudomonas aeruginosa.</a> European Journal of Lipid Science and Technology. 112, 1082-1087 (2010).</li><li>Filbig, M., et al., Sober&#243;n-Ch&#225;vez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+and+process+engineering+on+the+edge-Rhamnolipids+are+a+true+challenge:+A+review.">Metabolic and process engineering on the edge-Rhamnolipids are a true challenge: A review.</a> Biosurfactants. Foundations and Frontiers in Enzymology. , 157-181 (2023).</li><li>Noll, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limits+for+sustainable+biosurfactant+production:+Techno-economic+and+environmental+assessment+of+a+rhamnolipid+production+process.">Limits for sustainable biosurfactant production: Techno-economic and environmental assessment of a rhamnolipid production process.</a> Bioresource Technology. 25, 101767 (2024).</li><li>Garc&#237;a-Reyes, S., Cocotl-Ya&#241;ez, M., Gonz&#225;lez-Valdez, A., Serv&#237;n-Gonz&#225;lez, L., Sober&#243;n Ch&#225;vez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PqsR-independent+quorum-sensing+response+of+Pseudomonas+aeruginosa+ATCC+9027+outlier-strain+reveals+new+insights+on+the+PqsE+effect+on+RhlR+activity.">The PqsR-independent quorum-sensing response of Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 outlier-strain reveals new insights on the PqsE effect on RhlR activity.</a> Molecular Microbiology. 116 (4), 1113-1123 (2021).</li><li>Grosso-Becerra, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+ATCC+9027+is+a+non-virulent+strain+suitable+for+mono-rhamnolipids+production.">Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 is a non-virulent strain suitable for mono-rhamnolipids production.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (23), 9995-10004 (2016).</li><li>Guti&#233;rrez-G&#243;mez, U., Soto-Aceves, M. P., Serv&#237;n-Gonz&#225;lez, L., Sober&#243;n-Ch&#225;vez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overproduction+of+rhamnolipids+in+Pseudomonas+aeruginosa+PA14+by+redirection+of+the+carbon+flux+from+polyhydroxyalcanoate+synthesis+and+overexpression+of+the+rhlAB-R+operon.">Overproduction of rhamnolipids in Pseudomonas aeruginosa PA14 by redirection of the carbon flux from polyhydroxyalcanoate synthesis and overexpression of the rhlAB-R operon.</a> Biotechnology Letters. 40 (11), 1561-1566 (2018).</li><li>Zibek, S., Sober&#243;n-Ch&#225;vez, G., Hausmann, R., Henkel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+on+glycosylated+lipids+produced+by+bacteria+and+fungi:+Rhamno-,+Sophoro-,+Mannosylerythritol+and+Cellobiose+Lipids.">Overview on glycosylated lipids produced by bacteria and fungi: Rhamno-, Sophoro-, Mannosylerythritol and Cellobiose Lipids.</a> Biosurfactants for a Biobased. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. , 181 (2022).</li><li>Twigg, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+biosurfactant+research:+time+to+improve+the+rigour+in+the+reporting+of+synthesis,+functional+characterization+and+process+development.">Microbial biosurfactant research: time to improve the rigour in the reporting of synthesis, functional characterization and process development.</a> Microbial Biotechnology. 14 (1), 147-170 (2021).</li><li>Matsuyama, T., Sogawa, M., Yano, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+colony+thin+layer+chromatography+and+rapid+characterization+of+Serratia+marscescens+wetting+agents.">Direct colony thin layer chromatography and rapid characterization of Serratia marscescens wetting agents.</a> Applied and Environmental Microbiology. 53 (5), 1186-1188 (1987).</li><li>Chandrasekaran, E. V., Bemiller, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constituent+analyses+of+glycosaminoglycans.">Constituent analyses of glycosaminoglycans.