تم تمويل هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82130113) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82204765) ، ومؤسسة علوم الطبيعة في سيتشوان (2022NSFSC1470) ، ومشروع التمويل الخاص لما بعد الدكتوراه في مقاطعة سيتشوان (TB2023020) وبرنامج تعزيز أبحاث علماء Xinglin بجامعة تشنغدو للطب الصيني التقليدي (BSH2021030). توفر هذه الأموال الدعم من حيث المعدات التجريبية والمواد التجريبية ورسوم النشر.

1. التحضير
<ol><li>إعداد العينة<ol><li>استخدم ميزان حساسية 1/10000 لوزن 0.25 جم (الوزن الجاف) من APB في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 3 مل ، وأضف 2.5 مل من الميثانول ، ثم صوتنة لمدة 30 دقيقة (قوة 240 واط ، تردد 40 كيلو هرتز).</li>
		<li>قم بإجراء الطرد المركزي عند 1.2 × جم لمدة 5 دقائق ، واجمع المادة الطافية ، وقم بالتصفية من خلال مرشح غشاء بحجم مسام 0.22 ميكرومتر.</li>
	</ol></li>
	<li>تحضير المواد التجريبية<ol><li>قم بإعداد المرحلة المتنقلة ثنائية الأبعاد ، واستخدم الأسيتونيتريل كمرحلة عضوية B ، وقم بتكوين 0.1٪ من حمض الفورميك عالي النقاء كمرحلة مائية A.</li>
		<li>قم بإجراء الترشيح على مرحلتين (0.22 ميكرومتر) وصوتنة باستخدام جهاز الموجات فوق الصوتية (40 كيلو هرتز) لمدة 15 دقيقة. قم بتطهير المرحلة المتنقلة المستبدلة لإزالة الفقاعات. في هذه التجربة ، تم استخدام العمود C18 كعمود 1D ، والعمود المحب للماء كعمود 2D ، وتم تركيب العمود على الجهاز.</li>
	</ol></li>
	<li>تعديل نسبة التحويلة المناسبة<ol><li>قم بتوصيل خط إخراج أداة 2D-LC من خلال نقطة الإنطلاق بمدخل الكتلة والطرف الآخر من نقطة الإنطلاق بخط محول. اضبط معدل التدفق على قيمة مناسبة للتأكد من أن معدل التدفق إلى الطيف الكتلي هو 0.3-0.5 مل / دقيقة. ملاحظة: نظرا لأن البعد الثاني من 2D-LC عادة ما يتم ضبطه فوق 2 مل / دقيقة ، فإن معدل التدفق هذا كبير جدا بالنسبة لمرض التصلب العصبي المتعدد ، لذلك من الضروري إجراء انقسام.</li>
	</ol></li>
</ol>2. عملية 2D-LC
<ol><li>انقر نقرا مزدوجا فوق رمز Instrument 1 Online ، وستتواصل محطة العمل الكيميائية تلقائيا مع 1260 LC وتدخل محطة العمل.</li>
	<li>لإعداد معلمة طريقة 2D-LC ، حدد شاشة التحكم في الطريقة والتشغيل من القائمة عرض لاستدعاء الواجهة المطلوبة ، والتي سيتم إدخالها عادة افتراضيا. انقر فوق وحدة الحاقن ، وانقر بزر الماوس الأيمن فوق الطريقة ، واضبط حجم الحقن ومعدل التدفق وتدرج وقت الطور المتحرك لمضخة 1D.</li>
	<li>أدخل وقت التشغيل النموذجي ضمن وقت الإيقاف. انقر فوق القائمة الرئيسية أداة وانقر فوق طريقة 2D-LC في القائمة المنسدلة. حدد شامل في وضع 2D-LC. أدخل دقيقتين في وقت التعديل ، 1.9 دقيقة في وقت توقف التدرج ثنائي الأبعاد . اضبط إعدادات التدفق على 2 مل. قم بتحرير 2D-Gradient واضبطه على الأطوال الموجية. بعد تحرير الطريقة ، حدد حفظ الطريقة باسم في قائمة الطريقة لتسمية الطريقة الجديدة ، ثم انقر فوق موافق. ملاحظة: تتطلب مضخة النقل الخارجية الإعداد اليدوي لمعدل التدفق.</li>
</ol>3. عملية مرض التصلب العصبي المتعدد
<ol><li>قم بتشغيل مفتاح مضخة التفريغ. افتح الصمام الرئيسي لأسطوانة الأرجون وصمام مقسم الضغط واضبط الضغط على حوالي 0.3 ميجا باسكال. افتح صمام النيتروجين.</li>
	<li>انتظر 8 ساعات على الأقل لضمان فراغ مناسب للظروف التجريبية. تأكد من أن ضغط الهواء للأرجون والنيتروجين مرتفع بدرجة كافية قبل التحليل.</li>
