Ce travail a été financé par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82130113), la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82204765), la Fondation des sciences de la nature du Sichuan (2022NSFSC1470), le projet de financement spécial postdoctoral de la province du Sichuan (TB2023020) et le programme de promotion de la recherche Xinglin Scholars de l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Chengdu (BSH2021030). Ces fonds apportent un soutien en termes d’équipements expérimentaux, de matériaux expérimentaux et de frais de publication.

1. Préparation
<ol><li>Préparation des échantillons<ol><li>À l’aide d’une balance de sensibilité de 1/10 000, peser 0,25 g (poids sec) d’APB dans un tube de microcentrifugation de 3 mL, ajouter 2,5 mL de méthanol, puis sonicate pendant 30 min (puissance 240 W, fréquence 40 kHz).</li>
		<li>Effectuer une centrifugation à 1,2 x g pendant 5 min, recueillir le surnageant et filtrer à travers un filtre à membrane avec une taille de pores de 0,22 μm.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation du matériel expérimental<ol><li>Préparez la phase mobile bidimensionnelle, utilisez de l’acétonitrile comme phase B organique et configurez de l’eau ultrapure à 0,1 % d’acide formique comme phase A aqueuse.</li>
		<li>Effectuer une filtration diphasique (0,22 μm) et un sonicate à l’aide d’un appareil à ultrasons (40 kHz) pendant 15 min. Purgez la phase mobile remplacée pour éliminer les bulles. Dans cette expérience, la colonne C18 a été utilisée comme colonne 1D, la colonne hydrophile comme colonne 2D, et la colonne a été montée sur l’instrument.</li>
	</ol></li>
	<li>Réglage du rapport de dérivation approprié<ol><li>Connectez la ligne de sortie de l’instrument 2D-LC à travers un té à l’entrée de masse et l’autre extrémité du té à une ligne shuntée. Ajustez le débit à une valeur appropriée pour vous assurer que le débit dans le spectre massique est de 0,3 à 0,5 mL/min. REMARQUE : Étant donné que la deuxième dimension du 2D-LC est généralement réglée au-dessus de 2 mL/min, ce débit est trop important pour MS, il est donc nécessaire d’effectuer une division.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Fonctionnement 2D-LC
<ol><li>Double-cliquez sur l’icône Instrument 1 Online pour que le poste de travail chimique communique automatiquement avec le 1260 LC et entre dans le poste de travail.</li>
	<li>Pour le réglage des paramètres de méthode 2D-LC, sélectionnez l’écran Méthode et exécution du contrôle dans le menu Affichage pour appeler l’interface souhaitée, qui sera normalement saisie par défaut. Cliquez sur le module d’injecteur, cliquez avec le bouton droit de la souris sur Méthode, définissez le volume d’injection, le débit et le gradient de temps de phase mobile de la pompe 1D.</li>
	<li>Entrez l’exemple de temps d’exécution sous Temps d’arrêt. Cliquez sur le menu principal Instrument et cliquez sur Méthode 2D-LC dans le menu déroulant. Sélectionnez Complet en mode 2D-LC. Entrez 2 min au temps de modulation , 1,9 min au temps d’arrêt du dégradé 2D . Réglez les paramètres de débit sur 2 ml. Modifiez le dégradé 2D et définissez-le sur les longueurs d’onde. Après avoir modifié la méthode, sélectionnez Enregistrer la méthode sous dans le menu Méthode pour nommer la nouvelle méthode, puis cliquez sur OK. REMARQUE : La pompe de transfert externe nécessite un réglage manuel du débit.</li>
</ol>3. Fonctionnement MS
<ol><li>Allumez l’interrupteur de la pompe à vide. Ouvrez le robinet principal de la bouteille d’argon et le robinet diviseur de pression et ajustez la pression à environ 0,3 MPa. Ouvrez la vanne d’azote.</li>
	<li>Attendre au moins 8 h pour s’assurer que le vide est adéquat dans les conditions expérimentales. Vérifiez que la pression atmosphérique de l’argon et de l’azote est suffisamment élevée avant l’analyse.</li>
	<li>Pour lancer le logiciel de contrôle MS, cliquez sur la source SEI de chauffage dans le panneau du logiciel et entrez les paramètres MS, y compris la température du chauffage (350 °C), le débit de la gaine (35 arb), le débit d’air auxiliaire (15 arb), la tension de pulvérisation (3,8 KV en mode positif, -2,5 KV en mode négatif) et la température capillaire (275 °C). Cliquez sur le bouton Appliquer pour activer la source d’ions.</li>
