Bu çalışma, Çin Bilim Akademisi'nin Stratejik Öncelikli Araştırma Programı (PH'ye XDA16020400) tarafından desteklenmiştir; Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (PH'ye 32170804).

CUT &#38; Tag Kullanarak Fare Miyoblastlarında Genomik Histon İşaretlerinin Profillenmesi

<ol>
	<li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUT&amp;Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells.">CUT&amp;Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nat Commun. 10 (1), 1930 (2019).</li><li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+generating+high-resolution+maps+of+genome-wide+protein+binding.">A simple method for generating high-resolution maps of genome-wide protein binding.</a> eLife. 4, e09225 (2015).</li><li>Nikitina, T., Wang, D., Gomberg, M., Grigoryev, S. A., Zhurkin, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+micrococcal+nuclease+and+exonuclease+III+digestion+reveals+precise+positions+of+the+nucleosome+core/linker+junctions:+implications+for+high-resolution+nucleosome+mapping.">Combined micrococcal nuclease and exonuclease III digestion reveals precise positions of the nucleosome core/linker junctions: implications for high-resolution nucleosome mapping.</a> J Mol Biol. 425 (11), 1946-1960 (2013).</li><li>Policastro, R. A., Zentner, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+methods+for+genome-wide+profiling+of+protein+binding+sites.">Enzymatic methods for genome-wide profiling of protein binding sites.</a> Brief Funct Genomics. 17 (2), 138-145 (2018).</li><li>Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+expressed+loci+are+vulnerable+to+misleading+ChIP+localization+of+multiple+unrelated+proteins.">Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18602-18607 (2013).</li><li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites.">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> eLife. 6, e21856 (2017).</li><li>Mezger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+chromatin+accessibility+profiling+at+single-cell+resolution.">High-throughput chromatin accessibility profiling at single-cell resolution.</a> Nat Commun. 9, 3647 (2018).</li><li>Zheng, G. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+digital+transcriptional+profiling+of+single+cells.">Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells.</a> Nat Commun. 8, 14049 (2017).</li><li>Nakka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JMJD3+activated+hyaluronan+synthesis+drives+muscle+regeneration+in+an+inflammatory+environment.">JMJD3 activated hyaluronan synthesis drives muscle regeneration in an inflammatory environment.</a> Science. 377 (6606), 666-669 (2022).</li><li>Fu, X., Wang, H., Hu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+activation+in+skeletal+muscle+regeneration.">Stem cell activation in skeletal muscle regeneration.</a> Cell Mol Life Sci. 72 (9), 1663-1677 (2015).</li><li>Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Established+cell+surface+markers+efficiently+isolate+highly+overlapping+populations+of+skeletal+muscle+satellite+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Skelet Muscle. 6, 35 (2016).</li><li>Giordani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-dimensional+single-cell+cartography+reveals+novel+skeletal+muscle-resident+cell+populations.">High-dimensional single-cell cartography reveals novel skeletal muscle-resident cell populations.</a> Mol Cell. 74 (3), 609-621.e6 (2019).</li><li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+inflammation-related+cytokines+promotes+long-term+muscle+stem+cell+expansion.">Combination of inflammation-related cytokines promotes long-term muscle stem cell expansion.</a> Cell Res. 25 (6), 655-673 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+and+transcription+factor+profiling+in+rare+stem+cell+populations+using+CUT&amp;Tag.">Chromatin and transcription factor profiling in rare stem cell populations using CUT&amp;Tag.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100751 (2021).</li><li>Tapscott, S. J., Davis, R. L., Lassar, A. B., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD:+a+regulatory+gene+of+skeletal+myogenesis.">MyoD: a regulatory gene of skeletal myogenesis.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 280, 3-6 (1990).</li><li>Wardle, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Master+control:+transcriptional+regulation+of+mammalian+Myod.">Master control: transcriptional regulation of mammalian Myod.</a> J Muscle Res Cell Motil. 40 (2), 211-226 (2019).</li><li>Local, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+H3K4me1-associated+proteins+at+mammalian+enhancers.">Identification of H3K4me1-associated proteins at mammalian enhancers.</a> Nat Genet. 50 (1), 73-82 (2018).</li><li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome.">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li><li>Faralli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UTX+demethylase+activity+is+required+for+satellite+cell-mediated+muscle+regeneration.">UTX demethylase activity is required for satellite cell-mediated muscle regeneration.</a> J Clin Invest. 126 (4), 1555-1565 (2016).</li><li>Yang, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenic+transcriptional+activation+of+MyoD+mediated+by+replication-independent+histone+deposition.">Myogenic transcriptional activation of MyoD mediated by replication-independent histone deposition.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (1), 85-90 (2011).</li><li>Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+low-cost+chromatin+profiling+with+CUT&amp;Tag.">Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&amp;Tag.</a> Nat Protoc. 15 (10), 3264-3283 (2020).</li></ol>

