이 연구는 중국과학원(Chinese Academy of Science)의 전략적 우선 순위 연구 프로그램(Strategic Priority Research Program, XDA16020400에서 PH까지)의 지원을 받았습니다. 중국 국립 자연 과학 재단 (32170804에서 PH).

CUT&#38;Tag를 사용한 마우스 근아세포의 게놈 히스톤 마크 프로파일링

<ol>
	<li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUT&amp;Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells.">CUT&amp;Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nat Commun. 10 (1), 1930 (2019).</li><li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+generating+high-resolution+maps+of+genome-wide+protein+binding.">A simple method for generating high-resolution maps of genome-wide protein binding.</a> eLife. 4, e09225 (2015).</li><li>Nikitina, T., Wang, D., Gomberg, M., Grigoryev, S. A., Zhurkin, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+micrococcal+nuclease+and+exonuclease+III+digestion+reveals+precise+positions+of+the+nucleosome+core/linker+junctions:+implications+for+high-resolution+nucleosome+mapping.">Combined micrococcal nuclease and exonuclease III digestion reveals precise positions of the nucleosome core/linker junctions: implications for high-resolution nucleosome mapping.</a> J Mol Biol. 425 (11), 1946-1960 (2013).</li><li>Policastro, R. A., Zentner, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+methods+for+genome-wide+profiling+of+protein+binding+sites.">Enzymatic methods for genome-wide profiling of protein binding sites.</a> Brief Funct Genomics. 17 (2), 138-145 (2018).</li><li>Teytelman, L., Thurtle, D. 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X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+digital+transcriptional+profiling+of+single+cells.">Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells.</a> Nat Commun. 8, 14049 (2017).</li><li>Nakka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JMJD3+activated+hyaluronan+synthesis+drives+muscle+regeneration+in+an+inflammatory+environment.">JMJD3 activated hyaluronan synthesis drives muscle regeneration in an inflammatory environment.</a> Science. 377 (6606), 666-669 (2022).</li><li>Fu, X., Wang, H., Hu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+activation+in+skeletal+muscle+regeneration.">Stem cell activation in skeletal muscle regeneration.</a> Cell Mol Life Sci. 72 (9), 1663-1677 (2015).</li><li>Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. 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J., Davis, R. L., Lassar, A. B., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD:+a+regulatory+gene+of+skeletal+myogenesis.">MyoD: a regulatory gene of skeletal myogenesis.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 280, 3-6 (1990).</li><li>Wardle, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Master+control:+transcriptional+regulation+of+mammalian+Myod.">Master control: transcriptional regulation of mammalian Myod.</a> J Muscle Res Cell Motil. 40 (2), 211-226 (2019).</li><li>Local, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+H3K4me1-associated+proteins+at+mammalian+enhancers.">Identification of H3K4me1-associated proteins at mammalian enhancers.</a> Nat Genet. 50 (1), 73-82 (2018).</li><li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome.">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li><li>Faralli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UTX+demethylase+activity+is+required+for+satellite+cell-mediated+muscle+regeneration.">UTX demethylase activity is required for satellite cell-mediated muscle regeneration.</a> J Clin Invest. 126 (4), 1555-1565 (2016).</li><li>Yang, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenic+transcriptional+activation+of+MyoD+mediated+by+replication-independent+histone+deposition.">Myogenic transcriptional activation of MyoD mediated by replication-independent histone deposition.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (1), 85-90 (2011).</li><li>Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+low-cost+chromatin+profiling+with+CUT&amp;Tag.">Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&amp;Tag.</a> Nat Protoc. 15 (10), 3264-3283 (2020).</li></ol>

저자는 밝힐 것이 없습니다.

특정 CUT&Tag 반응에 필요한 특정 세포 수는 테스트 할 히스톤 마크 / 변이체 또는 염색질 결합 단백질의 농축에 전적으로 의존합니다. 일반적으로 H3K4me1, H3K4me3 및 H3K27ac 등과 같은 매우 풍부한 히스톤 표시의 경우 25,000-50,000 개의 근 아세포가 하나의 CUT & Tag 반응에 충분합니다. 그러나 일부 희귀 염색질 결합 단백질은 최대 250,000개의 세포가 필요할 수 있습니다. CUT&Tag 어세이에 사용되는 셀 수는 매?...

