قام Y. Tanaka بإجراء التحسين التقني ل Y2H. يتم دعم هذا العمل من قبل JSPS KAKENHI Grant Number JP22K06336 ومعهد التخمير ، أوساكا.

1. بناء مكتبة المسخ
<ol><li>قم بإعداد تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) (يظهر مثال أدناه). بشكل عام ، قم بإعداد 50 ميكرولتر من التفاعل ، والذي ينقسم إلى عشرة حصص من 5 ميكرولتر ، وتضخيم جزء الجين المستهدف في جهاز PCR4. ملاحظة: يجب على المستخدمين اختيار بوليميراز مناسب لإدخال الطفرات بكفاءة. إذا كان جزء الحمض النووي المراد تضخيمه قصيرا ، فستكون هناك حاجة إلى بوليميراز بمعدل خطأ أعلى ، مثل Taq polymerase ، الذي يفتقر إلى نشاط التدقيق اللغوي. إذا كان جزء الحمض النووي المراد تضخيمه طويلا ، فستكون هناك حاجة إلى بوليميراز أعلى دقة لتقليل عدد الطفرات. تحدث الطفرات كل بضع مئات من أزواج القواعد بعد 30 دورة من التضخيم باستخدام Taq polymerase4 العادي. في النتائج التمثيلية ، تم استخدام بوليميراز Taq مختلف (انظر جدول المواد) ، والذي يتمتع بدقة أعلى من Taq polymerase العادي ، وكان معدل الطفرة واحدا في 600 زوج من القواعد. يتم توفير مثال على مخاليط تفاعل البوليميراز المتسلسل وتفاصيل التمهيدي وظروف التفاعل في الملف التكميلي 1.</li>
	<li>عند اكتمال تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بدمج جميع حصص التفاعل ، وتأكد من تضخيم شظايا الحمض النووي ذات الأهمية باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز ، وما إلى ذلك ، وتنقية الحمض النووي5.</li>
	<li>قم بتجميع جزء الحمض النووي الذي تم إنشاؤه في الخطوة 1.2 باستخدام متجه Y2H المناسب باستخدام استراتيجية استنساخ "سلسة" (الشكل 1). ملاحظة: يقلل نظام الاستنساخ السلس ، مثل Gibson Assembly6 ، من تلوث مكتبة الطافرة المبنية بواسطة ناقلات فارغة ناتجة عن الربط الذاتي. وترد في الجدول 1 قائمة بمتجهات Y2H. يمكن تحضيرها عن طريق هضم BamHI قبل التجميع. جميع البلازميدات متوفرة من المشروع الوطني للموارد الحيوية - الخميرة (انظر جدول المواد).</li>
	<li>أدخل خليط التفاعل المتولد في الخطوة 1.3 في الخلايا المختصة بالإشريكية القولونية المحضرة وفقا لبروتوكول تحويل الإشريكية القولونية عالي الكفاءة (على سبيل المثال ، Inoue et al.7). انشر جميع الخلايا المختصة على عدة ألواح LB (1٪ تريبتون ، 0.5٪ مستخلص خميرة ، 1٪ كلوريد الصوديوم ، و 2٪ أجار) تحتوي على مضادات حيوية مناسبة (انظر جدول المواد). في هذه المرحلة ، انشر كمية صغيرة (~ 1/100 من إجمالي التفاعل) على نفس لوحة الاختيار لحساب عيار المكتبة. احتضان الأطباق على حرارة 37 درجة مئوية طوال الليل.</li>
	<li>بمجرد ظهور عدد كبير من مستعمرات الإشريكية القولونية ، كشط جميع الخلايا من سطح اللوحة باستخدام حلقة بلاستيكية يمكن التخلص منها. استعادة الحمض النووي البلازميد من هذه الخلايا باستخدام الطرق الشائعة ، مثل التحلل القلوي8. في الوقت نفسه ، احسب عدد المستعمرات التي تظهر بعد نشر حصص صغيرة من خليط التحول على اللوحة. باستخدام هذا الرقم ، قم بتقدير العدد الإجمالي للنسخ المستقلة في المكتبة. ملاحظة: في هذه المرحلة ، التقط بعض المستعمرات المستقلة (4-6) التي تظهر على اللوحة التي انتشرت عليها الحصص الصغيرة لتفاعل التحول ، وقم بزراعتها بشكل منفصل ، وعزل البلازميدات عنها للتأكد من أن جميع المستنسخة تقريبا تحمل شظايا الحمض النووي المطلوبة5. تتوفر العديد من المجموعات التجارية لعزل البلازميدات من الإشريكية القولونية. يمكن حساب عدد المستعمرات التي تظهر على اللوحة بعد نشر القسمات الصغيرة يدويا.</li>