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Belirli bir CUT & Tag reaksiyonunda gerekli olan spesifik hücre sayısı, tamamen test edilecek histon işaretlerinin / varyantlarının veya kromatin bağlayıcı proteinlerin zenginleştirilmesine dayanır. Normalde H3K4me1, H3K4me3 ve H3K27ac gibi çok zenginleştirilmiş histon işaretleri için 25.000-50.000 miyoblast bir CUT & Tag reaksiyonu için oldukça yeterlidir. Bununla birlikte, bazı nadir kromatin bağlayıcı proteinler 250.000'e kadar hücre gerektirebilir. CUT & Tag tahlillerinde kullanılan hücre say...

CUT & Tag testi, ChIP'lerin bazı açık kusurlarını telafi etmek için icat edildi1. ChIP'lerin iki ana dezavantajı, 1) kromatini parçalarken ortaya çıkan önyargı ve 2) düşük hücre sayılarıyla çalışma beceriksizliğidir. X-ChIP tahlilleri, kromatin fragmanlarını elde etmek için sonikasyon veya MNaz sindirimine dayanırken, N-ChIP, nükleozomları elde etmek için çoğunlukla MNaz sindirimini kullanır. Sonikasyon, promotör bölgeler2 gibi rahat kromatin konumlarına karşı bir önyargı gösterir ve görünüşe göre, MNase sindirimi de gevşemiş kromatin lifleri üzerinde daha verimli çalışır. Ayrıca, bazıları MNaz sindiriminin de DNA dizisine bağlı bir önyargı gösterdiğini bildirmiştir3. Bu nedenle, ChIP tahlillerinin girdi hazırlama adımında, her türlü genomik konumdan kromatin fragmanlarını tamamen rastgele bir şekilde elde etmek imkansızdır. Ayrıca, ChIP tahlilleri normalde CUT & Tag'e kıyasla daha yüksek arka plan sinyalleri üretir ve tepe noktalarının 1,4,5 olduğu yerleri vurgulamak için CUT & Tag'den 10 kat daha fazla okuma gerektirir. Bu, ChIP deneylerinin neden CUT & Tag'den çok daha fazla hücre ile başlaması gerektiğini açıklıyor. Hücre dizilerini incelerken bu bir sorun değildir, çünkü çok yüksek bir hücre sayısı elde etmek için tekrar tekrar geçilebilirler. Bununla birlikte, ChIP testi, nadir veya değerli birincil hücre popülasyonlarını incelemek için kesinlikle güçlü bir epigenetik araç değildir, ancak birincil hücreler açıkça daha pratik ve tıbbi etkilere sahiptir.
Uzun ve karmaşık ChIP prosedürü, bazı araştırmacıları bu tekniği öğrenmekten veya kullanmaktan caydırırken, insanlar immünositokimya (ICC) veya immünofloresan (IF) gibi daha kolay tahlillerle daha rahattır. Bir CUT & Tag testi, esasen ICC ve IF deneylerinin sürecine benzer, ancak yalnızca bir test tüpünde gerçekleşir. CUT & Tag, başlamak için parçalanmış kromatine ihtiyaç duymaz ve bunun yerine, antikor bağlanması için genomun sağlam olması gerekir1. Bir ChIP deneyinin ilk gününde, araştırmacılar normalde, kısa kromatin parçaları antikor-boncuklar 4,5 ile karıştırılmadan önce, sonikasyon veya MNaz sindirimi ile çekirdeklerden parçalanmış kromatinleri hazırlamak için 4 saate kadar harcarlar. Dikkate değer bir tezat olarak, bir CUT & Tag prosedürünün ilk gün iş yükü, hücreleri sadece Concanavalin-A boncuklarına hareketsiz hale getirmek ve daha sonra birincil antikoru hücre boncuklarına eklemektir. Bu sadece ~ 40 dakikagerektirir 1.
Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease'in (CUT&RUN) CUT&Tag'e önemli bir alternatif olduğunu belirtmekte fayda var. CUT&RUN, CUT&TAG ile benzer bir çalışma mekanizması üzerine kurulmuştur. CUT & Tag'de, antikorlar pA / G-Tn5 transpozazı, enzimin her birinin bir kromatin parçasını keseceği ve bu arada kütüphane yapma adaptörleri ile etiketleyeceği tüm yerlere yönlendirirken, CUT & RUN'da pA / G-Tn5'in rolü, işin sadece kesme kısmını gerçekleştiren pA / G-MNaz tarafından oynanır6. Bu nedenle, CUT & Tag ile karşılaştırıldığında, CUT & RUN, kütüphane oluşturma adaptörlerini pA / G-MNaz parçalanmış DNA parçalarınayapıştırmak için ek bir adım gerektirir 7,8. CUT & Tag ve CUT & Run arasındaki yüksek benzerlikler nedeniyle, CUT & Tag'e aşina olan araştırmacılar, CUT & RUN'ı yetkin bir şekilde gerçekleştirmeye kendilerini kolayca adapte edeceklerdir. Ancak, CUT & Tag ve CUT & RUN arasında bazı küçük farklılıklar olduğuna dikkat edilmelidir. CUT & RUN protokolleri normalde yıkama adımlarında fiziksel tuz konsantrasyonunu (~ 150 mM) kullanırken, CUT & Tag'de 300 Dig yıkama tamponunun tuzu yüksektir. Bu nedenle, CUT & Tag, histon işaretlerinin / varyantlarının veya transkripsiyon faktörlerinin profilini çıkarırken arka planı kontrol etmede iyidir, çünkü bu proteinler DNA1'i doğrudan ve güçlü bir şekilde bağlar. CUT & Tag, DNA'yı doğrudan bağlamayan ve kromatine zayıf afinite gösteren kromatinle ilişkili faktörlerin profilini çıkarırken sorunlarla karşılaşabilir. CUT & Tag'deki yüksek tuzlu yıkama adımları, kromatinle ilişkili faktörleri sıyırabilir ve nihai çıktıda sinyal olmamasına neden olabilir. CUT & Tag'in bazı histon olmayan / transkripsiyon olmayan faktör proteinlerini9 profillemek için kullanılabileceği başarılı durumlar olmasına rağmen, zayıf bağlı kromatinle ilişkili proteinleri profillemek için CUT & Tag yerine CUT & RUN'ı öneriyoruz.