	<li>لتشغيل برنامج التحكم MS ، انقر فوق مصدر التسخين SEI في لوحة البرنامج وأدخل معلمات MS ، بما في ذلك درجة حرارة السخان (350 درجة مئوية) ، ومعدل تدفق الغمد (35 أرب) ، ومعدل تدفق الهواء الإضافي (15 أرب) ، وجهد الرش (3.8 كيلو فولت في الوضع الإيجابي ، -2.5 كيلو فولت في الوضع السلبي) ، ودرجة حرارة الشعيرات الدموية (275 درجة مئوية). انقر فوق الزر "تطبيق " لتنشيط مصدر الأيون.</li>
	<li>لإعداد طريقة MS ، أدخل قيما لتكوين وقت الاستحواذ والقطبية ونطاق الكتلة ورقم قيمة النقل ومدة قيمة النقل والمزيد. ضبط وقت تشغيل MS (دقيقة): 93.00. إعداد تفاصيل ScanEvent: ITMS + c norm o (100.0-1200.0) ، CV = 0.0v. ITMS + c norm Dep MS / MS ، الأيونات الأكثر كثافة من (1): نوع التنشيط: CID ، الحد الأدنى للإشارة المطلوبة: 500 ، عرض العزل: 2.00 ، Coll. الطاقة الطبيعية: 35.0 ، حالة الشحن الافتراضية: 3 ، التنشيط Q: 0.250 ، وقت التنشيط: 93.000. لتعيين الإعدادات المعتمدة على البيانات ، استخدم إعدادات قطبية منفصلة على أنها معطلة ، خسارة محايدة في الأعلى: 3 ، المنتج في الأعلى: 3. انقر فوق حفظ لتكوين الإعدادات كطريقة الأداة. ملاحظة: نهاية وقت التشغيل متوافق مع 2D-LC.</li>
	<li>انقر فوق الزر إعداد التسلسل لفتح جدول التسلسل. أدخل نوع العينة واسم الملف والمسار ومعرف العينة وطريقة الأداة والموقع وكمية الحقن والمعلومات الأخرى في النموذج.</li>
	<li>انقر فوق الزر حفظ لتسجيل قائمة التسلسل ، ثم انقر فوق الزر بدء التحليل لإعداد وبدء اكتساب MS. انقر فوق تشغيل التحكم على أداة 2D-LC وحدد طريقة التشغيل. في الوقت نفسه ، تنقر أداة MS أيضا على زر التشغيل . ملاحظة: نظرا لعدم التحكم في 2D-LC وMS بواسطة نفس البرنامج في هذه التجربة ، يجب إعدادهما على كلا الجهازين بشكل منفصل.</li>
</ol>4. تشغيل الشبكة الجزيئية
<ol><li>إعداد البيانات: تصدير البيانات الطيفية للكتلة الخام 2D-HPLC-MS وتحويل البيانات الطيفية للكتلة الثانوية إلى بيانات mzXML أو mzML عبر برنامج تحويل Msconvert الخاص ب ProteoWizard. (http://proteowizard.sourceforge.net/).</li>
	<li>لتحميل البيانات ، قم بتنزيل برنامج WinSCP على الموقع الرسمي وتحميل بيانات mzML إلى الحساب الذي تم إنشاؤه بواسطة GNPS عبر بروتوكول FTP. بمجرد اكتمال التثبيت ، قم بتشغيل WinSCP.</li>
	<li>الاتصال بخادم GNPS FTP: في واجهة WinSCP ، في صفحة تكوين جلسة العمل ، املأ معلومات الاتصال التالية: بروتوكول الملف: حدد FTP. بالنسبة إلى اسم المضيف: أدخل massive.ucsd.edu.، لرقم المنفذ: احتفظ بالرقم الافتراضي 22.</li>
	<li>أدخل رقم الحساب وكلمة المرور. بعد ملء المعلومات المذكورة أعلاه ، انقر فوق زر تسجيل الدخول لإنشاء اتصال بخادم GNPS FTP.</li>
	<li>قم بإنشاء شبكات جزيئية عن طريق فتح متصفح ويب وزيارة موقع GNPS على الويب (https://gnps.ucsd.edu/). يحتاج المستخدمون الجدد إلى التسجيل للحصول على حساب ثم تسجيل الدخول.</li>
	<li>على الواجهة الرئيسية لموقع GNPS على الويب ، انقر فوق علامة التبويب المهام في شريط التنقل العلوي وحدد إنشاء مهمة جديدة من القائمة المنسدلة. في صفحة إنشاء المهمة، انقر فوق الزر إضافة ملفات، ثم حدد ملف البيانات وقم بتحميله. (على سبيل المثال ، تنسيق mzML).</li>
	<li>في علامة التبويب معلمات المهمة ، قم بتعيين المعلمات المختلفة التي تنشئ MN. تتضمن هذه المعلمات خوارزمية استخراج الذروة ، وقيمة ذروة السفر ، وطريقة حساب التشابه ، وما إلى ذلك. قم بإجراء إعدادات المعلمة المناسبة حسب الحاجة. انقر فوق الزر تشغيل التحليل في أسفل الصفحة لتشغيل المهمة.</li>
	<li>بعد تشغيل المهمة، ابحث عن المهمة التي تم إنشاؤها في قائمة المهام وانقر فوق اسم الخدمة لعرض نتائج التحليل. يوفر موقع الويب مخططات MN والبدائل والشبكات التكافلية والمعلومات الأخرى ذات الصلة.</li>
</ol>