	<li>قياس تركيز تجمع الحمض النووي للمكتبة. عادة ما تكون بضع مئات من النانوجرامات من الحمض النووي للمكتبة كافية للحصول على عدة آلاف من المحولات في الخطوة التالية. ملاحظة: يوصى بقياس تركيز الحمض النووي باستخدام صبغة فلورية ترتبط بالحمض النووي لأن قياس A260 غالبا ما يكون غير دقيق.</li>
</ol>2. تحويل الخميرة مع مكتبة متحولة وطلاء طبق الأصل
<ol><li>أدخل المكتبة الطافرة في سلالة الخميرة المضيفة (TAT-7 (L40-ura3) 9,10 MATa ، leu2-3,112 ، trp1-901 ، his3-Δ200 ، ade2-101 ، gal80Δ ، LYS2: (lexAop) 4-HIS3 ، ura3: (lexAop) 8-lacZ) لمقايسة Y2H باستخدام حوالي 100 نانوغرام من الحمض النووي. قم بتحويل الخلايا المضيفة مسبقا باستخدام بلازميد "الطعم".<ol><li>بعد إجراء التحويل ، قم بتعليق خلايا الخميرة في ماء معقم ونشر حصص بكميات مختلفة على الألواح المناسبة (عادة ما يكون وسط SC يفتقر إلى الليوسين والتريبتوفان: SC-LW [0.67٪ قاعدة نيتروجين الخميرة ، 2٪ جلوكوز ، 1.546 جم / لتر SC مزيج مزدوج التسرب -Leu -Trp ، و 2٪ أجار ، انظر جدول المواد]). احتضان هذه الأطباق طوال الليل على حرارة 30 درجة مئوية. ملاحظة: البروتوكول القياسي ، مثل طريقة أسيتات الليثيوم - PEG11 مع ~ 5 × 106 خلايا تنمو لوغاريتميا ، كافية لتحويل الخميرة. يمكن أيضا استخدام طريقة أخرى ذات كفاءة تحويل عالية ، مثل التثقيب الكهربائي.</li>
	</ol></li>
	<li>في اليوم التالي ، عندما تظهر مستعمرات صغيرة ، حدد اللوحات التي تحتوي على عدد مناسب من الخلايا (500-2000) وقم بعمل نسخ متماثلة منها على النحو التالي.</li>
	<li>ضع ورقتين من ورق الترشيح على كتلة طبق الأصل لعمل عدة نسخ متماثلة (الوسيط هو SC-LW و SC-LW المحتويان على كاناميسين) (انظر جدول المواد). احتضان في 30 درجة مئوية لمدة 1-2 أيام. ملاحظة: تركيز الكانامايسين (G418) هو 600 ميكروغرام / مل. لا تستخدم المخمل لطلاء النسخ المتماثلة لأن دقة المستعمرات ستفقد.</li>
	<li>بمجرد نمو المستعمرات ، قارن بين الأطباق واختر المرشحين. قم بإجراء اختبار ألوان Y2H (انظر الخطوة 3) إذا تم استخدام lacZ كمراسل. ملاحظة: بالنسبة لمراسل Y2H ، عادة ما يكون lacZ أفضل في اكتشاف تفاعل ضعيف من HIS3.</li>
</ol>3. مقايسة اللون Y2H
<ol><li>ضع ورقة من ورق الترشيح مقطوعة مسبقا إلى الحجم المناسب على اللوحة المتماثلة المعدة باستخدام الخطوة 2. احرص على عدم السماح بتكوين فقاعات هواء بين ورق الترشيح واللوحة. ملاحظة: استخدم ورق الترشيح رقم 4A أو ورق الترشيح من الدرجة 50 (انظر جدول المواد). يمكن استخدام أي SC-LW أو SC-LW تحتوي على ألواح كاناميسين ، والتي يتم تصنيعها عن طريق الطلاء المتماثل ، لفحص اللون.</li>
	<li>عندما يتم ترطيب ورق الترشيح الموجود على اللوحة تماما (عندما يتغير لون ورق الترشيح تماما) ، ضع عدة أوراق من المنشفة الورقية في الأعلى واجعلها تتلامس مع ورق الترشيح لإزالة الرطوبة الزائدة. قم بإزالة المنشفة الورقية عندما تمتص الماء ويتغير لونها. كرر هذه العملية مرتين أو ثلاث مرات.</li>
	<li>التقط حواف ورق الترشيح بملاقط ، وقشره من اللوحة بسرعة ، واغمره في النيتروجين السائل ، وقم بتجميده. في حالة عدم توفر النيتروجين السائل ، ضع ورق الترشيح على صينية بلاستيكية بحيث يكون جانب المستعمرة لأعلى وضعه على الفور في الفريزر (-20 درجة مئوية إلى -80 درجة مئوية) ليتجمد تماما.</li>
	<li>قم بإزالة ورق الترشيح المجمد وضعه ، بحيث يكون جانب المستعمرة لأعلى ، على منشفة ورقية جافة لإذابة. بعد الذوبان مباشرة ، ضع ورق الترشيح ، بحيث يكون جانب المستعمرة لأعلى ، على ورق ترشيح آخر تم وضعه على صينية بلاستيكية أو حاوية قابلة للغلق ومنقوع بمخزن Z (60 mMNa 2HPO4 ، 40 mM NaH2PO4 ، 10 mM KCl ، و 1 mM MgSO4 ، pH 7.0) يحتوي على X-gal (5-برومو-5-كلورو-3-إندوليل-β-D-galactoside) و 2-ميركابتوإيثانول9 (انظر جدول المواد). احرص على عدم السماح بتكوين فقاعات هواء بين أوراق الترشيح العلوية والسفلية.</li>