Memeliler yetişkinliğe ulaştıktan sonra, iskelet kası dokuları hala kas kök hücreleri içerir. Kas yaralanması sırasında, bu kök hücreler aktive edilebilir ve hasarlı kas liflerini yeniden oluşturmak için hücre sayısı genişlemesi ve farklılaşmasına uğrayabilir10. Bu kök hücreler Kas kök/uydu hücreleri (MuSC'ler) olarak bilinir. MuSC'ler hayvanlardan izole edildikten veya kas yaralanması ile aktive edildikten sonra çoğalmaya başlarlar ve miyoblast haline gelirler.
Fare iskelet kası sindiriminden MuSC'leri elde etmek için, Vcam1 (Cd106), Cd34 ve α7-integrin (Itga7) gibi MuSC yüzey belirteçleri, floresanla aktive edilen hücre sıralama (FACS) sırasında MuSC'leri zenginleştirmek için genellikle tek tek veya kombinasyonlar halinde kullanılır11. Cd31-/Cd45-/Sca1-/Vcam1+ 'nın muhtemelen %>95 saf MuSC'ler elde etmek için en iyi belirteç kombinasyonu olduğu gösterilmiştir12. FACS, taze kaslar sindirildikten hemen sonra saf MuSC'leri izole edebilir. Bununla birlikte, deneysel tasarım, izolasyonlarında saf MuSC'ler gerektirmiyorsa, ön kaplama, %>90 saf miyoblastlar (MuSC soyu) elde etmek için FACS'den daha uygun maliyetlidir.
Farelerden yeni izole edilen MuSC'ler, fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş Ham'ın F10 ortamında verimli bir şekilde çoğalmaz. MuSC'lerin hücre sayısını daha iyi genişletmek ve yeterli miyoblast elde etmek için, FBS yerine sığır büyüme serumu (BGS) kullanılmalıdır. Bununla birlikte, BGS mevcut değilse, Ham'ın F10 tam ortamı (yaklaşık% 20 FBS içerir), miyoblast genişlemesini önemli ölçüde teşvik etmek için eşit hacimde T hücresi koşullu ortam ile karıştırılabilir13. Bu nedenle, bu protokol aynı zamanda T-hücresi ortamı koşullandırılmış MuSC ortamının hazırlanmasını da tanımlayacaktır.
En önemlisi, bu protokol, fare arka bacak kaslarından izole edilen fare miyoblastları üzerinde H3K4me1 CUT & Tag testlerinin gerçekleştirilmesinin tam bir örneğini sağlar. Lütfen bu protokolün diğer hücre tipleri, histon işaretleri ve histon varyantları için de geçerli olduğunu ve okuyucuların yalnızca inceledikleri spesifik histon işaretlerinin veya varyantlarının zenginleşmesine dayalı olarak vakaları için hücre sayılarını veya antikor miktarlarını optimize etmeleri gerektiğini unutmayın.
CUT & Tag veya CUT & RUN'da kullanılabilmesi için, Tn5 veya MNase'nin pA-Tn5, pG-Tn5, pA-MNase veya pG-MNase yapmak için protein A veya protein G ile kaynaştırılması gerekir. Görünüşe göre, hem protein A hem de protein G, pA / G-Tn5 veya pA / G-MNaz üretmek için bu enzimler üzerine aynı anda kaynaştırılabilir. Protein A ve protein G, farklı türlerden IgG'lere farklı afiniteler gösterir. Bu nedenle, protein A ve protein G'yi tamamen enzim üzerine kaynaştırmak bu sorunun üstesinden gelebilir ve enzimi birden fazla türden gelen antikorlarla uyumlu hale getirebilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>233-FB-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin-A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin-A beads</td>
			<td>Bangs Laboratories</td>
			<td>BP531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>300410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3K4me1 antibody&#160;</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab8895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F10 media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11550043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyperactive Universal CUT&#38;Tag Assay Kit for Illumina&#160;</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>TD903</td>
			<td>This kit has been tested by us to function well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack for 1.5 mL EP tubes</td>
			<td>Qualityard</td>
			<td>QYM06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack for 8-PCR tube stripes</td>
			<td>Anosun Magnetic</td>
			<td>CLJ16/21-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0541L</td>
			<td>For library-making PCR reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pA-Tn5</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>S603-01</td>
			<td>Needs to be mounted with adaptors before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5056489001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST535-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody (Guinea Pig anti-rabbit IgG)</td>
			<td>Antibodies-online</td>
			<td>ABIN101961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruePrep Index Kit V2 for Illumina&#160;</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>TD202</td>
			<td>This kit provide Illumina N7XX and N5XX primers&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VAHTS DNA Clean Beads&#160;</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>N411</td>
			<td>Can substitute Ampure XP beads. Can purify CUT&#38;Tag libraries and select DNA fragments by size</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using cleavage under targets and tagmentation (cut&#38;tag) assay in mouse myoblast research