</a> Methods on Carbohydrate Chemistry. 8, 89-96 (1980).</li><li>Behrens, B., Engelen, J., Tiso, T., Blank, L. M., Hayen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+rhamnolipids+by+liquid+chromatography/mass+spectrometry+after+solid-phase+extraction.">Characterization of rhamnolipids by liquid chromatography/mass spectrometry after solid-phase extraction.</a> Analytic and Bioanalytic Chemistry. 408 (10), 2505-2514 (2016).</li><li>Rahim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+functional+characterization+of+the+Pseudomonas+aeruginosa+rhlC+gene+that+encodes+rhamnosyltransferase+2,+an+enzyme+responsible+for+di-rhamnolipid+biosynthesis.">Cloning and functional characterization of the Pseudomonas aeruginosa rhlC gene that encodes rhamnosyltransferase 2, an enzyme responsible for di-rhamnolipid biosynthesis.</a> Molecular Microbiology. 40 (3), 708-718 (2001).</li><li>Irorere, V. U., Tripathi, L., Marchant, R., McClean, S., Banat, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+rhamnolipid+production:+A+critical+re-evaluation+of+published+data+and+suggested+future+publication+criteria.">Microbial rhamnolipid production: A critical re-evaluation of published data and suggested future publication criteria.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 101 (10), 3941-3951 (2017).</li><li>Holloway, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Recombination+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Genetic Recombination in Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of General Microbiology. 13 (3), 572-581 (1955).</li><li>Mathee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forensic+investigaction+into+the+origin+of+Pseudomonas+aeruginosa+PA14-old+but+not+lost.">Forensic investigaction into the origin of Pseudomonas aeruginosa PA14-old but not lost.</a> Journal of Medical Microbiology. 67 (8), 1019-1021 (2018).</li><li>Roy, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+genome+sequence+of+the+multiresistant+taxonomic+outlier+Pseudomonas+aeruginosa+PA7.">Complete genome sequence of the multiresistant taxonomic outlier Pseudomonas aeruginosa PA7.</a> PLoS ONE. 5, e8842 (2010).</li><li>Zhang, Y., Miller, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+octadecane+dispersion+and+biodegradation+by+a+Pseudomonas+rhamnolipid+surfactant+(biosurfactant).">Enhanced octadecane dispersion and biodegradation by a Pseudomonas rhamnolipid surfactant (biosurfactant).</a> Applied and Environmental Microbiology. 58 (10), 3276-3282 (1992).</li><li>Miller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Experiments in Molecular Genetics. , 352-355 (1992).</li><li>Abdel-Mawgoud, A. M., L&#233;pine, F., D&#233;ziel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+chromatography/mass+spectrometry+for+the+identification+and+quantification+of+rhamnolipids.">Liquid chromatography/mass spectrometry for the identification and quantification of rhamnolipids.</a> Pseudomonas Methods and Protocols. 30, 359-373 (2014).</li><li>Lee, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+reveals+that+Pseudomonas+aeruginosa+virulence+is+combinatorial.">Genomic analysis reveals that Pseudomonas aeruginosa virulence is combinatorial.</a> Genome Biology. 7 (10), 90 (2006).</li><li>Kubicki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+straightforward+assay+for+screening+and+quantification+of+biosurfactants+in+microbial+culture+supernatants.">A straightforward assay for screening and quantification of biosurfactants in microbial culture supernatants.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 958 (2020).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