	<li>Pour configurer la méthode MS, entrez des valeurs pour configurer le temps d’acquisition, la polarité, la plage de masse, le numéro de valeur de transfert, la durée de la valeur de transfert, etc. Temps d’exécution MS (min) : 93,00. Détails de la configuration de ScanEvent : ITMS + norme c o (100.0-1200.0), CV=0.0v. Norme ITMS + c Dep MS/MS, ion le plus intense de (1) : Type d’activation : CID, Min. Signal requis : 500, Largeur d’isolement : 2.00, Org. normalisée Energie : 35.0, État de charge par défaut :3, Activation Q : 0.250, Temps d’activation : 93.000. Pour définir des paramètres dépendants des données, utilisez des paramètres de polarité distincts comme désactivés, Perte neutre en haut : 3, Produit en haut : 3. Cliquez sur Enregistrer pour configurer les paramètres en tant que méthode d’instrument. REMARQUE : La fin de l’exécution est conforme à celle du 2D-LC.</li>
	<li>Cliquez sur le bouton Configuration de la séquence pour ouvrir la table de séquence. Entrez le type d’échantillon, le nom de fichier, le chemin d’accès, l’ID de l’échantillon, la méthode de l’instrument, l’emplacement, la quantité d’injection et d’autres informations dans le formulaire.</li>
	<li>Cliquez sur le bouton Enregistrer pour enregistrer le listage des séquences, puis cliquez sur le bouton Démarrer l’analyse pour configurer et démarrer l’acquisition MS. Cliquez sur Run Control sur l’instrument 2D-LC et sélectionnez Run Method. Dans le même temps, l’instrument MS clique également sur le bouton Exécuter . REMARQUE : Étant donné que le 2D-LC et le MS ne sont pas contrôlés par le même logiciel dans cette expérience, ils doivent être configurés séparément sur les deux instruments.</li>
</ol>4. Fonctionnement du réseau moléculaire
<ol><li>Préparation des données : Exportez des données spectrales de masse brutes 2D-HPLC-MS et convertissez les données spectrales de masse secondaires en données mzXML ou mzML via Msconvert de ProteoWizard. (http://proteowizard.sourceforge.net/).</li>
	<li>Pour télécharger des données, téléchargez le logiciel WinSCP sur le site officiel et téléchargez les données mzML sur le compte créé par GNPS via le protocole FTP. Une fois l’installation terminée, lancez WinSCP.</li>
	<li>Se connecter au serveur FTP GNPS : Dans l’interface WinSCP, sur la page de configuration de la session , renseignez les informations de connexion suivantes : Protocole de fichier : Sélectionnez FTP. Pour le nom d’hôte : Entrez massive.ucsd.edu., pour le numéro de port : Conservez le 22 par défaut.</li>
	<li>Entrez le numéro de compte et le mot de passe. Après avoir rempli les informations ci-dessus, cliquez sur le bouton Connexion pour établir une connexion au serveur FTP GNPS.</li>
	<li>Créez des réseaux moléculaires en ouvrant un navigateur Web et en visitant le site Web du GNPS (https://gnps.ucsd.edu/). Les nouveaux utilisateurs doivent créer un compte, puis se connecter.</li>
	<li>Sur l’interface principale du site Web GNPS, cliquez sur l’onglet Tâches dans la barre de navigation supérieure et sélectionnez Créer une nouvelle tâche dans le menu déroulant. Sur la page de création de tâche, cliquez sur le bouton Ajouter des fichiers, puis sélectionnez et téléchargez le fichier de données. (par exemple, format mzML).</li>
	<li>Dans l’onglet Paramètres de tâche, définissez les différents paramètres qui génèrent le MN. Ces paramètres incluent l’algorithme d’extraction de pic, la valeur de dépassement de pic, la méthode de calcul de similarité, etc. Effectuez les réglages de paramètres appropriés si nécessaire. Cliquez sur le bouton Lancer l’analyse en bas de la page pour exécuter la tâche.</li>
	<li>Une fois la tâche exécutée, recherchez la tâche créée dans la liste des tâches et cliquez sur le nom du service pour afficher les résultats de l’analyse. Le site Web fournit des diagrammes MN, des substituts, des réseaux symbiotiques et d’autres informations connexes.</li>
</ol>

Analyse de l’APB d’une plante médicinale tibétaine à l’aide de la 2D-HPLC-MS avec mise en réseau moléculaire