Bu protokol belgesi, yeni araştırmacılara, kromatin bağlanma faktörlerinin, histon işaretlerinin ve histon varyantlarının genomik konumlarını profillemek için Hedefler ve Etiketleme Altında Bölünme (CUT & Tag) kullanmanın tüm ayrıntılarını sağlamayı amaçlamaktadır. CUT & Tag protokolleri, fare miyoblastları ve yeni izole edilmiş kas kök hücreleri (MuSC'ler) ile çok iyi çalışır. Hücreler Concanavalin-A boncukları ile hareketsiz hale getirilebildiği sürece diğer birçok hücre tipine kolayca uygulanabilirler. CUT & Tag ile karşılaştırıldığında, kromatin immünopresipitasyon (ChIP) testleri zaman alıcı deneylerdir. ChIP tahlilleri, kromatik malzeme immünopresipitasyon için kullanılmadan önce kromatinin ön işlemini gerektirir. Çapraz bağlama ChIP'de (X-ChIP), kromatinin ön işlemi, kromatini parçalamak için çapraz bağlama ve sonikasyonu içerir. Doğal ChIP (N-ChIP) durumunda, parçalanmış kromatinler normal olarak Mikrokokal nükleaz (MNaz) sindirimi ile elde edilir. Hem sonikasyon hem de MNase sindirimi, ChIP deneylerine bazı önyargılar getirir. CUT & Tag tahlilleri, ChIP'lere kıyasla daha az adımda tamamlanabilir ve çok daha az hücre gerektirebilir, ancak çeşitli genomik konumlardaki transkripsiyon faktörleri veya histon işaretleri hakkında daha tarafsız bilgi sağlar. CUT & Tag, 5.000 hücreye kadar çalışabilir. ChIP'lerden daha yüksek hassasiyeti ve daha düşük arka plan sinyali nedeniyle, araştırmacılar sıralamadan sonra yalnızca birkaç milyon okumadan güvenilir tepe verileri elde etmeyi bekleyebilirler.