الطريقة الأكثر دقة للكشف عن RL وقياسه هي HPLC إلى جانب قياس الطيف الكتلي (MS)7،8،27 ؛ ومع ذلك ، فإنه يتطلب معدات متخصصة ومكلفة قد لا تكون في متناول العديد من الباحثين. يمكن إجراء الطرق الموصوفة هنا بشكل روتيني باستخدام المواد والمعدات المختبرية ...

Pseudomonas aeruginosa هي بكتيريا بيئية وممرض انتهازي يثير قلقا كبيرا بسبب إنتاجها للسمات المرتبطة بالفوعة ومقاومتها العاليةللمضادات الحيوية 1,2. المستقلب الثانوي المميز الذي تنتجه هذه البكتيريا هو RL الفاعل بالسطح الحيوي ، والذي يتم إنتاجه بطريقة منسقة مع العديد من السمات المرتبطة بالفوعة مثل فينازين بيوسيانين ، وهو مضاد حيوي له نشاط الأكسدة والاختزال ، والإيلاستاز البروتياز3. تم استغلال خصائص الشد النشط والاستحلاب ل RL في تطبيقات صناعية مختلفة ويتم تسويقها حاليا4.
تنتج معظم سلالات P. aeruginosa ، التي تنتمي إلى المجموعتين 1 و 2 ، نوعين من RL: mRL ، والذي يتكون من جزء واحد من rhamnose مرتبط بحمض دهني ثنائي بشكل أساسي من 10 ذرات كربون ، و dRL ، الذي يحتوي على جزء رامنوز إضافي مرتبط بالرامنوزالأول 4 (انظر الشكل 1). ومع ذلك ، فقد تم الإبلاغ عن أن مجموعتين صغيرتين من P. aeruginosa (المجموعتان 3 و 5) تنتجان فقطmRL 5,6. يحتوي نوعان من RL على خليط من دايمرات الأحماض الدهنية ، والتي ، كما ذكرنا ، هي C10-C10 بشكل أساسي ، ولكن يتم أيضا إنتاج نسب أصغر من الجزيئات التي تحتوي على ثنائيات C12-C10 و C12-C12 و C10-C12: 1. تم الإبلاغ عن توصيف متجانسات RL التي تنتجها سلالات مختلفة باستخدام HPLC MS / MS 7,8. يمكن للطرق الموصوفة في هذا العمل أن تفرق فقط بين mRL و dRL ولكن لا يمكن استخدامها لتوصيف متجانسات RL.
P. aeruginosa وبعض أنواع Burkholderia هي منتجة طبيعية ل RL9 ، لكن البكتيريا السابقة هي المنتج الأكثر كفاءة. ومع ذلك ، يتم إنتاج RL المستخدم تجاريا حاليا في مشتقات Pseudomonas putida KT2440 التي تعبر عن جينات P. aeruginosa لتجنب استخدام هذا العامل الممرض الانتهازي10,11. إن الكشف عن RL التي تنتجها P. aeruginosa وقياسها الكمي لهما أهمية كبيرة لدراسة الآليات الجزيئية المشاركة في التعبير عن السمات المرتبطة بالفوعة12 ، وفي توصيف السلالات التي تنتمي إلى clades 3 أو 513 ، ولبناء مشتقات P. aeruginosa التي تفرط في إنتاج هذه المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي مع تقليل الفوعة14. تم الكشف عن إنتاج المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي بواسطة الكائنات الحية الدقيقة المختلفة بناء على بعض الخصائص العامة لهذه المركبات ، مثل طريقة إسقاط الانهيار أو مؤشر الاستحلاب15 ، ولكن هذه الطرق ليست دقيقة ولا محددة16.
هنا ، نصف بروتوكول الكشف عن mRL و dRL باستخدام الاستخلاص السائل لإجمالي RL من طافات الاستزراع لمختلف سلالات P. aeruginosa وفصل كلا النوعين من RL باستخدام TLC. في هذه الطريقة ، يتم فصل RL المستخرج من طافي الاستزراع عن طريق قابليتها للذوبان التفاضلي في المذيبات المستخدمة في TLC ، مما يتسبب في الهجرة التفاضلية على لوحة هلام السيليكا. وبالتالي ، فإن mRL لها هجرة أسرع من dRL ، ويمكن اكتشافها كبقع منفصلة عندما يتم تجفيف الألواح وتلطيخها ب α-naphthol.
تعتمد الطريقة الموضحة هنا للكشف عن mRL و dRL بواسطة TLC على مقالة منشورة مسبقا17 ، وهي سهلة الأداء ولا تتطلب معدات باهظة الثمن. كانت هذه الطريقة مفيدة للكشف عن RL في مختلف عزلات P. aeruginosa 13 باستخدام الضوابط المناسبة ، مثل طفرة مشتقة من P. aeruginosa غير قادرة على إنتاج RL. ومع ذلك ، فهي ليست الطريقة المفضلة لتوصيف المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي الجديدة التي تنتجها بكتيريا أخرى غير Pseudomonas aeruginosa بسبب افتقارها إلى الخصوصية.
بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقديم طريقة لتحديد مكافئات rhamnose لإجمالي RL المستخرج من طاف P. aeruginosa . تحدد هذه الطريقة كمية هذه المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي بناء على تفاعل الأورسينول مع السكريات المختزلة ، مما ينتج عنه منتج يمكن قياسه طيفيا عند 421 نانومتر ، كما هو موضح سابقا18. نظرا لأن التفاعل مع الأورسينول ليس خاصا بالرامنوز ، فمن المهم إجراء هذه الطريقة باستخدام RL المستخرج من طاف الثقافة الذي لا يحتوي على كميات كبيرة من الجزيئات الأخرى المحتوية على السكر ، مثل عديدات السكاريد الدهنية (LPS). يتم استخدام خليط الكلوروفورم / الميثانول المحمض هنا لاستخراج السائل من RL18 ، ولكن يمكن أيضا استخدام أسيتات الإيثيل ، واستخراج الطور الصلب (SPE) يعطي نتائج جيدة جدا19. لا تتطلب طريقة الأورسينول الموصوفة هنا معدات متطورة ويمكن أن توفر نتائج موثوقة إذا تم إجراؤها بعناية خاصة في إعداد العينات التي تم تحليلها ، كما تمت مناقشته. لضمان التحضير السليم للعينة ، من المهم تضمين طفرة Pseudomonas aeruginosa rhlA غير قادرة على إنتاج RL20 وإجراء ثلاث نسخ بيولوجية وثلاث نسخ تقنية لكل تحديد.