تحليل APB للنباتات الطبية التبتية باستخدام 2D-HPLC-MS مع الشبكات الجزيئية

<ol>
	<li>Luo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+Tibetan+and+traditional+Chinese+medicine+body+constitutions:+A+cross-sectional+study+of+Tibetan+college+students+in+the+Tibet+Autonomous+Region.">Correlation between Tibetan and traditional Chinese medicine body constitutions: A cross-sectional study of Tibetan college students in the Tibet Autonomous Region.</a> J Tradl Chinese Med Sci. 5 (3), 215-221 (2018).</li><li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+identification+of+compound+structure+in+Tibetan+medicine+using+ion+trap+mass+spectrometry+and+multiple-stage+fragmentation+analysis.">Standardized identification of compound structure in Tibetan medicine using ion trap mass spectrometry and multiple-stage fragmentation analysis.</a> J Vis Exp. (193), 65054 (2023).</li><li>Kumar, P. R., Dinesh, S. R., Rini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LCMS-a+review+and+a+recent+update.">LCMS-a review and a recent update.</a> J Pharm Pharm Sci. 5, 377-391 (2016).</li><li>Yan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategy+for+the+identification+and+quantitative+analysis+of+the+phytochemicals+of+traditional+Chinese+medicine+by+LC-MS/MS.">Strategy for the identification and quantitative analysis of the phytochemicals of traditional Chinese medicine by LC-MS/MS.</a> Acta Pharm Sinica. 55 (7), 1494-1503 (2020).</li><li>Iguiniz, M., Heinisch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+liquid+chromatography+in+pharmaceutical+analysis.+Instrumental+aspects,+trends+and+applications.">Two-dimensional liquid chromatography in pharmaceutical analysis. Instrumental aspects, trends and applications.</a> J Pharma Biomed Anal. 145, 482-503 (2017).</li><li>Ye, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+progress+of+2D-LC+in+analysis+and+quality+control+of+traditional+Chinese+medicine.">Application progress of 2D-LC in analysis and quality control of traditional Chinese medicine.</a> Chem Reag. 44 (8), 1103-1110 (2022).</li><li>Cao, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+comprehensive+two-dimensional+hydrophilic+interaction+chromatography+x+reversed-phase+liquid+chromatography+coupled+with+hybrid+linear+ion+trap+Orbitrap+mass+spectrometry+for+the+analysis+of+phenolic+acids+in+Salvia+miltiorrhiza.">Online comprehensive two-dimensional hydrophilic interaction chromatography x reversed-phase liquid chromatography coupled with hybrid linear ion trap Orbitrap mass spectrometry for the analysis of phenolic acids in Salvia miltiorrhiza.</a> J Chromatogr A. 1536, 216-227 (2018).</li><li>Cao, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+and+quantitative+characterization+of+phenolic+and+diterpenoid+constituents+in+Danshen+(Salvia+miltiorrhiza)+by+comprehensive+two-dimensional+liquid+chromatography+coupled+with+hybrid+linear+ion+trap+Orbitrap+mass.">Qualitative and quantitative characterization of phenolic and diterpenoid constituents in Danshen (Salvia miltiorrhiza) by comprehensive two-dimensional liquid chromatography coupled with hybrid linear ion trap Orbitrap mass.</a> J Chromatogr. 1427, 79-89 (2016).</li><li>Wang, J., Ren, X., Wen, C., Xu, Y., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+characterization+of+unknown+impurities+in+rutin+tablets+using+trap-free+two-dimensional+liquid+chromatography+coupled+with+ion+trap/time-of-flight+mass+spectrometry.">Separation and characterization of unknown impurities in rutin tablets using trap-free two-dimensional liquid chromatography coupled with ion trap/time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 34 (10), e8739 (2020).</li><li>Ma, L. J., Ma, N., Cao, J. L., Wan, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+influence+of+different+drying+methods+on+chemical+components+of+Panax+notoginseng+leaves+by+heart-cutting+two-dimensional+liquid+chromatography+coupled+to+orbitrap+high-resolution+mass+spectrometry.">Characterizing the influence of different drying methods on chemical components of Panax notoginseng leaves by heart-cutting two-dimensional liquid chromatography coupled to orbitrap high-resolution mass spectrometry.</a> Food Chem. 369, 130965 (2022).</li><li>Wong, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untargeted+profiling+of+Glycyrrhiza+glabra+extract+with+comprehensive+two-dimensional+liquid+chromatography-mass+spectrometry+using+multi-segmented+shift+gradients+in+the+second+dimension:+Expanding+the+metabolic+coverage.">Untargeted profiling of Glycyrrhiza glabra extract with comprehensive two-dimensional liquid chromatography-mass spectrometry using multi-segmented shift gradients in the second dimension: Expanding the metabolic coverage.</a> Electrophoresis. 39 (15), 1993-2000 (2018).</li><li>Cao, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensively+qualitative+and+quantitative+analysis+of+ginsenosides+in+Panax+notoginseng+leaves+by+online+two-dimensional+liquid+chromatography+coupled+to+hybrid+linear+ion+trap+Orbitrap+mass+spectrometry+with+deeply+optimized+dilution+and+modulation+system.">Comprehensively qualitative and quantitative analysis of ginsenosides in Panax notoginseng leaves by online two-dimensional liquid chromatography coupled to hybrid linear ion trap Orbitrap mass spectrometry with deeply optimized dilution and modulation system.</a> Anal Chim Acta. 1079, 237-251 (2019).</li><li>Nothias, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feature-based+molecular+networking+in+the+GNPS+analysis+environment.">Feature-based molecular networking in the GNPS analysis environment.</a> Nat methods. 17 (9), 905-908 (2020).</li><li>Qin, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS/MS-based+molecular+networking:+an+efficient+approach+for+natural+products+Dereplication.">MS/MS-based molecular networking: an efficient approach for natural products Dereplication.</a> Molecules. 28 (1), 157 (2023).</li><li>Qu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+multidimensional+chromatography-mass+spectrometry+and+feature-based+molecular+networking+methods+for+the+systematic+characterization+of+compounds+in+the+supercritical+fluid+extract+of+Tripterygium+wilfordii+Hook+F.">Combining multidimensional chromatography-mass spectrometry and feature-based molecular networking methods for the systematic characterization of compounds in the supercritical fluid extract of Tripterygium wilfordii Hook F.</a> Analyst. 148 (1), 61-73 (2023).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enhanced+analytical+strategy+integrating+offline+two-dimensional+liquid+chromatography+with+high-resolution+accurate+mass+spectrometry+and+molecular+networking:+Comprehensive+characterization+of+HuangLian+JieDu+Decoction+as+a+case+study.">An enhanced analytical strategy integrating offline two-dimensional liquid chromatography with high-resolution accurate mass spectrometry and molecular networking: Comprehensive characterization of HuangLian JieDu Decoction as a case study.</a> J Sep Sci. 45 (14), 2734-2745 (2022).</li><li>Dai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+profiling+of+Sanguisorba+officinalis+using+offline+two-dimensional+mixed-mode+liquid+chromatography+&#215;+reversed-phase+liquid+chromatography,+tandem+high-resolution+mass+spectrometry,+and+molecular+network.">Comprehensive profiling of Sanguisorba officinalis using offline two-dimensional mixed-mode liquid chromatography &#215; reversed-phase liquid chromatography, tandem high-resolution mass spectrometry, and molecular network.</a> J Sep Sci. 45 (10), 1727-1736 (2022).</li><li>Chen, Y., Montero, L., Luo, J., Li, J., Schmitz, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+new+at-column+dilution+(ACD)+modulator+for+the+two-dimensional+RP&#215;+HILIC+analysis+of+Buddleja+davidii.">Application of the new at-column dilution (ACD) modulator for the two-dimensional RP&#215; HILIC analysis of Buddleja davidii.</a> Anal Bioanal Chem. 412 (7), 1483-1495 (2020).</li><li>Zhou, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+action+and+toxicity+of+Aconite+and+its+main+components.">Pharmacological action and toxicity of Aconite and its main components.</a> Acta Pharm Sinica. (05), 394-400 (1983).</li><li>Shao, X., Liu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+the+role+of+14-Benzoylaconine+in+rheumatoid+arthritis.">Progress in the role of 14-Benzoylaconine in rheumatoid arthritis.</a> Chinese J Pharmacol Toxicol. 33 (10), 917 (2019).</li><li>Hao, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Study on the chemical constituents of the alkaloids from the root of Aconitum flavum HandMazz and its anti-tumor activities. , (2015).</li><li>Han, X., Hou, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+progress+on+the+pharmacological+effects+and+toxicity+of+Aconitine.">Research progress on the pharmacological effects and toxicity of Aconitine.</a> J China Prescrip Drug. 12 (12), 149-150 (2014).</li></ol>