CUT&Tag 분석은 ChIP1의 몇 가지 명백한 결함을 보완하기 위해 발명되었습니다. ChIP의 두 가지 주요 단점은 1) 염색질을 단편화할 때 발생하는 바이어스와 2) 낮은 세포 수로 작업할 수 없다는 것입니다. X-ChIP 분석은 염색질 단편을 얻기 위해 초음파 처리 또는 MNase 분해에 의존하는 반면, N-ChIP는 주로 MNase 분해를 사용하여 뉴클레오솜을 얻습니다. 초음파 처리는 프로모터 영역2와 같은 이완 된 염색질 위치에 대한 편향을 보이며, 명백하게, MNase 소화는 또한 이완 된 염색질 섬유에서보다 효율적으로 작동합니다. 더욱이, 일부에서는 MNase 분해가 DNA 염기서열 의존성 편향(DNA sequence-dependent bias)을 나타낸다고 보고했다3. 따라서 ChIP 분석의 투입 준비 단계에서 모든 종류의 게놈 위치에서 완벽하게 무작위로 염색질 단편을 얻는 것은 불가능합니다. 또한 ChIP 분석은 일반적으로 CUT&Tag에 비해 더 높은 배경 신호를 생성하며 피크가1,4,5인 위치를 강조하기 위해 CUT&Tag보다 10배 이상 더 많은 판독이 필요합니다. 이것은 ChIP 실험이 CUT&Tag보다 엄청나게 더 많은 세포로 시작해야 하는 이유를 설명합니다. 이것은 세포주를 연구할 때 매우 높은 세포 수를 달성하기 위해 반복적으로 통과할 수 있기 때문에 문제가 되지 않습니다. 그러나 ChIP 분석은 희귀하거나 귀중한 일차 세포 집단을 연구하기 위한 강력한 후성유전학적 도구는 아니지만, 일차 세포는 분명히 더 실용적이고 의학적인 의미를 가지고 있습니다.
길고 복잡한 ChIP 절차로 인해 일부 연구자들은 이 기법을 배우거나 사용하는 데 어려움을 겪지만, 사람들은 면역세포화학(ICC) 또는 면역형광(IF)과 같은 더 쉬운 분석에 더 편안함을 느낍니다. CUT&Tag 분석은 기본적으로 ICC 및 IF 실험 프로세스와 유사하지만 시험관에서만 수행됩니다. CUT&Tag는 처음부터 단편화된 염색질이 필요하지 않으며, 대신 항체 결합을 위해 게놈이 온전해야합니다 1. ChIP 실험의 첫날, 연구자들은 일반적으로 짧은 염색질 조각을 항체 비드 4,5와 혼합하기 전에 초음파 처리 또는 MNase 소화를 통해 핵에서 단편화된 염색질을 준비하는 데 최대 4시간을 소비합니다. 이와는 대조적으로, CUT&Tag 절차의 첫날 작업량은 세포를 Concanavalin-A beads에 고정시킨 다음 cell-bead에 1차 항체를 추가하는 것입니다. ~40분만 필요합니다1.
Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease(CUT&RUN)는 CUT&Tag의 중요한 대안이라는 점을 언급할 가치가 있습니다. CUT&RUN은 CUT&TAG와 유사한 작동 메커니즘을 기반으로 설립되었습니다. CUT&Tag에서 항체는 효소가 각각 염색질 조각을 잘라내고 동시에 라이브러리 제작 어댑터로 태그를 붙일 모든 위치로 pA/G-Tn5 전이효소를 안내하는 반면, CUT&RUN에서 pA/G-Tn5의 역할은 pA/G-MNase에 의해 수행되며 pA/G-MNase는 작업6의 절단 부분만 수행합니다. 그러므로, CUT&Tag와 비교하여, CUT&RUN은 라이브러리 제작 어댑터를 pA/G-MNase-단편화된 DNA 조각 7,8에 붙이는 추가 단계를 필요로 한다. CUT&Tag와 CUT&RUN의 높은 유사성으로 인해 CUT&TAG에 익숙한 연구원은 CUT&RUN을 능숙하게 수행하는 데 쉽게 적응할 수 있습니다. 그러나 CUT&Tag와 CUT&RUN 사이에는 몇 가지 사소한 차이점이 있다는 점에 유의해야 합니다. CUT&RUN 프로토콜은 일반적으로 세척 단계에서 물리적 농도의 염(~150mM)을 사용하는 반면, CUT&Tag에서 300-Dig 세척 버퍼는 염분 함량이 높습니다. 따라서 CUT&Tag는 히스톤 표시/변이체 또는 전사 인자를 프로파일링할 때 이러한 단백질이 DNA1에 직접적이고 강력하게 결합하기 때문에 배경을 제어하는 데 좋습니다. CUT&Tag는 DNA에 직접 결합하지 않고 염색질에 약한 친화력을 보이는 염색질 관련 인자를 프로파일링할 때 문제가 발생할 수 있습니다. CUT&Tag의 고염 세척 단계는 염색질 관련 인자를 제거하고 최종 출력에서 신호를 일으키지 않을 수 있습니다. CUT&Tag를 사용하여 일부 비히스톤/비전사 인자단백질을 프로파일링할 수 있는 성공적인 사례가 있지만9, 여전히 약하게 결합된 염색질 관련 단백질을 프로파일링하기 위해 CUT&Tag보다 CUT&RUN을 권장합니다.
포유류가 성체가 된 후에도 골격근 조직에는 여전히 근육 줄기 세포가 포함되어 있습니다. 근육 손상 동안, 이들 줄기세포는 활성화되고 손상된 근육 섬유를 재생하기 위해 세포 수 확장 및 분화를 거칠 수 있다10. 이러한 줄기 세포는 근육 줄기/위성 세포(MuSC)로 알려져 있습니다. MuSC가 동물에서 분리되거나 근육 손상에 의해 활성화된 후에는 증식하기 시작하여 근아세포가 됩니다.
생쥐 골격근 분해물에서 MuSC를 얻기 위해 Vcam1(Cd106), Cd34 및 α7-integrin(Itga7)과 같은 MuSC 표면 마커는 종종 개별적으로 또는 조합하여 형광 활성화 세포 분류(FACS) 중에 MuSC를 농축하는 데 사용됩니다11. Cd31-/Cd45-/Sca1-/Vcam1+ 는 아마도 >95% 순수 MuSCs를 얻기 위한 최상의 마커 조합일 것으로 나타났다12. FACS는 신선한 근육이 소화된 직후 순수한 MuSC를 분리할 수 있습니다. 그러나 실험 설계에서 분리 바로 순수한 MuSC가 필요하지 않은 경우 >90% 순수 근아세포(MuSC 자손)를 얻기 위해 사전 도금이 FACS보다 비용 효율적입니다.