كان هناك جدل كبير في الأدبيات16،21فيما يتعلق بتحديد RL بواسطة طريقة orcinol ، مع بعض الدراسات التي تشير إلى أن إنتاج RL مبالغ فيه وأن الفحص يفتقر إلى خصوصية الرامنوز ، مما قد يكشف عن السكريات الأخرى. ومع ذلك ، فإننا نوضح هنا أن الطرق الموصوفة يمكن أن تكون دقيقة ومحددة في ظل الظروف المناسبة. علاوة على ذلك ، للمقارنة مع الإجراءات الموضحة في هذه المقالة ، نستخدم اكتشاف UPLC-MS / MS لمعيار dRL ونثبت أنه يتم الحصول على نتائج مماثلة باستخدام طريقة orcinol. ويرد البروتوكول المفصل لقياس RL كميا باستخدام هذه الطريقة في الملف التكميلي 1.
يتم تمثيل هذه البروتوكولات باستخدام سلالات النوع PAO1 (مجموعة الفيلوغروب 1) و PA14 (مجموعة الفيلوغروب 2) و PA7 (مجموعة الفيلو 3). تم اختيار هذه السلالات لأنها تتميز بشكل جيد وتنتج ملفات تعريف RL مختلفة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-NAPHTHOL</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>70442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACETIC ACID</td>
			<td>J.T. BAKER</td>
			<td>9508-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CENTRIFUGE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For centrifuging tubes 1.5 mL and&#160; 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHLOROFORM</td>
			<td>J.T. BAKER</td>
			<td>9180-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRYING OVEN</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETHER</td>
			<td>J.T. BAKER</td>
			<td>9244-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLASS PIPETTE</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>CLS706510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HYDROCHLORIC ACID</td>
			<td>J.T. BAKER</td>
			<td>5622-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-RHAMNOSE MONOHYDRATE</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>R-3875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>METHANOL</td>
			<td>J.T. BAKER</td>
			<td>9049-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCINOL MONOHYDRATE</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>O1875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPGAS Broth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tris HCL (0.12M), Potassium Chloride ( 0.02M) Ammonium Chloride (0.02M),&#160; Peptone (1%), pH 7.4&#160;&#160; Autoclaved. Add&#160; Glucose (5%) and Magnesium Sulfate (0.0016M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QUARTZ CELL (CUVETTE)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>Z276669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RECTANGULAR TLC DEVELOPING TANK</td>
			<td>FISHER SCIENTIFIC</td>
			<td>K4161801020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RHAMNOLIPIDS&#160;</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>R-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPECTROPHOTOMETER</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>VIS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRAYER</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>Z529710-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SULFURIC ACID</td>
			<td>J.T. BAKER</td>
			<td>9681-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TES TUBES 5mL</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>352002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC SILICA GEL 60 F254</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1.05554.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WATER BATH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#62; 80 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and quantification of mono-rhamnolipids and di-rhamnolipids produced by pseudomonas aeruginosa