<ol>
	<li>Luo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+Tibetan+and+traditional+Chinese+medicine+body+constitutions:+A+cross-sectional+study+of+Tibetan+college+students+in+the+Tibet+Autonomous+Region.">Correlation between Tibetan and traditional Chinese medicine body constitutions: A cross-sectional study of Tibetan college students in the Tibet Autonomous Region.</a> J Tradl Chinese Med Sci. 5 (3), 215-221 (2018).</li><li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+identification+of+compound+structure+in+Tibetan+medicine+using+ion+trap+mass+spectrometry+and+multiple-stage+fragmentation+analysis.">Standardized identification of compound structure in Tibetan medicine using ion trap mass spectrometry and multiple-stage fragmentation analysis.</a> J Vis Exp. (193), 65054 (2023).</li><li>Kumar, P. R., Dinesh, S. R., Rini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LCMS-a+review+and+a+recent+update.">LCMS-a review and a recent update.</a> J Pharm Pharm Sci. 5, 377-391 (2016).</li><li>Yan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategy+for+the+identification+and+quantitative+analysis+of+the+phytochemicals+of+traditional+Chinese+medicine+by+LC-MS/MS.">Strategy for the identification and quantitative analysis of the phytochemicals of traditional Chinese medicine by LC-MS/MS.</a> Acta Pharm Sinica. 55 (7), 1494-1503 (2020).</li><li>Iguiniz, M., Heinisch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+liquid+chromatography+in+pharmaceutical+analysis.+Instrumental+aspects,+trends+and+applications.">Two-dimensional liquid chromatography in pharmaceutical analysis. Instrumental aspects, trends and applications.</a> J Pharma Biomed Anal. 145, 482-503 (2017).</li><li>Ye, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+progress+of+2D-LC+in+analysis+and+quality+control+of+traditional+Chinese+medicine.">Application progress of 2D-LC in analysis and quality control of traditional Chinese medicine.</a> Chem Reag. 44 (8), 1103-1110 (2022).</li><li>Cao, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+comprehensive+two-dimensional+hydrophilic+interaction+chromatography+x+reversed-phase+liquid+chromatography+coupled+with+hybrid+linear+ion+trap+Orbitrap+mass+spectrometry+for+the+analysis+of+phenolic+acids+in+Salvia+miltiorrhiza.">Online comprehensive two-dimensional hydrophilic interaction chromatography x reversed-phase liquid chromatography coupled with hybrid linear ion trap Orbitrap mass spectrometry for the analysis of phenolic acids in Salvia miltiorrhiza.</a> J Chromatogr A. 1536, 216-227 (2018).</li><li>Cao, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+and+quantitative+characterization+of+phenolic+and+diterpenoid+constituents+in+Danshen+(Salvia+miltiorrhiza)+by+comprehensive+two-dimensional+liquid+chromatography+coupled+with+hybrid+linear+ion+trap+Orbitrap+mass.">Qualitative and quantitative characterization of phenolic and diterpenoid constituents in Danshen (Salvia miltiorrhiza) by comprehensive two-dimensional liquid chromatography coupled with hybrid linear ion trap Orbitrap mass.</a> J Chromatogr. 1427, 79-89 (2016).</li><li>Wang, J., Ren, X., Wen, C., Xu, Y., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+characterization+of+unknown+impurities+in+rutin+tablets+using+trap-free+two-dimensional+liquid+chromatography+coupled+with+ion+trap/time-of-flight+mass+spectrometry.">Separation and characterization of unknown impurities in rutin tablets using trap-free two-dimensional liquid chromatography coupled with ion trap/time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 34 (10), e8739 (2020).</li><li>Ma, L. J., Ma, N., Cao, J. L., Wan, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+influence+of+different+drying+methods+on+chemical+components+of+Panax+notoginseng+leaves+by+heart-cutting+two-dimensional+liquid+chromatography+coupled+to+orbitrap+high-resolution+mass+spectrometry.">Characterizing the influence of different drying methods on chemical components of Panax notoginseng leaves by heart-cutting two-dimensional liquid chromatography coupled to orbitrap high-resolution mass spectrometry.</a> Food Chem. 369, 130965 (2022).</li><li>Wong, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untargeted+profiling+of+Glycyrrhiza+glabra+extract+with+comprehensive+two-dimensional+liquid+chromatography-mass+spectrometry+using+multi-segmented+shift+gradients+in+the+second+dimension:+Expanding+the+metabolic+coverage.">Untargeted profiling of Glycyrrhiza glabra extract with comprehensive two-dimensional liquid chromatography-mass spectrometry using multi-segmented shift gradients in the second dimension: Expanding the metabolic coverage.