CUT&#38;Tag assay was invented to compensate for some overt flaws of ChIPs1. The two major disadvantages of ChIPs are 1) the bias introduced when fragmenting chromatin and 2) the incompetence to work with low cell numbers. X-ChIP assays rely on either sonication or MNase digestion to get chromatin fragments, whereas N-ChIP mostly uses MNase digestion to get nucleosomes. Sonication shows a bias towards relaxed chromatin locations such as promoter regions2, and apparently, MNase digestion also works more efficiently on relaxed chromatin fibers. Moreover, some reported that MNase digestion also shows a DNA sequence-dependent bias3. Therefore, at the input preparation step of ChIP assays, it is impossible to get chromatin fragments from all kinds of genomic locations in a perfectly random manner. Moreover, ChIP assays normally generate higher background signals compared to CUT&#38;Tag and require over 10 folds more reads than CUT&#38;Tag to accentuate where the peaks are1,4,5. This explains why ChIP experiments have to start with tremendously more cells than CUT&#38;Tag. This is not a problem when studying cell lines as they can be repetitively passaged to achieve a very high cell number. However, the ChIP assay is definitely not a strong epigenetic tool to study rare or precious primary cell populations, although primary cells obviously hold more practical and medical implications.
While the long and complicated ChIP procedure discourages some researchers from learning or using this technique, people are more comfortable with easier assays such as immunocytochemistry (ICC) or immunofluorescence (IF). A CUT&#38;Tag assay essentially resembles the process of ICC and IF experiments but only takes place in a test tube. CUT&#38;Tag does not need fragmented chromatin to start with, and instead, the genome must be intact for antibody binding1. On the first day of a ChIP experiment, researchers normally spend up to 4 h preparing the fragmented chromatins from nuclei with sonication or MNase digestion before the short chromatin pieces can be mixed with antibody-beads4,5. In remarkable contrast, the first-day workload of a CUT&#38;Tag procedure is to just immobilize the cells to Concanavalin-A beads and then to add the primary antibody onto the cell-beads. This only requires ~40 min1.
It is worth mentioning that Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease (CUT&#38;RUN) is an important alternative to CUT&#38;Tag. CUT&#38;RUN was established based on a similar working mechanism as CUT&#38;Tag. In CUT&#38;Tag, the antibodies guide the pA/G-Tn5 transposase to all the locations where the enzyme will each cut out a piece of chromatin and meanwhile tag it with library-making adaptors, while in CUT&#38;RUN, the role of pA/G-Tn5 is played by the pA/G-MNase which only performs the cutting part of the job6. Therefore, compared to CUT&#38;Tag, CUT&#38;RUN requires an additional step which is to glue the library-making adaptors onto the pA/G-MNase-fragmented DNA pieces7,8. Due to the high similarities between CUT&#38;Tag and CUT&#38;RUN, researchers familiar with CUT&#38;Tag will easily adapt themselves to performing CUT&#38;RUN proficiently. However, it should be noted that some minor differences exist between CUT&#38;Tag and CUT&#38;RUN. CUT&#38;RUN protocols normally use the physical concentration of salt (~150 mM) in the washing steps, while in CUT&#38;Tag, the 300-Dig wash buffer is high in salt. Therefore, CUT&#38;Tag is good at controlling the background when profiling histone marks/variants or transcription factors, as these proteins directly and strongly bind DNA1. CUT&#38;Tag may run into problems when profiling chromatin-associated factors that do not directly bind DNA and show weak affinity to the chromatin. High salt washing steps in CUT&#38;Tag may strip off chromatin-associated factors and cause no signals in the final output. Although there are successful cases where CUT&#38;Tag can be used to profile some non-histone/non-transcription factor proteins9, we still recommend CUT&#38;RUN over CUT&#38;Tag to profile weakly-bound chromatin-associated proteins.
After mammals reach adulthood, their skeletal muscle tissues still contain muscle stem cells. During muscle injury, these stem cells can be activated and undergo cell number expansion and differentiation to regenerate damaged muscle fibers10. These stem cells are known as Muscle stem/satellite cells (MuSCs). After MuSCs are isolated from animals or once activated by muscle injury, they start proliferating and become myoblasts.
To obtain MuSCs from mouse skeletal muscle digest, MuSC surface markers such as Vcam1 (Cd106), Cd34, and &#945;7-integrin (Itga7) are often used individually or in combinations to enrich MuSCs during fluorescence-activated cell sorting (FACS)11. It has been shown that Cd31-/Cd45-/Sca1-/Vcam1+ is probably the best marker combination to get &#62;95% pure MuSCs12. FACS can isolate pure MuSCs right after fresh muscles are digested. However, if the experimental design does not require pure MuSCs right at their isolation, pre-plating is more cost-effective than FACS to obtain &#62;90% pure myoblasts (MuSC progeny).
MuSCs freshly isolated from mice do not proliferate efficiently in Ham&#39;s F10 media supplemented with fetal bovine serum (FBS). To better expand the cell number of MuSCs and get sufficient myoblasts, bovine growth serum (BGS) should be used instead of FBS. However, if BGS is not available, Ham&#39;s F10 full media (containing about 20% FBS) can be mixed with an equal volume of T-cell conditional media to dramatically promote myoblast expansion13. Therefore, this protocol will also describe the preparation of T-cell media conditioned MuSC media.
Most importantly, this protocol provides a complete example of performing H3K4me1 CUT&#38;Tag assays on mouse myoblasts isolated from mouse hindlimb muscles. Please note that this protocol also applies to other cell types and histone marks and histone variants, and readers only need to optimize the cell numbers or antibody amounts for their cases based on the enrichment of the specific histone marks or variants they study.
In order to be used in CUT&#38;Tag or CUT&#38;RUN, the Tn5 or MNase needs to be fused with protein A or protein G to make pA-Tn5, pG-Tn5, pA-MNase, or pG-MNase. Apparently, both protein A and protein G can be fused onto these enzymes at the same time to generate pA/G-Tn5 or pA/G-MNase. Protein A and protein G show differential affinities to IgGs from different species. Therefore, fusing protein A and protein G altogether onto the enzyme can overcome this problem and make the enzyme compatible with antibodies from multiple species.