البكتيريا البيئية Pseudomonas aeruginosa هي مسببات الأمراض الانتهازية مع مقاومة عالية للمضادات الحيوية التي تمثل خطرا على الصحة. تنتج هذه البكتيريا مستويات عالية من المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي المعروفة باسم rhamnolipids (RL) ، وهي جزيئات ذات قيمة تقنية حيوية كبيرة ولكنها مرتبطة أيضا بسمات الفوعة. وفي هذا الصدد، قد يكون الكشف عن الرخصة وتحديدها كميا مفيدا لكل من تطبيقات التكنولوجيا الأحيائية ومشاريع البحوث الطبية الحيوية. في هذه المقالة ، نوضح خطوة بخطوة تقنية الكشف عن إنتاج شكلين من RL التي تنتجها P. aeruginosa باستخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC): أحادي الرامنوليبيد (mRL) ، والجزيئات المكونة من ديمر من الأحماض الدهنية (بشكل رئيسي C10-C10) مرتبطة بجزء واحد من rhamnose ، و di-rhamnolipids (dRL) ، وهي جزيئات تتكون من ثنائي حمض دهني مماثل مرتبط بشقين من rhamnose. بالإضافة إلى ذلك ، نقدم طريقة لقياس الكمية الإجمالية ل RL بناء على التحلل المائي الحمضي لهذه المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي المستخرجة من طاف ثقافة P. aeruginosa والكشف اللاحق عن تركيز الرامنوز الذي يتفاعل مع الأورسينول. يمكن استخدام الجمع بين كلتا التقنيتين لتقدير التركيز التقريبي ل mRL و dRL الناتج عن سلالة معينة ، كما هو موضح هنا مع سلالات النوع PAO1 (مجموعة الفيلوغروب 1) و PA14 (مجموعة الفيلو 2) و PA7 (مجموعة الفيلو 3).