</a> Electrophoresis. 39 (15), 1993-2000 (2018).</li><li>Cao, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensively+qualitative+and+quantitative+analysis+of+ginsenosides+in+Panax+notoginseng+leaves+by+online+two-dimensional+liquid+chromatography+coupled+to+hybrid+linear+ion+trap+Orbitrap+mass+spectrometry+with+deeply+optimized+dilution+and+modulation+system.">Comprehensively qualitative and quantitative analysis of ginsenosides in Panax notoginseng leaves by online two-dimensional liquid chromatography coupled to hybrid linear ion trap Orbitrap mass spectrometry with deeply optimized dilution and modulation system.</a> Anal Chim Acta. 1079, 237-251 (2019).</li><li>Nothias, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feature-based+molecular+networking+in+the+GNPS+analysis+environment.">Feature-based molecular networking in the GNPS analysis environment.</a> Nat methods. 17 (9), 905-908 (2020).</li><li>Qin, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS/MS-based+molecular+networking:+an+efficient+approach+for+natural+products+Dereplication.">MS/MS-based molecular networking: an efficient approach for natural products Dereplication.</a> Molecules. 28 (1), 157 (2023).</li><li>Qu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+multidimensional+chromatography-mass+spectrometry+and+feature-based+molecular+networking+methods+for+the+systematic+characterization+of+compounds+in+the+supercritical+fluid+extract+of+Tripterygium+wilfordii+Hook+F.">Combining multidimensional chromatography-mass spectrometry and feature-based molecular networking methods for the systematic characterization of compounds in the supercritical fluid extract of Tripterygium wilfordii Hook F.</a> Analyst. 148 (1), 61-73 (2023).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enhanced+analytical+strategy+integrating+offline+two-dimensional+liquid+chromatography+with+high-resolution+accurate+mass+spectrometry+and+molecular+networking:+Comprehensive+characterization+of+HuangLian+JieDu+Decoction+as+a+case+study.">An enhanced analytical strategy integrating offline two-dimensional liquid chromatography with high-resolution accurate mass spectrometry and molecular networking: Comprehensive characterization of HuangLian JieDu Decoction as a case study.</a> J Sep Sci. 45 (14), 2734-2745 (2022).</li><li>Dai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+profiling+of+Sanguisorba+officinalis+using+offline+two-dimensional+mixed-mode+liquid+chromatography+&#215;+reversed-phase+liquid+chromatography,+tandem+high-resolution+mass+spectrometry,+and+molecular+network.">Comprehensive profiling of Sanguisorba officinalis using offline two-dimensional mixed-mode liquid chromatography &#215; reversed-phase liquid chromatography, tandem high-resolution mass spectrometry, and molecular network.</a> J Sep Sci. 45 (10), 1727-1736 (2022).</li><li>Chen, Y., Montero, L., Luo, J., Li, J., Schmitz, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+new+at-column+dilution+(ACD)+modulator+for+the+two-dimensional+RP&#215;+HILIC+analysis+of+Buddleja+davidii.">Application of the new at-column dilution (ACD) modulator for the two-dimensional RP&#215; HILIC analysis of Buddleja davidii.</a> Anal Bioanal Chem. 412 (7), 1483-1495 (2020).</li><li>Zhou, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+action+and+toxicity+of+Aconite+and+its+main+components.">Pharmacological action and toxicity of Aconite and its main components.</a> Acta Pharm Sinica. (05), 394-400 (1983).</li><li>Shao, X., Liu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+the+role+of+14-Benzoylaconine+in+rheumatoid+arthritis.">Progress in the role of 14-Benzoylaconine in rheumatoid arthritis.</a> Chinese J Pharmacol Toxicol. 33 (10), 917 (2019).</li><li>Hao, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Study on the chemical constituents of the alkaloids from the root of Aconitum flavum HandMazz and its anti-tumor activities. , (2015).</li><li>Han, X., Hou, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+progress+on+the+pharmacological+effects+and+toxicity+of+Aconitine.">Research progress on the pharmacological effects and toxicity of Aconitine.</a> J China Prescrip Drug. 12 (12), 149-150 (2014).</li></ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