	<li>قم بتغطية الدرج البلاستيكي الذي يحتوي على ورق الترشيح وضعه في حاوية محكمة الإغلاق أو كيس بلاستيكي. أغلق الحاوية محكمة الإغلاق أو الكيس البلاستيكي واحتضنها عند 37 درجة مئوية حتى يظهر اللون الأزرق.</li>
	<li>عندما يظهر لون أزرق ، ضع ورق الترشيح مع وضع جانب المستعمرة لأعلى على حوالي 500 ميكرولتر من محلول التوقف (1 M Na2CO3) موضوعا على صينية بلاستيكية نظيفة. توقف عن نقع المحلول بسرعة ؛ لذلك ، قم بإزالة الفلتر على الفور ، وضعه على منشفة ورقية جديدة بحيث يكون جانب المستعمرة لأعلى ، واتركه حتى يجف.</li>
	<li>بعد استبدال المنشفة الورقية وجفاف الفلتر بدرجة كافية، استخدم ماسحا ضوئيا أو جهازا آخر لالتقاط البيانات.</li>
</ol>4. استعادة وتأكيد المستنسخة المرشحة
<ol><li>حدد النسخ المستنسخة البيضاء و KanR المرشحة من اللوحة الأصلية للنسخة المتماثلة (أو اللوحة المنسوخة غير المستخدمة لمقايسة اللون). الأمثلة موضحة في الشكل 1C. تأكد من أن المستنسخة المرشحة بيضاء و KanR عن طريق إعادة تخطيطها كرقعة صغيرة على وسط SC-LW يحتوي على كاناميسين واحتضانها عند 30 درجة مئوية لمدة 1-2 أيام. اصنع مجموعتين على الأقل أو قم بعمل نسخ متماثلة في اليوم التالي. ملاحظة: يجب اختيار المستعمرات البيضاء لأن المستعمرات الزرقاء الباهتة قد تحتفظ بالتفاعل.</li>
	<li>بمجرد إعادة نمو المستنسخة المرشحة جيدا ، كرر مقايسة اللون مع إنشاء لوحة واحدة على الأقل في الخطوة 4.1 كما هو موضح في الخطوة 3 وتأكد من أنها تظل بيضاء ولا تتحول إلى اللون الأزرق (الشكل 2 أ). ملاحظة: عند إعادة خطوط المرشحين ، لا تحمل كميات كبيرة من الخلايا. الكثير من الخلايا تجعل من المستحيل التمييز بين استنساخ KanR و KanS .</li>
	<li>خذ المستنسخة التي لا تزال بيضاء و KanR المتولدة في الخطوة 4.2 من بقايا اللوحة وقم بزراعتها بشكل مستقل في 1 مل من وسط الاختيار (SC-L أو SC-W ، اعتمادا على المتجه المستخدم في بناء المكتبة) طوال الليل عند 30 درجة مئوية.</li>
	<li>نقل الثقافة إلى microtube وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي (~ 15000 × غرام ، لمدة 10-30 ثانية في درجة حرارة الغرفة). عزل الحمض النووي كله من بيليه الخلية على النحو التالي.</li>
	<li>قم بتعليق حبيبات الخلية في 400 ميكرولتر من محلول التحلل (2٪ Triton X-100 ، 1٪ SDS ، 100 mM NaCl ، 10 mM Tris-Cl (8.0) ، و 1 mM EDTA) تحتوي على 1 ميكرولتر لكل من 2-mercaptoethanol و 20 mg / mL Zymolyase 100T (انظر جدول المواد) ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لهضم جدران الخلايا. في هذا الوقت ، تخلط برفق عن طريق قلب الأنبوب كل 5-10 دقائق.</li>
	<li>عندما يصبح تعليق الخلية معتما أو شفافا ، أضف حجما متساويا من خليط من كحول الفينول والكلوروفورم والأيزوميل (25:24:1) واخلطه جيدا عن طريق الدوامة بسرعة معتدلة لمدة 10-20 ثانية.</li>
	<li>أجهزة الطرد المركزي الأنابيب الدقيقة في جهاز طرد مركزي دقيق لمدة 5 دقائق بأقصى سرعة (~ 15000 × جم ، في درجة حرارة الغرفة) واستعادة المرحلة المائية التي تحتوي على الحمض النووي في أنبوب دقيق جديد. أضف 0.8 حجم الأيزوبروبانول واخلطه جيدا عن طريق قلب الأنبوب.</li>
	<li>اترك الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-3 دقائق ثم استخدم جهاز طرد مركزي في جهاز طرد مركزي دقيق لمدة 4-5 دقائق بأقصى سرعة (~ 15000 × جم ، في درجة حرارة الغرفة) لترسيب الحمض النووي.</li>
	<li>قم بإزالة المادة الطافية واغسل الراسب بحوالي 500 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 70٪. إزالة الإيثانول تماما وتجفيف راسب لفترة وجيزة.</li>