Pseudomonas aeruginosa is an environmental bacterium and an opportunistic pathogen of great concern due to its production of virulence-associated traits and its high antibiotic resistance1,2. A characteristic secondary metabolite produced by this bacterium is the biosurfactant RL, which is produced in a coordinated manner with several virulence-associated traits such as the phenazine pyocyanin, an antibiotic with redox activity, and the protease elastase3. The tensio-active and emulsification properties of RL have been exploited in different industrial applications and are currently commercialized4.
Most P. aeruginosa strains, belonging to phylogroups 1 and 2, produce two types of RL: mRL, which consists of one rhamnose moiety linked to a fatty acid dimer mainly of 10 carbons, and dRL, which contains an additional rhamnose moiety linked to the first rhamnose4 (see Figure 1). However, it has been reported that two minor P. aeruginosa phylogroups (groups 3 and 5) only produce mRL5,6. The two types of RL contain a mixture of fatty acid dimers, which, as mentioned, are mainly C10-C10, but smaller proportions of molecules containing C12-C10, C12-C12, and C10-C12:1 dimers are also produced. The characterization of the RL congeners produced by different strains using HPLC MS/MS has been reported7,8. The methods described in this work can only differentiate between mRL and dRL but cannot be used for the characterization of the RL congeners.
P. aeruginosa and some Burkholderia species are natural producers of RL9, but the former bacterium is the most efficient producer. However, commercially used RL is currently produced in Pseudomonas putida KT2440 derivatives expressing P. aeruginosa genes to avoid the use of this opportunistic pathogen10,11. The detection and quantification of RL produced by P. aeruginosa are of great importance for studying the molecular mechanisms involved in the expression of virulence-related traits12, in the characterization of strains belonging to clades 3 or 513, and for constructing P. aeruginosa derivatives that overproduce these biosurfactants while having reduced virulence14. The production of biosurfactants by different microorganisms has been detected based on some general characteristics of these compounds, such as the collapse drop method or emulsification index15, but these methods are neither accurate nor specific16.
Here, we describe the protocol to detect mRL and dRL using the liquid extraction of total RL from the culture supernatants of different P. aeruginosa-type strains and the separation of both types of RL using TLC. In this method, the RL extracted from the culture supernatant is separated by their differential solubility in the solvents used for TLC, causing differential migration on the silica gel plate. Thus, mRL have a more rapid migration than dRL, and they can be detected as separate spots when the plates are dried and stained with &#945;-naphthol.
The method described here for detecting mRL and dRL by TLC is based on a previously published article17, which is easy to perform and does not require expensive equipment. This method has been useful for detecting RL in various P. aeruginosa isolates13 using appropriate controls, such as a P. aeruginosa-derived mutant unable to produce RL. However, it is not the preferred method for characterizing novel biosurfactants produced by bacteria other than Pseudomonas aeruginosa due to its lack of specificity.
Additionally, a method for quantifying the rhamnose equivalents of total RL extracted from a P. aeruginosa culture supernatant is presented. This method quantifies these biosurfactants based on the reaction of orcinol with reductive sugars, resulting in a product that can be measured spectrophotometrically at 421 nm, as previously described18. Since the reaction with orcinol is not specific to rhamnose, it is important to perform this method with RL extracted from the culture supernatant that does not contain significant amounts of other sugar-containing molecules, such as lipopolysaccharides (LPS). An acidified chloroform/methanol mixture is used here for liquid extraction of RL18, but ethyl acetate can also be used, and solid-phase extraction (SPE) yields very good results19. The orcinol method described here does not require sophisticated equipment and can provide reliable results if performed with special care in preparing the analyzed samples, as discussed. To ensure proper sample preparation, it is important to include a Pseudomonas aeruginosa rhlA mutant unable to produce RL20 and to perform three biological and three technical replicates for each determination.
There has been significant controversy in the literature16,21regarding RL determination by the orcinol method, with some studies suggesting that RL production is overestimated and that the assay lacks specificity for rhamnose, potentially detecting other sugars. However, we demonstrate here that the methods described can be accurate and specific under the appropriate conditions. Furthermore, for comparison with the procedures outlined in this article, we utilize UPLC-MS/MS detection of a dRL standard and demonstrate that similar results are obtained with the orcinol method. The detailed protocol for quantifying RL using this method is included in Supplementary File 1.
These protocols are exemplified using the type strains PAO1 (phylogroup 1), PA14 (phylogroup 2), and PA7 (phylogroup 3). These strains were chosen because they are well-characterized and produce different RL profiles.