생쥐에서 갓 분리한 MuSC는 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 Ham의 F10 배지에서 효율적으로 증식하지 않습니다. MuSC의 세포 수를 더 잘 확장하고 충분한 근아세포를 얻으려면 FBS 대신 소 성장 혈청(BGS)을 사용해야 합니다. 그러나, BGS를 이용할 수 없는 경우, Ham의 F10 전체 배지(약 20% FBS 포함)를 동일한 부피의 T-세포 조건부 배지와 혼합하여 근모세포 확장을 극적으로 촉진할 수 있다13. 따라서, 이 프로토콜은 또한 T-세포 배지 컨디셔닝된 MuSC 배지의 제조에 대해 설명할 것이다.
가장 중요한 것은 이 프로토콜이 쥐 뒷다리 근육에서 분리된 쥐 근아세포에 대해 H3K4me1 CUT&Tag 분석을 수행하는 완전한 예를 제공한다는 것입니다. 이 프로토콜은 다른 세포 유형과 히스톤 마크 및 히스톤 변이체에도 적용되며, 독자는 연구하는 특정 히스톤 마크 또는 변이체의 농축을 기반으로 자신의 사례에 대한 세포 수 또는 항체 양을 최적화하기만 하면 됩니다.
CUT&Tag 또는 CUT&RUN에 사용되려면 Tn5 또는 MNase를 단백질 A 또는 단백질 G와 융합하여 pA-Tn5, pG-Tn5, pA-MNase 또는 pG-MNase를 만들어야 합니다. 명백하게, 단백질 A와 단백질 G는 둘 다 pA/G-Tn5 또는 pA/G-MNase를 생성하기 위하여 이 효소에 동시에 융합될 수 있습니다. 단백질 A와 단백질 G는 서로 다른 종의 IgG에 대한 차별적 친화력을 보여줍니다. 따라서 단백질 A와 단백질 G를 효소에 모두 융합하면 이 문제를 극복하고 효소가 여러 종의 항체와 호환되도록 만들 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>233-FB-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin-A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin-A beads</td>
			<td>Bangs Laboratories</td>
			<td>BP531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>300410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3K4me1 antibody&#160;</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab8895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F10 media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11550043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyperactive Universal CUT&#38;Tag Assay Kit for Illumina&#160;</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>TD903</td>
			<td>This kit has been tested by us to function well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack for 1.5 mL EP tubes</td>
			<td>Qualityard</td>
			<td>QYM06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack for 8-PCR tube stripes</td>
			<td>Anosun Magnetic</td>
			<td>CLJ16/21-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0541L</td>
			<td>For library-making PCR reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pA-Tn5</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>S603-01</td>
			<td>Needs to be mounted with adaptors before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5056489001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST535-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody (Guinea Pig anti-rabbit IgG)</td>
			<td>Antibodies-online</td>
			<td>ABIN101961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruePrep Index Kit V2 for Illumina&#160;</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>TD202</td>
			<td>This kit provide Illumina N7XX and N5XX primers&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VAHTS DNA Clean Beads&#160;</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>N411</td>
			<td>Can substitute Ampure XP beads. Can purify CUT&#38;Tag libraries and select DNA fragments by size</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using cleavage under targets and tagmentation (cut&#38;tag) assay in mouse myoblast research