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

كان التركيز الأساسي لهذه التجربة هو تحسين طريقة جزئية في إطار فصل الطور السائل ثنائي الأبعاد. لتحقيق ذلك ، تم دمج معدل تخفيف جديد في العمود بسلاسة في نظام كروماتوغرافيا السائل ثنائي الأبعاد (2D-LC). كان هذا التعديل الفني ذا أهمية قصوى لأنه رفع بشكل كبير من الكفاءة في تحديد المكونات الكيميائي?...

الطب التبتي هو جزء لا يتجزأ من الطب الصيني التقليدي ، والتمسك بمبادئ الممارسات الطبية التبتية ، ويستخدم للوقاية من الأمراض وعلاجها1. ومع ذلك ، يحتوي طب الأعشاب التبتي على مكونات كيميائية نباتية معقدة تتميز بتقلبات كبيرة في المحتوى. أصبح الفهم المحدود للعناصر الأساسية النشطة بيولوجيا عنق الزجاجة في تحديث الطب التبتي2. تم استخدام تطبيق قياس الطيف الكتلي اللوني السائل (LC-MS) ، الذي يجمع بين قوة الفصل القوية للكروماتوغرافيا والحساسية العالية لقياس الطيف الكتلي (MS) ، على نطاق واسع في تحليل الطب الطبيعي3. ومع ذلك ، نظرا لمحدودية آلية فصل واحدة ، تميل المكونات ذات الهياكل المتشابهة للغاية إلى الذوبان في فصل كروماتوغرافيا سائلة أحادية البعد. في التحليل الطيفي الكتلي اللاحق ، يصعب اكتشاف المكونات ذات الوفرة المنخفضة بسبب قمع الأيونات الناجم عن المكونات عالية الوفرة4.
يمثل 2D-HPLC ، الذي يرمز إلى اللوني السائل عالي الأداء ثنائي الأبعاد ، طريقة كروماتوغرافية جديدة تجمع بشكل متناغم بين آليات الفصل المختلفة باستخدام زوج من الأعمدة. وهذا يشمل اندماج أو تناوب كروماتوغرافيا الطور العادي مع كروماتوغرافيا سائلة معكوسة الطور وكروماتوغرافيا سائلة للتفاعل المائي مع كروماتوغرافيا سائلة عكسيةالطور 5. من خلال دمج هذه الخصائص الكروماتوغرافية التكميلية ، يتم تحقيق قدرة الفصل المحسنة ، والتصدي بفعالية للتحديات التي تسببها مصفوفات العينات المعقدة6. علاوة على ذلك ، من خلال اقتران اللوني ثنائي الأبعاد مع مرض التصلب العصبي المتعدد ، يمكن دمج قدرة الفصل القوية ل 2D-HPLC وقدرة الكشف عن الحساسية العالية لمرض التصلب العصبي المتعدد بشكل كامل ، مما يوفر الدعم لدراسة أنظمة الأدوية المعقدة ومكوناتها الأساسية7،8،9.
يتميز الطب التبتي عادة بمجموعة متعددة الأوجه من المكونات والوظائف ، حيث توجد المكونات النشطة عادة في تركيبات معقدة وبتركيزات قليلة. من خلال دمج 2D-LC كنظام فصل قوي و MS ككاشف حساس للغاية ، يمكن معالجة التحديات التي تفرضها العينات المعقدة من حيث الفصل وتحديد الهوية بشكل أكثر فعالية10،11،12. يساهم هذا الاندماج بشكل كبير في تطوير استكشاف التركيب الكيميائي للطب التبتي.
بغض النظر عما إذا كان LC-MS تقليديا أو 2D-LC-MS ، يمكن الحصول على كمية هائلة من المعلومات. ومع ذلك ، فإن استخراج المعلومات الهيكلية لمكونات النظام المعقدة من هذا الكم الهائل من المعلومات كان دائما تحديا كبيرا. لذلك ، طور الباحثون طرقا مختلفة لفحص بيانات مرض التصلب العصبي المتعدد واستخراجها. الشبكات الجزيئية الاجتماعية للمنتجات الطبيعية العالمية (GNPS) هي عبارة عن منصة لتنظيم بيانات MS / MS وتصورها حيث يمكن تحميل بيانات قياس الطيف الكتلي 2D-LC-MS13. يعتبر كل طيف متجه ومقارنته بجميع الأطياف الأخرى باستخدام تشابه جيب التمام. عندما يتجاوز التشابه بين طيفين عتبة ، يتم توصيلهما في شبكة جزيئية (MN). يمكن استخدام هذا للتعرف السريع على المركبات المعروفة وتحديد مختلف المنتجات الطبيعية غير المعروفة14.