تسليط الضوء على المؤلف: فهم تنظيم رامنوليبيد في الزائفة الزنجارية

الكشف عن وقياس الدهون الأحادية والدهون الثنائية التي تنتجها الزائفة الزنجارية

The aim of our research is to understand the regulatory mechanisms involved the expression of the different virulence factors produced by the opportunistic pathogen, Pseudomonas aeruginosa, that include the biosurfactants rhamnolipids. Rhamnolipids are non-toxic and environmental-friendly, and have several biotechnological applications, so they are now in the market. We have reported the rhamnolipids biosynthetic root and the regulation of their expression in different isolates that are atypical, and refractory to alternative therapeutic approaches based on antivirulence strategies.In addition, we have reported the construction of strains that produce high levels of rhamnolipids and are non-virulent. The technique describe, enable the detection and quantification of rhamnolipids by Pseudomonas aeruginosa. This protocol is accurate and reproducible and do not need expensive equipment.

في هذه المقالة ، تم استخدام ثلاث سلالات مختلفة من نوع P. aeruginosa لتمثيل ثلاث مجموعات فيلو ، لكل منها مستويات إنتاج RL مختلفة ونسب mRL و dRL. تشمل هذه السلالات PAO1 (عزل الجرح من أستراليا ، 195522) ، PA14 (عزل نباتي من الولايات المتحدة الأمريكية ، 197723) ، و PA7 (عزل سريري من الأرجنتين ،...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Understanding Rhamnolipid Regulation in Pseudomonas aeruginosa at JoVE.com

تنتج الزائفة الزنجارية المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي للرامنوليبيد. يكتشف كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة ويحدد نسبة الدهون الأحادية والثنائية التي تنتجها كل سلالة. يتضمن القياس الكمي لإجمالي الرامنوليبيدات تقييم مكافئات الرامنوز الموجودة في هذه المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي المستخرجة من المواد الطافية المستزرعة باستخدام طريقة الأورسينول.

The environmental bacterium Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen with high antibiotic resistance that represents a health hazard. This ...

الهدف من بحثنا هو فهم الآليات التنظيمية التي تنطوي على التعبير عن عوامل الفوعة المختلفة التي ينتجها العامل الممرض الانتهازي ، Pseudomonas aeruginosa ، والتي تشمل المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي rhamnolipids. Rhamnolipids غير سامة وصديقة للبيئة ، ولها العديد من تطبيقات التكنولوجيا الحيوية ، لذلك فهي الآن في السوق. لقد أبلغنا عن جذر التخليق الحيوي للرامنوليبيد وتنظيم تعبيرها في عزلات مختلفة غير نمطية ، ومقاومة للنهج العلاجية البديلة القائمة على استراتيجيات مضادة للفيروسات.بالإضافة إلى ذلك ، أبلغنا عن بناء سلالات تنتج مستويات عالية من الرامنوليبيدات وغير خبيثة. تصف هذه التقنية ، وتمكن من الكشف عن الدهون الراموليبيدات وقياسها بواسطة Pseudomonas aeruginosa. هذا البروتوكول دقيق وقابل للتكرار ولا يحتاج إلى معدات باهظة الثمن.

detection-quantification-mono-rhamnolipids-di-rhamnolipids-produced

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detection and Quantification of Mono-Rhamnolipids and Di-Rhamnolipids Produced by Pseudomonas aeruginosa

735 Views.  Universidad Nacional Autónoma de México. الهدف من بحثنا هو فهم الآليات التنظيمية التي تنطوي على التعبير عن عوامل الفوعة المختلفة التي ينتجها العامل الممرض الانتهازي ، Pseudomonas aeruginosa ، والتي تشمل المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي rhamnolipids. Rhamnolipids غير سامة وصديقة للبيئة ، ولها العديد من تطبيقات التكنولوجيا الحيوية ?...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: فهم تنظيم رامنوليبيد في الزائفة الزنجارية