Yazar Spotlight: Kas Kök Hücre Çalışmalarında Zorluklar ve Yenilikler Arasında Gezinmek

Fare Miyoblast Araştırmalarında Hedefler Altında Bölünme ve Etiketleme (CUT &#38; Tag) Testinin Kullanılması

Hücreleri Concanavalin-A boncuklarına bağlamadan önce, mikroskop altında hücre süspansiyonunu kontrol edin. Buna göre, hücreleri Concanavalin-A boncukları ile inkübe ettikten sonra, numune tüplerini manyetik rafa koyun ve süpernatant bir mikroskop kullanılarak tekrar gözlemlenmelidir. Bu, hücrelerin Concanavalin-A boncukları tarafından ne kadar verimli bir şekilde yakalandığını değerlendirmek içindir. 7 x 105 hücre/mL içeren yıkama tamponu mikroskop altında Şe...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Navigating Challenges and Innovations in Muscle Stem Cell Studies at JoVE.com

Epigenetik alanda yeni olan araştırmacılar, CUT & Tag'i ChIP tahlillerine göre önemli ölçüde daha kolay bir alternatif bulacaklar. CUT & Tag, nadir ve birincil hücre popülasyonları üzerindeki epigenetik çalışmalardan büyük ölçüde yararlandı ve çok az hücreden yüksek kaliteli veriler üretti. Bu protokol, fare arka bacak kaslarından izole edilen fare miyoblastları üzerinde H3K4me1 CUT & Tag testlerinin gerçekleştirilmesini açıklar.