L’objectif principal de cette expérience était l’optimisation d’une méthode partielle dans le cadre de la séparation bidimensionnelle en phase liquide. Pour y parvenir, un nouveau modulateur de dilution en colonne a été intégré de manière transparente dans le système de chromatographie liquide bidimensionnelle (2D-LC). Cet ajustement technique était d’une importance primordiale car il a considérablement amélioré la compétence dans le profilage des constituants chimiques présents dans la médecine ...

La médecine tibétaine fait partie intégrante de la médecine traditionnelle chinoise, adhérant aux principes des pratiques médicales tibétaines, et est utilisée pour la prévention et le traitement des maladies1. Cependant, la phytothérapie tibétaine contient des constituants chimiques végétaux complexes caractérisés par des fluctuations importantes de leur contenu. La compréhension limitée des éléments bioactifs fondamentaux est devenue un goulot d’étranglement dans la modernisation de la médecine tibétaine2. L’application de la chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS), combinant le fort pouvoir de séparation de la chromatographie avec la haute sensibilité de la spectrométrie de masse (MS), a été largement utilisée dans l’analyse de la médecine naturelle3. Cependant, en raison de la limitation d’un seul mécanisme de séparation, les composants ayant des structures très similaires ont tendance à coéluer dans la séparation unidimensionnelle par chromatographie liquide. Dans l’analyse spectrométrique de masse ultérieure, les composants co-élutés de faible abondance sont difficiles à détecter en raison de la suppression des ions causée par les composants de haute abondance4.
La 2D-HPLC, qui signifie chromatographie liquide bidimensionnelle à haute performance, représente une nouvelle méthode chromatographique qui combine harmonieusement différents mécanismes de séparation à l’aide d’une paire de colonnes. Cela comprend la fusion ou l’alternance de la chromatographie en phase normale avec la chromatographie liquide en phase inverse et de la chromatographie liquide à interaction hydrophile avec la chromatographie liquide en phase inverse5. En fusionnant ces propriétés chromatographiques complémentaires, la capacité de séparation améliorée est obtenue, ce qui permet de relever efficacement les défis posés par les matrices d’échantillons complexes6. De plus, en couplant la chromatographie bidimensionnelle avec la MS, la puissante capacité de séparation de la 2D-HPLC et la capacité de détection à haute sensibilité de la MS peuvent être entièrement intégrées, fournissant un soutien pour l’étude de systèmes médicamenteux complexes et de leurs constituants fondamentaux 7,8,9.
La médecine tibétaine présente généralement un éventail multiforme de composants et de fonctionnalités, où les ingrédients actifs existent généralement dans des compositions complexes et à des concentrations minimales. En intégrant la 2D-LC en tant que système de séparation robuste et la MS en tant que détecteur extrêmement sensible, les défis posés par les échantillons complexes en termes de séparation et d’identification peuvent être relevés plus efficacement 10,11,12. Cette fusion contribue considérablement à faire avancer l’exploration de la composition chimique de la médecine tibétaine.
Qu’il s’agisse d’un LC-MS traditionnel ou d’un LC-MS 2D, il est possible d’obtenir une grande quantité d’informations. Cependant, l’extraction d’informations structurelles de composants de systèmes complexes à partir de cette énorme quantité d’informations a toujours été un défi important. Par conséquent, les chercheurs ont mis au point diverses méthodes de criblage et d’exploration des données MS. Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS) est une plate-forme d’organisation et de visualisation de données MS/MS où les données de spectrométrie de masse 2D-LC-MS peuvent être téléchargées13. Chaque spectre est considéré comme un vecteur et comparé à tous les autres spectres en utilisant la similarité cosinus. Lorsque la similitude entre deux spectres dépasse un seuil, ils sont connectés dans un réseau moléculaire (MN). Cela peut être utilisé pour l’identification rapide de composés connus et la détermination de divers produits naturels inconnus14.
La médecine tibétaine a généralement plusieurs fonctions, mais sa composition complexe et ses différences de concentration significatives rendent difficile l’élucidation efficace de la relation entre la fonction et la base matérielle15. Une étude approfondie de la médecine tibétaine nécessite la caractérisation systématique d’un maximum de composants. Dans le cadre de cette étude, nous avons l’intention d’utiliser l’APB en médecine tibétaine comme objet de recherche pour démontrer la stratégie et le processus d’étude systématique des composants chimiques complexes de la médecine tibétaine à l’aide de la technologie 2D-HPLC-MS et de la technologie MN. Dans la construction du système chromatographique 2D, nous avons combiné la chromatographie liquide en phase inverse et la chromatographie liquide à interaction hydrophile avec des mécanismes de séparation significatifs pour obtenir une séparation plus efficace des composants complexes de l’APB16. De plus, pour pallier l’incompatibilité des solvants entre les deux dimensions, un mode de modulation de dilution en colonne a été adopté. En combinant la puissante capacité de séparation de la 2D-LC avec la capacité de détection à haute sensibilité de la MS, les informations spectrales des composants complexes de l’APB sont obtenues de manière plus efficace et plus complète. De plus, grâce au réseau et à la visualisation d’informations spectrales massives par la technologie MN, les composants de l’APB sont systématiquement analysés. La stratégie et le processus démontrés dans cette étude devraient être appliqués à l’étude d’autres médecines tibétaines, en promouvant la recherche sur la base matérielle de la médecine tibétaine, qui est d’une grande importance pour l’avancement des ressources de la médecine tibétaine et l’amélioration des normes de contrôle de la qualité des herbes tibétaines17. L’ensemble du processus expérimental est illustré à la figure 1.
Dans l’expérience présentée ici, un nouveau modulateur de dilution en colonne a été introduit dans le système de chromatographie liquide bidimensionnelle Agilent (2D-LC)18. L’ajout d’une pompe de refoulement indépendante a permis de modifier le chemin d’écoulement de l’analyse, ce qui a entraîné une orthogonalité élevée de l’analyse 2D-LC. L’accouplement et la commutation entre les deux dimensions sont réalisés par deux vannes à six orifices, comme le montre la figure 2. Lorsqu’une boucle d’échantillonnage est remplie dans la première dimension, une autre boucle d’échantillonnage est analysée dans la deuxième dimension. Cela signifie que le temps de remplissage de la boucle 1D et le temps de déroulement de la boucle 2D sont égaux. Cela nécessite le gradient rapide généré par la pompe binaire dans la deuxième dimension. Aucun pic n’est perdu lors de l’analyse de l’ensemble de l’effluent. Ceci est particulièrement utile pour l’analyse d’échantillons inconnus. Il en résulte un grand nombre de chromatogrammes 2D qui doivent être combinés pour l’analyse des données.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher chemical</td>
			<td>F22M81203</td>
			<td>Mobile phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aconitum pendulum</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Herb medicine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1290 Infinity (II) 2D-LC&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2198-90001</td>
			<td>Liquid chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable syringes</td>
			<td>Chengdu Keen experimental equipment</td>
			<td>/</td>
			<td>1ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EP tube</td>
			<td>Chengdu Keen experimental equipment</td>
			<td>/</td>
			<td>3ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid phase injection bottle</td>
			<td>Chengdu Keen experimental equipment</td>
			<td>/</td>
			<td>1.5ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ XL Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>LTQ21991</td>
			<td>Mass Spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microporous membranes&#160;</td>
			<td>Chengdu Keen experimental equipment</td>
			<td>/</td>
			<td>0.22&#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate XB-C18,5 &#956;m,2.1 x 200 mm</td>
			<td>Welch</td>
			<td>00201-31015</td>
			<td>Reversed-phase column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>GT Sonic</td>
			<td>UGT20DEC048Y</td>
			<td>Ultrasonic Cleaner 240W 40KHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XAmide,3 &#956;m,100A</td>
			<td>Dalian Mondi Technology</td>
			<td>D2019110601</td>
			<td>Hydrophilic column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