عادة ما يكون للطب التبتي وظائف متعددة ، لكن تركيبته المعقدة واختلافات تركيزه الكبيرة تجعل من الصعب توضيح العلاقة بين الوظيفة والأساس المادي بشكل فعال15. تتطلب الدراسة المتعمقة للطب التبتي التوصيف المنهجي لأكبر عدد ممكن من المكونات. في إطار هذه الدراسة ، نعتزم استخدام APB في الطب التبتي كهدف بحثي لتوضيح استراتيجية وعملية الدراسة المنهجية للمكونات الكيميائية المعقدة للطب التبتي باستخدام تقنية 2D-HPLC-MS وتقنية MN. في بناء نظام الكروماتوغرافيا 2D ، قمنا بدمج الكروماتوغرافيا السائلة ذات الطور العكسي والكروماتوغرافيا السائلة للتفاعل المائي مع آليات فصل كبيرة لتحقيق فصل أكثر فعالية للمكونات المعقدة ل APB16. بالإضافة إلى ذلك ، للتغلب على عدم توافق المذيبات بين البعدين ، تم اعتماد وضع تعديل التخفيف في العمود. من خلال الجمع بين قدرة الفصل القوية ل 2D-LC مع قدرة الكشف عالية الحساسية ل MS ، يتم الحصول على المعلومات الطيفية للمكونات المعقدة في APB بشكل أكثر فعالية وشمولية. علاوة على ذلك ، من خلال الشبكة وتصور المعلومات الطيفية الضخمة بواسطة تقنية MN ، يتم تحليل مكونات APB بشكل منهجي. من المتوقع أن يتم تطبيق الاستراتيجية والعملية الموضحة في هذه الدراسة على دراسة الأدوية التبتية الأخرى ، وتعزيز البحث على الأساس المادي للطب التبتي ، وهو أمر ذو أهمية كبيرة للنهوض بموارد الطب التبتي وتحسين معايير مراقبة الجودة للأعشاب التبتية17. يوضح الشكل 1 العملية التجريبية الإجمالية.
في التجربة المقدمة هنا ، تم إدخال معدل تخفيف جديد في العمود في نظام الكروماتوغرافيا السائلة ثنائية الأبعاد Agilent (2D-LC)18. عن طريق إضافة مضخة توصيل مستقلة ، تم تغيير مسار تدفق التحليل ، مما أدى إلى تعامد عال لتحليل 2D-LC. يتم إنجاز الاقتران والتبديل بين البعدين بواسطة صمامين من ستة منافذ ، كما هو موضح في الشكل 2. عندما يتم ملء حلقة عينة واحدة في البعد الأول ، يتم تحليل حلقة عينة أخرى في البعد الثاني. هذا يعني أن وقت ملء حلقة 1D ووقت تشغيل 2D متساويان. وهذا يتطلب التدرج السريع الناتج عن المضخة الثنائية في البعد الثاني. لا تضيع أي قمم عند تحليل النفايات السائلة بأكملها. هذا مفيد بشكل خاص لتحليل العينات غير المعروفة. ينتج عنه عدد كبير من كروماتوجرام 2D التي تحتاج إلى دمجها لتحليل البيانات.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher chemical</td>
			<td>F22M81203</td>
			<td>Mobile phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aconitum pendulum</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Herb medicine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1290 Infinity (II) 2D-LC&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2198-90001</td>
			<td>Liquid chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable syringes</td>
			<td>Chengdu Keen experimental equipment</td>
			<td>/</td>
			<td>1ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EP tube</td>
			<td>Chengdu Keen experimental equipment</td>
			<td>/</td>
			<td>3ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid phase injection bottle</td>
			<td>Chengdu Keen experimental equipment</td>
			<td>/</td>
			<td>1.5ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ XL Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>LTQ21991</td>
			<td>Mass Spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microporous membranes&#160;</td>
			<td>Chengdu Keen experimental equipment</td>
			<td>/</td>
			<td>0.22&#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate XB-C18,5 &#956;m,2.1 x 200 mm</td>
			<td>Welch</td>
			<td>00201-31015</td>
			<td>Reversed-phase column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>GT Sonic</td>
			<td>UGT20DEC048Y</td>
			<td>Ultrasonic Cleaner 240W 40KHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XAmide,3 &#956;m,100A</td>
			<td>Dalian Mondi Technology</td>
			<td>D2019110601</td>
			<td>Hydrophilic column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