The environmental bacterium Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen with high antibiotic resistance that represents a health hazard. This bacterium produces high levels of biosurfactants known as rhamnolipids (RL), which are molecules with significant biotechnological value but are also associated with virulence traits. In this respect, the detection and quantification of RL may be useful for both biotechnology applications and biomedical research projects. In this article, we demonstrate step-by-step the technique to detect the production of the two forms of RL produced by P. aeruginosa using thin-layer chromatography (TLC): mono-rhamnolipids (mRL), molecules constituted by a dimer of fatty acids (mainly C10-C10) linked to one rhamnose moiety, and di-rhamnolipids (dRL), molecules constituted by a similar fatty acid dimer linked to two rhamnose moieties. Additionally, we present a method to measure the total amount of RL based on the acid hydrolysis of these biosurfactants extracted from a P. aeruginosa culture supernatant and the subsequent detection of the concentration of rhamnose that reacts with orcinol. The combination of both techniques can be used to estimate the approximate concentration of mRL and dRL produced by a specific strain, as exemplified here with the type strains PAO1 (phylogroup 1), PA14 (phylogroup 2), and PA7 (phylogroup 3).

Pseudomonas aeruginosa&#160;produces the rhamnolipid biosurfactants. Thin-layer chromatography detects and determines the proportion of mono- and di-rhamnolipids produced by each strain. Quantification of total rhamnolipids involves assessing rhamnose equivalents present in these biosurfactants extracted from the culture supernatants using the orcinol method.

Rhamnolipid Detection in Pseudomonas aeruginosa Supernatants Using TLC

To begin, transfer five milliliters of an acidified culture supernatant of pseudomonas aeruginosa into a 50-milliliter polypropylene tube. Add five milliliters of chloroform methanol mixture into this tube. Invert the tube three times for 30 seconds to agitate and mix the solution.Leave the tube without inversion for two minutes between each agitation. Centrifuge the tube for 10 minutes at 3000 G at four degrees Celsius, then transfer the organic phase into a clean tube. Leave the tube in an extraction hood until it is dried.Next, use a 10-microliter pipette to apply five microliters of the samples onto a TLC plate. To prepare the liquid phase, mix 26 milliliters of chloroform, six milliliters of methanol, and 0.8 milliliters of 20%acetic acid. Place the solvent mix in a closed TLC chamber for at least 10 minutes to saturate it.Transfer the TLC plate into the chamber, avoiding contact with the sample application points. Leave the TLC plate in the closed chamber until the solvent reaches one centimeter before the edge of the plate. At this point, remove the plate and let it dry.To detect the presence of rhamnolipids, spray alpha naphthol solution onto the plate in the extraction hood, then place a sprayed plate in an oven at 85-degrees Celsius for several minutes until the pinkish mark of the rhamnolipid lipid is visible. All three pseudomonas aeruginosa strains produce different amounts of mono and di-rhamnolipids.

الكشف عن رامنوليبيد في طافات الزائفة الزنجارية باستخدام TLC

Quantification of Rhamnolipids Present in the Biosurfactant of Pseudomonas aeruginosa

To begin pipette 1.2 milliliters of a 24-hour culture of Pseudomonas aeruginosa into a 1.5 milliliter centrifuge tube. Centrifuge the tube at 3000 G for four degrees Celsius for three minutes. Collect the supernatant in a clean tube.Pipette 333 microliters of the supernatant into a clean tube. Then add one milliliter of ether into the tube. Mix the solution in a vortex for 30 seconds.After all the tubes have been vortexed, centrifuge them at 3000 G at four degrees Celsius for two minutes. Then collect the organic phase and transfer it into a clean tube tube. Place the solution in an extraction hood until it is dried.Next place a clean flask covered with foil paper in ice for five minutes to prepare a 60%sulfuric acid solution. Use this sulfuric acid solution to prepare the orcinol reagent. Add 100 microliters of each Rhamnolipid sample to a glass tube and add 900 microliters of orcinol to the samples.After mixing the solutions together, incubate the sample in a water bath at 80 degrees Celsius for 30 minutes. When the tube cools to room temperature, transfer a sample to a quart cell and place it in the spectrophotometer to read the absorbance at 421 nanometers. The strain PA14 produces the highest amount of rhamnose equivalents while strain PA7 produces the lowest amount.