2d-hplc-ms technology combined with molecular network for the identification of components in tibetan medicine aconitum pendulum

Dans cette étude, une approche globale a été utilisée, utilisant la technologie 2D-HPLC-MS en conjonction avec le réseau moléculaire pour démêler la composition chimique complexe de la plante médicinale tibétaine APB. Grâce à la mise en œuvre de la 2D-HPLC, une séparation améliorée des mélanges complexes a été obtenue, permettant d’isoler des composés individuels pour une analyse ultérieure. L’approche du réseau moléculaire a également permis d’élucider les relations structurelles entre ces composés, contribuant ainsi à la détermination de molécules bioactives potentielles. Cette stratégie intégrée a permis d’identifier efficacement un large éventail de composants chimiques présents dans l’usine. Les résultats ont révélé un large éventail de constituants chimiques dans l’APB, y compris les alcaloïdes, entre autres. Cette recherche fait non seulement progresser la compréhension du profil phytochimique de cette médecine traditionnelle tibétaine, mais fournit également des informations précieuses sur ses propriétés thérapeutiques potentielles. L’intégration de la 2D-HPLC-MS et du réseau moléculaire s’avère être un outil puissant pour l’exploration et l’identification systématiques de compositions chimiques complexes dans les plantes médicinales, ouvrant la voie à de nouvelles recherches et développements dans le domaine de la découverte de produits naturels.