2d-hplc-ms technology combined with molecular network for the identification of components in tibetan medicine aconitum pendulum

في هذه الدراسة ، تم استخدام نهج شامل ، باستخدام تقنية 2D-HPLC-MS جنبا إلى جنب مع الشبكة الجزيئية لكشف التركيب الكيميائي المعقد للنباتات الطبية التبتية APB. من خلال تنفيذ 2D-HPLC ، تم تحقيق فصل معزز للمخاليط المعقدة ، مما مكن من عزل المركبات الفردية لتحليلها لاحقا. ساعد نهج الشبكة الجزيئية أيضا في توضيح العلاقات الهيكلية بين هذه المركبات ، مما ساهم في تحديد الجزيئات النشطة بيولوجيا المحتملة. حددت هذه الاستراتيجية المتكاملة بكفاءة مجموعة واسعة من المكونات الكيميائية الموجودة داخل المصنع. كشفت النتائج عن مجموعة متنوعة من المكونات الكيميائية داخل APB ، بما في ذلك قلويدات ، من بين أمور أخرى. لا يعزز هذا البحث فهم الملف الكيميائي النباتي لهذا الطب التبتي التقليدي فحسب ، بل يوفر أيضا رؤى قيمة حول خصائصه العلاجية المحتملة. يثبت تكامل 2D-HPLC-MS والشبكة الجزيئية أنه أداة قوية لاستكشاف وتحديد التركيبات الكيميائية المعقدة في الأدوية العشبية بشكل منهجي ، مما يمهد الطريق لمزيد من البحث والتطوير في مجال اكتشاف المنتجات الطبيعية.

Tibetan medicine is an integral part of traditional Chinese medicine, adhering to the principles of Tibetan medical practices, and is used for disease prevention and treatment1. However, Tibetan herbal medicine contains complex plant chemical constituents characterized by significant fluctuations in content. Limited understanding of the fundamental bioactive elements has become a bottleneck in the modernization of Tibetan medicine2. The application of liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), combining the strong separation power of chromatography with the high sensitivity of mass spectrometry (MS), has been widely used in natural medicine analysis3. However, due to the limitation of a single separation mechanism, components with highly similar structures tend to coelute in one-dimensional liquid chromatography separation. In subsequent mass spectrometric analysis, the low-abundance co-eluted components are difficult to detect due to ion suppression caused by high-abundance components4.
2D-HPLC, which stands for two-dimensional high-performance liquid chromatography, represents a novel chromatographic method that harmoniously combines different separation mechanisms using a pair of columns. This includes the fusion or alternation of normal-phase chromatography with reversed-phase liquid chromatography and hydrophilic interaction liquid chromatography with reversed-phase liquid chromatography5. By merging these complementary chromatographic properties, the enhanced separation capability is achieved, effectively addressing the challenges caused by complex sample matrices6. Furthermore, by coupling two-dimensional chromatography with MS, the powerful separation ability of 2D-HPLC and the high sensitivity detection capability of MS can be fully integrated, providing support for the study of complex drug systems and their fundamental constituents7,8,9.
Tibetan medicine commonly features a multifaceted array of components and functionalities, where active ingredients typically exist in intricate compositions and at minimal concentrations. By integrating 2D-LC as a robust separation system and MS as an exceedingly sensitive detector, the challenges posed by intricate samples in terms of separation and identification can be more effectively addressed10,11,12. This amalgamation substantially contributes to advancing the exploration of the chemical composition of Tibetan medicine.
Regardless of whether it is traditional LC-MS or 2D-LC-MS, a vast amount of information can be obtained. However, extracting structural information of complex system components from this massive amount of information has always been a significant challenge. Therefore, researchers have developed various methods for screening and mining MS data. Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS) is an MS/MS data organization and visualization platform where 2D-LC-MS mass spectrometry data can be uploaded13. Each spectrum is considered as a vector and compared to all other spectra using cosine similarity. When the similarity between two spectra exceeds a threshold, they are connected in a molecular network (MN). This can be used for the rapid identification of known compounds and the determination of various unknown natural products14.
Tibetan medicine usually has multiple functions, but its complex composition and significant concentration differences make it difficult to effectively elucidate the relationship between function and material basis15. An in-depth study of Tibetan medicine requires the systematic characterization of as many components as possible. In the framework of this study, we intend to use APB in Tibetan medicine as the research object to demonstrate the strategy and process of systematically studying the complex chemical components of Tibetan medicine using 2D-HPLC-MS technology and MN technology. In the construction of the 2D chromatographic system, we combined reversed-phase liquid chromatography and hydrophilic interaction liquid chromatography with significant separation mechanisms to achieve more effective separation of the complex components of APB16. In addition, to overcome solvent incompatibility between the two dimensions, an at-column dilution modulation mode was adopted. By combining the powerful separation capability of 2D-LC with the high sensitivity detection capability of MS, the spectral information of the complex components in APB is obtained more effectively and comprehensively. Furthermore, through the network and visualization of massive spectral information by MN technology, the components of APB are systematically analyzed. The strategy and process demonstrated in this study are expected to be applied to the study of other Tibetan medicines, promoting research on the material basis of Tibetan medicine, which is of great significance for advancing Tibetan medicine resources and improving quality control standards for Tibetan herbs17. The overall experimental process is shown in Figure 1.
In the experiment presented here, a new at-column dilution modulator was introduced into the Agilent two-dimensional liquid chromatography (2D-LC) system18. By adding an independent delivery pump, the flow path of the analysis was changed, resulting in a high orthogonality of the 2D-LC analysis. The coupling and switching between the two dimensions are accomplished by two six-port valves, as shown in Figure 2. When one sample loop is filled in the first dimension, another sample loop is analyzed in the second dimension. This means that the filling time of the 1D loop and the running time of the 2D are equal. This requires the fast gradient generated by the Binary pump in the second dimension. No peaks are lost when the entire effluent is analyzed. This is particularly helpful for the analysis of unknown samples. It results in a large number of 2D chromatograms that need to be combined for data analysis.