이 프로토콜 논문은 새로운 연구자에게 CUT&Tagation(Cleavage Under Targets and Tagmentation)을 사용하여 염색질 결합 인자, 히스톤 마크 및 히스톤 변이체의 게놈 위치를 프로파일링하는 방법에 대한 전체 세부 정보를 제공하는 것을 목표로 합니다. CUT&Tag 프로토콜은 마우스 근아세포 및 갓 분리한 근육 줄기 세포(MuSC)와 매우 잘 작동합니다. 그들은 세포가 Concanavalin-A 비드로 고정될 수 있는 한 많은 다른 세포 유형에 쉽게 적용될 수 있습니다. CUT&Tag와 비교했을 때, 염색질 면역침전(ChIP) 어세이는 시간이 많이 걸리는 실험입니다. ChIP 분석은 염색질 물질을 면역침전에 사용하기 전에 염색질의 전처리가 필요합니다. 가교 ChIP (X-ChIP)에서 염색질의 전처리에는 염색질을 단편화하기위한 교차 결합 및 초음파 처리가 포함됩니다. 천연 ChIP(N-ChIP)의 경우, 단편화된 염색질은 일반적으로 미세구균 뉴클레아제(MNase) 분해에 의해 달성됩니다. 초음파 처리와 MNase 분해는 모두 ChIP 실험에 약간의 편향을 도입합니다. CUT&Tag 분석은 ChIP에 비해 더 적은 단계 내에 완료할 수 있고 훨씬 더 적은 세포를 필요로 하지만 다양한 게놈 위치에서 전사 인자 또는 히스톤 표시에 대한 보다 편향되지 않은 정보를 제공합니다. CUT&Tag는 최소 5,000개의 셀로 작동할 수 있습니다. ChIP보다 감도가 높고 배경 신호가 낮기 때문에 연구자들은 염기서열분석 후 수백만 번의 판독만으로도 신뢰할 수 있는 피크 데이터를 얻을 수 있을 것으로 기대할 수 있습니다.