	<li>أضف 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE (10 mM Tris-Cl (8.0) و 1 mM EDTA) إلى الراسب ، واخلطه لفترة وجيزة ، واترك الأنبوب طوال الليل في درجة حرارة الغرفة لإذابة الراسب. ملاحظة: إذا كان المستخدمون في عجلة من أمرهم ، فاحتفظ بالأنابيب عند 37-50 درجة مئوية. يذوب راسب الحمض النووي (DNA) في غضون ساعات قليلة.</li>
	<li>بمجرد إذابة الحبيبات تماما ، قم بتحويل الإشريكية القولونية بكمية صغيرة من محلول الحمض النووي هذا. ملاحظة: حوالي 0.5 ميكرولتر من محلول الحمض النووي كافية إذا تم استخدام الإشريكية القولونية ذات كفاءة التحويل العالية.</li>
	<li>عندما تظهر مستعمرات الإشريكية القولونية ، اختر العديد من المستعمرات المستقلة ، واستزرعها ، واستعد البلازميدات بالطرق القياسية ، مثل التحلل القلوي.</li>
	<li>أدخل الحمض النووي البلازميد الذي تم الحصول عليه في الخطوة 4.12 في الخلايا المضيفة Y2H التي تؤوي بلازميد الطعم. عندما تظهر المحولات ، تحقق منها من خلال فحص اللون (يجب أن تظهر بيضاء) والنشاف الغربي4 (يجب أن تعبر عن بروتين بالحجم المطلوب). ملاحظة: طريقة ما بعد القلوية12 هي طريقة سهلة وسريعة لتحضير مستخلص خلية كاملة من الخميرة.</li>
	<li>إذا تم استيفاء المعيارين المذكورين أعلاه ، فحدد موقع طفرة المستنسخة عن طريق تسلسل النوكليوتيدات4.</li>
</ol>

دراسات التفاعل الجزيئي الحيوي باستخدام تقنية الخميرة ثنائية الهجين 

<ol>
	<li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions.">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).</li><li>Leanna, C. A., Hannink, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reverse+two-hybrid+system:+A+genetic+scheme+for+selection+against+specific+protein/protein+interactions.">The reverse two-hybrid system: A genetic scheme for selection against specific protein/protein interactions.</a> Nucleic Acids Res. 24 (17), 3341-3347 (1996).</li><li>Vidal, M., Brachmann, R. K., Fattaey, A., Harlow, E., Boeke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+two-hybrid+and+one-hybrid+systems+to+detect+dissociation+of+protein-protein+and+DNA-protein+interactions.">Reverse two-hybrid and one-hybrid systems to detect dissociation of protein-protein and DNA-protein interactions.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (19), 10315-10320 (1996).</li><li>Tanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+the+isolation+of+interaction-null/impaired+mutants+using+the+yeast+two-hybrid+technique.">An efficient method for the isolation of interaction-null/impaired mutants using the yeast two-hybrid technique.</a> Genes Cells. 24 (12), 781-788 (2019).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: A laboratory manual. 4th edn. , (2012).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Gene. 96 (1), 23-28 (1990).</li><li>Birnboim, H. C., Doly, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+alkaline+extraction+procedure+for+screening+recombinant+plasmid+DNA.">A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA.</a> Nucleic Acids Res. 7 (6), 1513-1523 (1979).</li><li>Bartel, P. L., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+protein-protein+interactions+using+two-hybrid+system.">Analyzing protein-protein interactions using two-hybrid system.</a> Meth Enzymol. 254, 241-263 (1995).