تسليط الضوء على المؤلف: دمج 2D-HPLC-MS والشبكات الجزيئية في تحليل الطب الطبيعي

تقنية 2D-HPLC-MS جنبا إلى جنب مع الشبكة الجزيئية لتحديد المكونات في بندول Aconitum الطب التبتي

In this study, we employed a comprehensive approach utilizing 2D-HPLC-MS technology in conjunction with molecular networking to unravel the intricate chemical composition of the Tibetan medicinal plant APB. We want to establish a more efficient method for identifying the chemical composition of natural medicines. The main challenging of the current experiments is that the mass spectrometry section is not equipped with high-resolution mass spectrometry, resulting in the detection of different components.2D-LC-MS enables more accurate identification and the quantification of the compounds. Complex mixtures based on sample separation, combined with molecular network technology, it can be better process complex data information and it improves the efficiency and the accuracy of any size. Our laboratory will focus applying existing technologies to get the separation of natural, medicinal, chemical components.

تم استخدام APB ككائن نموذجي للتحقق من جدوى تقنية 2D-HPLC-MS بالاقتران مع طريقة MN. من خلال استيراد بيانات MS الأولية إلى MN مع تعيين المعلمات إلى الافتراضي ، تم إنشاء MN. MN هي استراتيجية حسابية بصرية تصور جميع الأيونات الجزيئية المكتشفة في تجربة LC-MS-MS كاملة والعلاقات الكيميائية بين هذه الأيونات الجز?...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Integrating 2D-HPLC-MS and Molecular Networking in Natural Medicine Analysis at JoVE.com

تستخدم هذه الدراسة تقنية قياس الطيف الكتلي للكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء ثنائية الأبعاد (2D-HPLC-MS) جنبا إلى جنب مع الشبكات الجزيئية لكشف التركيب الكيميائي المعقد للنبات الطبي التبتي Aconitum pendulum Busch (APB). توفر المقالة بروتوكولا مفصلا للاستكشاف المنهجي وتحديد المكونات الكيميائية المعقدة للأدوية العشبية.

In this study, a comprehensive approach was employed, utilizing 2D-HPLC-MS technology in conjunction with the molecular network to unravel the intricate ...

في هذه الدراسة ، استخدمنا نهجا شاملا باستخدام تقنية 2D-HPLC-MS جنبا إلى جنب مع الشبكات الجزيئية لكشف التركيب الكيميائي المعقد للنباتات الطبية التبتية APB. نريد إنشاء طريقة أكثر كفاءة لتحديد التركيب الكيميائي للأدوية الطبيعية. يتمثل التحدي الرئيسي للتجارب الحالية في أن قسم قياس الطيف الكتلي غير مجهز بمطياف كتلي عالي الدقة ، مما يؤدي إلى اكتشاف مكونات مختلفة.يتيح 2D-LC-MS تحديد أكثر دقة وتحديد كمية المركبات. الخلائط المعقدة القائمة على فصل العينات ، جنبا إلى جنب مع تقنية الشبكة الجزيئية ، يمكن أن تكون أفضل معالجة لمعلومات البيانات المعقدة وتحسن كفاءة ودقة أي حجم. سيركز مختبرنا على تطبيق التقنيات الحالية لفصل المكونات الطبيعية والطبية والكيميائية.

2d-hplc-ms-technology-combined-with-molecular-network-for

Research

JoVE Journal

Medicine

2D-HPLC-MS Technology Combined with Molecular Network for the Identification of Components in Tibetan Medicine Aconitum pendulum

297 Views.  Chengdu University of Traditional Chinese Medicine. في هذه الدراسة ، استخدمنا نهجا شاملا باستخدام تقنية 2D-HPLC-MS جنبا إلى جنب مع الشبكات الجزيئية لكشف التركيب الكيميائي المعقد للنباتات الطبية التبتية APB. نريد إنشاء طريقة أكثر كفاءة لتحديد التركيب الكيميائي للأدوية الطبيعية. يتمثل التحدي الرئيسي للتجارب الحالية في أن قسم قياس...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: دمج 2D-HPLC-MS والشبكات الجزيئية في تحليل الطب الطبيعي

In this study, a comprehensive approach was employed, utilizing 2D-HPLC-MS technology in conjunction with the molecular network to unravel the intricate chemical composition of the Tibetan medicinal plant APB. Through the implementation of 2D-HPLC, enhanced separation of complex mixtures was achieved, enabling the isolation of individual compounds for subsequent analysis. The molecular network approach further aided in elucidating structural relationships among these compounds, contributing to the determination of potential bioactive molecules. This integrated strategy efficiently identified a wide array of chemical components present within the plant. The findings revealed a diverse spectrum of chemical constituents within APB, including alkaloids, among others. This research not only advances understanding of the phytochemical profile of this traditional Tibetan medicine but also provides valuable insights into its potential therapeutic properties. The integration of 2D-HPLC-MS and molecular network proves to be a powerful tool for systematically exploring and identifying complex chemical compositions in herbal medicines, paving the way for further research and development in the field of natural product discovery.