CUT&#38;Tag assay was invented to compensate for some overt flaws of ChIPs1. The two major disadvantages of ChIPs are 1) the bias introduced when fragmenting chromatin and 2) the incompetence to work with low cell numbers. X-ChIP assays rely on either sonication or MNase digestion to get chromatin fragments, whereas N-ChIP mostly uses MNase digestion to get nucleosomes. Sonication shows a bias towards relaxed chromatin locations such as promoter regions2, and apparently, MNase digestion also works more efficiently on relaxed chromatin fibers. Moreover, some reported that MNase digestion also shows a DNA sequence-dependent bias3. Therefore, at the input preparation step of ChIP assays, it is impossible to get chromatin fragments from all kinds of genomic locations in a perfectly random manner. Moreover, ChIP assays normally generate higher background signals compared to CUT&#38;Tag and require over 10 folds more reads than CUT&#38;Tag to accentuate where the peaks are1,4,5. This explains why ChIP experiments have to start with tremendously more cells than CUT&#38;Tag. This is not a problem when studying cell lines as they can be repetitively passaged to achieve a very high cell number. However, the ChIP assay is definitely not a strong epigenetic tool to study rare or precious primary cell populations, although primary cells obviously hold more practical and medical implications.
While the long and complicated ChIP procedure discourages some researchers from learning or using this technique, people are more comfortable with easier assays such as immunocytochemistry (ICC) or immunofluorescence (IF). A CUT&#38;Tag assay essentially resembles the process of ICC and IF experiments but only takes place in a test tube. CUT&#38;Tag does not need fragmented chromatin to start with, and instead, the genome must be intact for antibody binding1. On the first day of a ChIP experiment, researchers normally spend up to 4 h preparing the fragmented chromatins from nuclei with sonication or MNase digestion before the short chromatin pieces can be mixed with antibody-beads4,5. In remarkable contrast, the first-day workload of a CUT&#38;Tag procedure is to just immobilize the cells to Concanavalin-A beads and then to add the primary antibody onto the cell-beads. This only requires ~40 min1.
It is worth mentioning that Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease (CUT&#38;RUN) is an important alternative to CUT&#38;Tag. CUT&#38;RUN was established based on a similar working mechanism as CUT&#38;Tag. In CUT&#38;Tag, the antibodies guide the pA/G-Tn5 transposase to all the locations where the enzyme will each cut out a piece of chromatin and meanwhile tag it with library-making adaptors, while in CUT&#38;RUN, the role of pA/G-Tn5 is played by the pA/G-MNase which only performs the cutting part of the job6. Therefore, compared to CUT&#38;Tag, CUT&#38;RUN requires an additional step which is to glue the library-making adaptors onto the pA/G-MNase-fragmented DNA pieces7,8. Due to the high similarities between CUT&#38;Tag and CUT&#38;RUN, researchers familiar with CUT&#38;Tag will easily adapt themselves to performing CUT&#38;RUN proficiently. However, it should be noted that some minor differences exist between CUT&#38;Tag and CUT&#38;RUN. CUT&#38;RUN protocols normally use the physical concentration of salt (~150 mM) in the washing steps, while in CUT&#38;Tag, the 300-Dig wash buffer is high in salt. Therefore, CUT&#38;Tag is good at controlling the background when profiling histone marks/variants or transcription factors, as these proteins directly and strongly bind DNA1. CUT&#38;Tag may run into problems when profiling chromatin-associated factors that do not directly bind DNA and show weak affinity to the chromatin. High salt washing steps in CUT&#38;Tag may strip off chromatin-associated factors and cause no signals in the final output. Although there are successful cases where CUT&#38;Tag can be used to profile some non-histone/non-transcription factor proteins9, we still recommend CUT&#38;RUN over CUT&#38;Tag to profile weakly-bound chromatin-associated proteins.
After mammals reach adulthood, their skeletal muscle tissues still contain muscle stem cells. During muscle injury, these stem cells can be activated and undergo cell number expansion and differentiation to regenerate damaged muscle fibers10. These stem cells are known as Muscle stem/satellite cells (MuSCs). After MuSCs are isolated from animals or once activated by muscle injury, they start proliferating and become myoblasts.
To obtain MuSCs from mouse skeletal muscle digest, MuSC surface markers such as Vcam1 (Cd106), Cd34, and &#945;7-integrin (Itga7) are often used individually or in combinations to enrich MuSCs during fluorescence-activated cell sorting (FACS)11. It has been shown that Cd31-/Cd45-/Sca1-/Vcam1+ is probably the best marker combination to get &#62;95% pure MuSCs12. FACS can isolate pure MuSCs right after fresh muscles are digested. However, if the experimental design does not require pure MuSCs right at their isolation, pre-plating is more cost-effective than FACS to obtain &#62;90% pure myoblasts (MuSC progeny).
MuSCs freshly isolated from mice do not proliferate efficiently in Ham&#39;s F10 media supplemented with fetal bovine serum (FBS). To better expand the cell number of MuSCs and get sufficient myoblasts, bovine growth serum (BGS) should be used instead of FBS. However, if BGS is not available, Ham&#39;s F10 full media (containing about 20% FBS) can be mixed with an equal volume of T-cell conditional media to dramatically promote myoblast expansion13. Therefore, this protocol will also describe the preparation of T-cell media conditioned MuSC media.
Most importantly, this protocol provides a complete example of performing H3K4me1 CUT&#38;Tag assays on mouse myoblasts isolated from mouse hindlimb muscles. Please note that this protocol also applies to other cell types and histone marks and histone variants, and readers only need to optimize the cell numbers or antibody amounts for their cases based on the enrichment of the specific histone marks or variants they study.
In order to be used in CUT&#38;Tag or CUT&#38;RUN, the Tn5 or MNase needs to be fused with protein A or protein G to make pA-Tn5, pG-Tn5, pA-MNase, or pG-MNase. Apparently, both protein A and protein G can be fused onto these enzymes at the same time to generate pA/G-Tn5 or pA/G-MNase. Protein A and protein G show differential affinities to IgGs from different species. Therefore, fusing protein A and protein G altogether onto the enzyme can overcome this problem and make the enzyme compatible with antibodies from multiple species.