Tibetan medicine is an integral part of traditional Chinese medicine, adhering to the principles of Tibetan medical practices, and is used for disease prevention and treatment1. However, Tibetan herbal medicine contains complex plant chemical constituents characterized by significant fluctuations in content. Limited understanding of the fundamental bioactive elements has become a bottleneck in the modernization of Tibetan medicine2. The application of liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), combining the strong separation power of chromatography with the high sensitivity of mass spectrometry (MS), has been widely used in natural medicine analysis3. However, due to the limitation of a single separation mechanism, components with highly similar structures tend to coelute in one-dimensional liquid chromatography separation. In subsequent mass spectrometric analysis, the low-abundance co-eluted components are difficult to detect due to ion suppression caused by high-abundance components4.
2D-HPLC, which stands for two-dimensional high-performance liquid chromatography, represents a novel chromatographic method that harmoniously combines different separation mechanisms using a pair of columns. This includes the fusion or alternation of normal-phase chromatography with reversed-phase liquid chromatography and hydrophilic interaction liquid chromatography with reversed-phase liquid chromatography5. By merging these complementary chromatographic properties, the enhanced separation capability is achieved, effectively addressing the challenges caused by complex sample matrices6. Furthermore, by coupling two-dimensional chromatography with MS, the powerful separation ability of 2D-HPLC and the high sensitivity detection capability of MS can be fully integrated, providing support for the study of complex drug systems and their fundamental constituents7,8,9.
Tibetan medicine commonly features a multifaceted array of components and functionalities, where active ingredients typically exist in intricate compositions and at minimal concentrations. By integrating 2D-LC as a robust separation system and MS as an exceedingly sensitive detector, the challenges posed by intricate samples in terms of separation and identification can be more effectively addressed10,11,12. This amalgamation substantially contributes to advancing the exploration of the chemical composition of Tibetan medicine.
Regardless of whether it is traditional LC-MS or 2D-LC-MS, a vast amount of information can be obtained. However, extracting structural information of complex system components from this massive amount of information has always been a significant challenge. Therefore, researchers have developed various methods for screening and mining MS data. Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS) is an MS/MS data organization and visualization platform where 2D-LC-MS mass spectrometry data can be uploaded13. Each spectrum is considered as a vector and compared to all other spectra using cosine similarity. When the similarity between two spectra exceeds a threshold, they are connected in a molecular network (MN). This can be used for the rapid identification of known compounds and the determination of various unknown natural products14.
Tibetan medicine usually has multiple functions, but its complex composition and significant concentration differences make it difficult to effectively elucidate the relationship between function and material basis15. An in-depth study of Tibetan medicine requires the systematic characterization of as many components as possible. In the framework of this study, we intend to use APB in Tibetan medicine as the research object to demonstrate the strategy and process of systematically studying the complex chemical components of Tibetan medicine using 2D-HPLC-MS technology and MN technology. In the construction of the 2D chromatographic system, we combined reversed-phase liquid chromatography and hydrophilic interaction liquid chromatography with significant separation mechanisms to achieve more effective separation of the complex components of APB16. In addition, to overcome solvent incompatibility between the two dimensions, an at-column dilution modulation mode was adopted. By combining the powerful separation capability of 2D-LC with the high sensitivity detection capability of MS, the spectral information of the complex components in APB is obtained more effectively and comprehensively. Furthermore, through the network and visualization of massive spectral information by MN technology, the components of APB are systematically analyzed. The strategy and process demonstrated in this study are expected to be applied to the study of other Tibetan medicines, promoting research on the material basis of Tibetan medicine, which is of great significance for advancing Tibetan medicine resources and improving quality control standards for Tibetan herbs17. The overall experimental process is shown in Figure 1.
In the experiment presented here, a new at-column dilution modulator was introduced into the Agilent two-dimensional liquid chromatography (2D-LC) system18. By adding an independent delivery pump, the flow path of the analysis was changed, resulting in a high orthogonality of the 2D-LC analysis. The coupling and switching between the two dimensions are accomplished by two six-port valves, as shown in Figure 2. When one sample loop is filled in the first dimension, another sample loop is analyzed in the second dimension. This means that the filling time of the 1D loop and the running time of the 2D are equal. This requires the fast gradient generated by the Binary pump in the second dimension. No peaks are lost when the entire effluent is analyzed. This is particularly helpful for the analysis of unknown samples. It results in a large number of 2D chromatograms that need to be combined for data analysis.