This protocol paper aims to provide the new researchers with the full details of using Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&amp;Tag) to profile ...

Grubumuzun araştırması, yetişkin iskelet kası kök hücrelerinde genom yapısının ve transkripsiyonun, özellikle kök hücre bağlılığı, farklılaşması ve tinasisis gibi sülfat değişiklikleri sırasında nasıl düzenlendiğine ve sürdürüldüğüne odaklanmaktadır. Kas dokusundaki tek çekirdekli hücrelerin sadece %1'ini içeren yetişkin iskelet kası kök hücreleri, kas sindiriminden elde edilen tek hücreli süspansiyonlardaki kıtlıkları nedeniyle High-C, ChIP'ler ve ATAC dizilimi kullanan kromatin özellik çalışmaları için bir zorluk teşkil etmektedir. Kromatin immüno-çökeltme, ChIP, genom özelliklerinin profilini çıkarmak için önemli bir araç olmuştur.Dr.Steven Henikoff tarafından geliştirilen daha basit, daha verimli bir kesme ve etiketleme tekniği, özellikle nadir hücre popülasyonlarında epigenetik çalışmalarında, genellikle ChIP'yi aşar. Kullanım kolaylığı, epigenetik olmayan uzmanlar da dahil olmak üzere araştırmacılar için erişilebilirliği genişletir.

using-cleavage-under-targets-tagmentation-cut-tag-assay-mouse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&#38;Tag) Assay in Mouse Myoblast Research

439 Görüntüleme.  Guangzhou Laboratory. Grubumuzun araştırması, yetişkin iskelet kası kök hücrelerinde genom yapısının ve transkripsiyonun, özellikle kök hücre bağlılığı, farklılaşması ve tinasisis gibi sülfat değişiklikleri sırasında nasıl düzenlendiğine ve sürdürüldüğüne odaklanmaktadır. Kas dokusundaki tek çekirdekli hücrelerin sadece %1'ini içeren yetişkin iskelet kası kök hücreleri, kas sindiriminden elde edilen tek hücreli süspansiyonlardaki kıtlıkları nedeniyle High-C, ChIP'ler...

Video: Yazar Spotlight: Kas Kök Hücre Çalışmalarında Zorluklar ve Yenilikler Arasında Gezinmek

This protocol paper aims to provide the new researchers with the full details of using Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&amp;Tag) to profile the genomic locations of chromatin binding factors, histone marks, and histone variants. CUT&amp;Tag protocols function very well with mouse myoblasts and freshly isolated muscle stem cells (MuSCs). They can easily be applied to many other cell types as long as the cells can be immobilized by Concanavalin-A beads. Compared to CUT&amp;Tag, chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays are time-consuming experiments. ChIP assays require the pre-treatment of chromatin before the chromatic material can be used for immunoprecipitation. In cross-linking ChIP (X-ChIP), pre-treatment of chromatin involves cross-linking and sonication to fragment the chromatin. In the case of native ChIP (N-ChIP), the fragmented chromatins are normally achieved by Micrococcal nuclease (MNase) digestion. Both sonication and MNase digestion introduce some bias to the ChIP experiments. CUT&amp;Tag assays can be finished within fewer steps and require much fewer cells compared to ChIPs but provide more unbiased information on transcription factors or histone marks at various genomic locations. CUT&amp;Tag can function with as few as 5,000 cells. Due to its higher sensitivity and lower background signal than ChIPs, researchers can expect to obtain reliable peak data from merely several millions of reads after sequencing.

Researchers new to the epigenetic field will find CUT&amp;Tag a significantly easier alternative to ChIP assays. CUT&amp;Tag has tremendously benefited the epigenetic studies on rare and primary cell populations, generating high-quality data from very few cells. This protocol describes performing H3K4me1 CUT&amp;Tag assays on mouse myoblasts isolated from mouse hindlimb muscles.