저자 스포트라이트: Navigating Challenges and Innovations in Muscle Stem Cell Studies(근육 줄기 세포 연구의 과제와 혁신 탐색)

마우스 근모세포 연구에서 Cleavage Under Targets and Tagmentation(CUT&#38;Tagmentation) 분석 사용

Our group's research focuses on how genome structure, and transcription, in adult skeletal muscle stem cells are regulated and maintained, particularly during sulfate changes, like stem cell commitment, differentiation, and tinasis. Adult skeletal muscle stem cells, comprising just 1%of mono nucleated cells in muscle tissue, present a challenge for chromatin feature studies using High-C, ChIPs, and ATAC seq, due to their scarcity in single cell suspensions obtained from muscle digestion. Chromatin immuno-precipitation, ChIP, has been a key tool for profiling genome features.A simpler, more efficient cut&tag technique, developed by Dr.Steven Henikoff, often surpasses ChIP, especially in studying epigenetics in rare cell populations. Its ease of use broadens accessibility for researchers, including non epigenetic experts.

세포를 Concanavalin-A beads에 결합하기 전에 현미경으로 세포 현탁액을 확인하십시오. 따라서 Concanavalin-A 비드로 세포를 배양한 후 샘플 튜브를 마그네틱 랙에 놓고 현미경을 사용하여 상층액을 다시 관찰해야 합니다. 이는 세포가 Concanavalin-A 비드에 의해 얼마나 효율적으로 포획되었는지 평가하기 위한 것입니다. 7 x 105 cells/mL를 포함하는 세척 완충액은 현미경으로 볼 때 그림...