This study utilizes two-dimensional high-performance liquid chromatography-mass spectrometry (2D-HPLC-MS) technology in conjunction with molecular networking to unravel the intricate chemical composition of the Tibetan medicinal plant Aconitum pendulum Busch (APB). The article provides a detailed protocol for the systematic exploration and identification of complex chemical components of herbal medicines.

Sample Preparation for 2D-HPLC-MS of Aconitum pendulum

Begin sample preparation by weighing the aconitum pendulum bush, or APB. Using a one by 10, 000 sensitivity balance, weigh 0.25 grams of dry APB in a three milliliter micro centrifuge tube. Add 2.5 milliliters of methanol to it and then sonicate for 30 minutes at a power of 240 watts and a frequency of 40 kilohertz.Centrifuge the sonicated sample at 1.2G for five minutes, and collect the supernatant. Filter it through a 0.22 micron membrane filter. Next, prepare the two-dimensional mobile phase by using acetyl nitrile as the organic phase or phase B, and ultra pure water containing 0.1%formic acid as the aqueous phase or phase A.After performing two-phase filtration through the 0.22 micron filter, subject the mobile phases to ultrasonic sonication at 40 kilohertz for 15 minutes.Purge the replaced mobile phase to remove the bubbles. Select a C18 column as the 1D column and a hydrophilic column as the 2D column, and mount them to the instrument. To adjust the appropriate shunt ratio, connect the 2D-LC instrument outline through a T to the mass inlet and the other end of the T to a shunted line.Adjust the flow rate to a suitable value to ensure the appropriate flow rate for the mass spectrum.

تحضير العينة ل 2D-HPLC-MS من بندول الأكونيتوم

Implementing 2D-Liquid Chromatography on Aconitum pendulum Samples for Enhanced Compound Separation

To begin the 2D liquid chromatography, or 2DLC, double-click the instrument one online icon, and the chemical workstation will automatically communicate with the 1260LC and enter the workstation. For the 2DLC method parameter setting, click on the Injector module, right-click Method and set the injection volume, flow rate, and mobile phase time gradient of the 1D pump. Enter the sample runtime under Stop Time.Click on the main menu instrument and click 2DLC Method on the dropdown menu. Select Comprehensive in 2DLC mode. Enter two minutes at modulation time and 1.9 minutes at 2D gradient stop time.Set flow settings to two milliliters. Edit 2D gradient and set wavelengths. After editing the method, select Save Method As on the method menu to name the new method, and click OK.

تنفيذ كروماتوغرافيا 2D-Liquid على عينات بندول الأكونيتوم لتعزيز الفصل المركب

Mass Spectrometry Following the 2D-LC Operation on Aconitum pendulum Samples

To begin, turn on the switch of the vacuum pump. Open the argon cylinder main valve and the pressure divider valve, and adjust the pressure to about 0.3 megapascals. To set up the MS method, enter the runtime in minutes to 93.00 and enter values to configure acquisition time, polarity, mass range, transfer value number, transfer value duration, and more.Set up scan event details according to the values displayed on the screen. To set data dependent settings, use separate polarity settings as disabled. Set neutral loss within top to three, and product mass list within top to three.Save to configure the settings as the instrument method. Click the sequence setup button to open the sequence table. Enter the sample type, file name, path, sample id, instrument method, location, injection amount, and other information in the form.Save the information to record the sequence listing. Then click the start analysis button to set up and start MS acquisition.

قياس الطيف الكتلي بعد عملية 2D-LC على عينات بندول Aconitum

Integration of Molecular Network Operation to 2D-HPLC-MS for the Analysis of Aconitum pendulum Samples

To begin the data preparation, export 2D HPLC-MS raw mass spectral data. Next to connect to the GNPS FTP server in the WINSCP interface on the Session Configuration page, fill in the connection information. After filling in the information, click the Start button to establish a connection to the GNPS FTP server.Create molecular networks by opening a web browser and visiting the GNPS website. New users need to sign up for an account and then log in. On the main interface of the GNPS website, click Create Molecular Network under Data Analysis.On the Task Creation page, click the select Input Files button, then select and upload the data file. In the Workflow Option tabs, set the various parameters that generate the molecular network or MN.These parameters include the peak extraction algorithm, peak over travel value, similarity calculation method, and so on. After making the appropriate parameter settings as needed, click the Submit button at the bottom of the page to run the task.After the task runs, find the created tasks in the Jobs tab and click the workflow name to view the analysis results. The website provides MN diagrams, substitutes, symbiotic networks, and other related information. Four of the alkaloid components in the APB samples identified by the MN were aconitine, 14-benzoylaconine, 14-O-acetylneoline and hypaconitine.The four compounds had the same parent nucleus. Aconitine, 14-benzyl aconine, 14-benzoylaconine, and hypaconitine were similar, and only the substituents were different.