Pleins feux sur l’auteur : Intégration de la 2D-HPLC-MS et des réseaux moléculaires dans l’analyse de la médecine naturelle

La technologie 2D-HPLC-MS combinée à un réseau moléculaire pour l’identification de composants dans le pendule de l’aconit de la médecine tibétaine

L’APB a été utilisé comme organisme modèle pour valider la faisabilité de la technologie 2D-HPLC-MS en conjonction avec la méthode MN. En important les données brutes MS dans le MN avec les paramètres définis par défaut, un MN a été généré. MN est une stratégie de calcul visuel qui visualise tous les ions moléculaires détectés dans une expérience LC-MS-MS complète et les relations chimiques entre ces ions moléculaires13.
MN est basé sur les frag...

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Cette étude utilise la technologie bidimensionnelle de chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de masse (2D-HPLC-MS) en conjonction avec un réseau moléculaire pour démêler la composition chimique complexe de la plante médicinale tibétaine Aconitum pendulum Busch (APB). L’article fournit un protocole détaillé pour l’exploration et l’identification systématiques de composants chimiques complexes des plantes médicinales.

In this study, a comprehensive approach was employed, utilizing 2D-HPLC-MS technology in conjunction with the molecular network to unravel the intricate ...

Dans cette étude, nous avons utilisé une approche globale utilisant la technologie 2D-HPLC-MS en conjonction avec un réseau moléculaire pour démêler la composition chimique complexe de la plante médicinale tibétaine APB. Nous voulons établir une méthode plus efficace pour identifier la composition chimique des médicaments naturels. Le principal défi des expériences actuelles est que la section de spectrométrie de masse n’est pas équipée de spectrométrie de masse à haute résolution, ce qui permet de détecter différents composants.La 2D-LC-MS permet une identification et une quantification plus précises des composés. Les mélanges complexes basés sur la séparation d’échantillons, combinés à la technologie des réseaux moléculaires, peuvent être mieux traiter des informations de données complexes et améliorer l’efficacité et la précision de toute taille. Notre laboratoire se concentrera sur l’application des technologies existantes pour obtenir la séparation des composants naturels, médicinaux et chimiques.

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2D-HPLC-MS Technology Combined with Molecular Network for the Identification of Components in Tibetan Medicine Aconitum pendulum

308 vues.  Chengdu University of Traditional Chinese Medicine. Dans cette étude, nous avons utilisé une approche globale utilisant la technologie 2D-HPLC-MS en conjonction avec un réseau moléculaire pour démêler la composition chimique complexe de la plante médicinale tibétaine APB. Nous voulons établir une méthode plus efficace pour identifier la composition chimique des médicaments naturels. Le principal défi des expériences actuelles est que la section de spectrométrie de masse n’est pas équipée de spectrométrie de masse à haute r?...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Intégration de la 2D-HPLC-MS et des réseaux moléculaires dans l’analyse de la médecine naturelle

In this study, a comprehensive approach was employed, utilizing 2D-HPLC-MS technology in conjunction with the molecular network to unravel the intricate chemical composition of the Tibetan medicinal plant APB. Through the implementation of 2D-HPLC, enhanced separation of complex mixtures was achieved, enabling the isolation of individual compounds for subsequent analysis. The molecular network approach further aided in elucidating structural relationships among these compounds, contributing to the determination of potential bioactive molecules. This integrated strategy efficiently identified a wide array of chemical components present within the plant. The findings revealed a diverse spectrum of chemical constituents within APB, including alkaloids, among others. This research not only advances understanding of the phytochemical profile of this traditional Tibetan medicine but also provides valuable insights into its potential therapeutic properties. The integration of 2D-HPLC-MS and molecular network proves to be a powerful tool for systematically exploring and identifying complex chemical compositions in herbal medicines, paving the way for further research and development in the field of natural product discovery.

This study utilizes two-dimensional high-performance liquid chromatography-mass spectrometry (2D-HPLC-MS) technology in conjunction with molecular networking to unravel the intricate chemical composition of the Tibetan medicinal plant Aconitum pendulum Busch (APB). The article provides a detailed protocol for the systematic exploration and identification of complex chemical components of herbal medicines.