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후성유전학 분야를 처음 접하는 연구자들은 CUT&Tag가 ChIP 분석에 대한 훨씬 더 쉬운 대안임을 알게 될 것입니다. CUT&Tag는 희귀 및 원발성 세포 집단에 대한 후성유전학 연구에 큰 도움을 주어 극소수의 세포에서 고품질 데이터를 생성했습니다. 이 프로토콜은 마우스 뒷다리 근육에서 분리된 마우스 근아세포에 대해 H3K4me1 CUT&Tag 분석을 수행하는 방법을 설명합니다.

This protocol paper aims to provide the new researchers with the full details of using Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&amp;Tag) to profile ...

우리 그룹의 연구는 성인 골격근 줄기 세포의 게놈 구조 및 전사가 특히 줄기 세포 헌신, 분화 및 티나시스와 같은 황산염 변화 중에 어떻게 조절되고 유지되는지에 중점을 둡니다. 근육 조직에서 단핵 세포의 1%만을 구성하는 성체 골격근 줄기 세포는 근육 소화에서 얻은 단일 세포 현탁액이 부족하기 때문에 High-C, ChIP 및 ATAC 염기서열을 사용하는 염색질 기능 연구에 대한 과제를 제시합니다. 염색질 면역 침전(ChIP)은 게놈 특징을 프로파일링하기 위한 핵심 도구였습니다.스티븐 헤니코프(Steven Henikoff) 박사가 개발한 더 간단하고 효율적인 cut&tag 기법은 특히 희귀 세포 집단의 후성유전학을 연구할 때 ChIP를 능가하는 경우가 많습니다. 사용 편의성은 후성유전학 전문가가 아닌 사람들을 포함한 연구자들의 접근성을 넓혀줍니다.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&#38;Tag) Assay in Mouse Myoblast Research

381 조회수.  Guangzhou Laboratory. 우리 그룹의 연구는 성인 골격근 줄기 세포의 게놈 구조 및 전사가 특히 줄기 세포 헌신, 분화 및 티나시스와 같은 황산염 변화 중에 어떻게 조절되고 유지되는지에 중점을 둡니다. 근육 조직에서 단핵 세포의 1%만을 구성하는 성체 골격근 줄기 세포는 근육 소화에서 얻은 단일 세포 현탁액이 부족하기 때문에 High-C, ChIP 및 ATAC 염기서열을 사용하는 염색질 기능 연구에 대한 과...

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This protocol paper aims to provide the new researchers with the full details of using Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&amp;Tag) to profile the genomic locations of chromatin binding factors, histone marks, and histone variants. CUT&amp;Tag protocols function very well with mouse myoblasts and freshly isolated muscle stem cells (MuSCs). They can easily be applied to many other cell types as long as the cells can be immobilized by Concanavalin-A beads. Compared to CUT&amp;Tag, chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays are time-consuming experiments. ChIP assays require the pre-treatment of chromatin before the chromatic material can be used for immunoprecipitation. In cross-linking ChIP (X-ChIP), pre-treatment of chromatin involves cross-linking and sonication to fragment the chromatin. In the case of native ChIP (N-ChIP), the fragmented chromatins are normally achieved by Micrococcal nuclease (MNase) digestion. Both sonication and MNase digestion introduce some bias to the ChIP experiments. CUT&amp;Tag assays can be finished within fewer steps and require much fewer cells compared to ChIPs but provide more unbiased information on transcription factors or histone marks at various genomic locations. CUT&amp;Tag can function with as few as 5,000 cells. Due to its higher sensitivity and lower background signal than ChIPs, researchers can expect to obtain reliable peak data from merely several millions of reads after sequencing.

Researchers new to the epigenetic field will find CUT&amp;Tag a significantly easier alternative to ChIP assays. CUT&amp;Tag has tremendously benefited the epigenetic studies on rare and primary cell populations, generating high-quality data from very few cells. This protocol describes performing H3K4me1 CUT&amp;Tag assays on mouse myoblasts isolated from mouse hindlimb muscles.