</li><li>Hollenberg, S. M., Sternglanz, R., Cheng, P. F., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+new+family+of+tissue-specific+basic+helix-loop-helix+proteins+with+a+two-hybrid+system.">Identification of a new family of tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid system.</a> Mol Cell Biol. 15 (7), 3813-3822 (1995).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate/single-stranded+carrier+DNA/polyethylene+glycol+method.">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Meth Enzymol. 350, 87-96 (2002).</li><li>Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+reliable+protein+extraction+from+yeast.">Rapid and reliable protein extraction from yeast.</a> Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).</li><li>Van Deursen, F., Sengupta, S., De Piccoli, G., Sanchez-Diaz, A., Labib, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mcm10+associates+with+the+loaded+DNA+helicase+at+replication+origins+and+defines+a+novel+step+in+its+activation.">Mcm10 associates with the loaded DNA helicase at replication origins and defines a novel step in its activation.</a> EMBO J. 31 (9), 2195-2206 (2012).</li><li>Watase, G., Takisawa, H., Kanemaki, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mcm10+plays+a+role+in+functioning+of+the+eukaryotic+replicative+DNA+helicase,+cdc45-mcm-gins.">Mcm10 plays a role in functioning of the eukaryotic replicative DNA helicase, cdc45-mcm-gins.</a> Current Biology: CB. 22 (4), 343-349 (2012).</li><li>Miyazawa-Onami, M., Araki, H., Tanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-initiation+complex+assembly+functions+as+a+molecular+switch+that+splits+the+mcm2-7+double+hexamer.">Pre-initiation complex assembly functions as a molecular switch that splits the mcm2-7 double hexamer.</a> EMBO Rep. 18 (10), 1752-1761 (2017).</li></ol>

يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

توضح هذه المقالة كيفية عزل طفرات التفاعل الخالية / الضعيفة باستخدام مقايسة Y2H. هذه المسوخ هي أدوات قوية لتحليل وظيفة البروتين محل الاهتمام. لعزل هذه الطفرات ، تم تطوير فحوصات rY2H سابقا عن طريق تعديل سلالة مضيف Y2H 2,3. ومع ذلك ، فإنها لم تقلل بشكل كبير من كمية الع?...

التفاعلات بين الجزيئات الحيوية هي الجزء الأساسي من الظواهر البيولوجية. تشكل تفاعلات البروتين والبروتين جزءا مهما من هذه التفاعلات. لذلك ، فإن تحديد شريك (شركاء) التفاعل للبروتين محل الاهتمام أمر بالغ الأهمية لزيادة توضيح وظيفة البروتين / الجين محل الاهتمام. طريقة الخميرة ثنائية الهجين (Y2H) هي تقنية شائعة لتحديد تفاعلات البروتين والبروتين في الجسم الحي1. في هذا النظام ، يتم دمج اثنين من البروتينات (X و Y) التي سيتم اختبار تفاعلها في مجال ربط الحمض النووي (DB) ومجال تنشيط النسخ (AD) ، على التوالي. يرتبط بروتين الاندماج DB-X بتسلسل التعرف على مجال DB ؛ لذلك ، عندما يتفاعل البروتينان X و Y ، يقترب بروتين الاندماج AD-Y من تسلسل التعرف. وبالتالي ، يتم تنشيط نسخ جين المراسل في اتجاه مجرى تسلسل التعرف. لذلك ، يمكن استخدام وجود أو عدم وجود نشاط جيني مراسل لتحديد وجود أو عدم وجود تفاعل البروتينوالبروتين 1.
بمجرد تحديد شريك تفاعل معين للبروتين محل الاهتمام ، يجب إجراء مزيد من التحليلات لتوضيح الوظيفة البيولوجية للتفاعل. لهذا الغرض ، إذا كان من الممكن عزل طفرات البروتينات التي تضعف أو تزيل التفاعل المحدد بين البروتين والبروتين ، فستكون بمثابة أدوات قوية. يمكن استخدام نظام Y2H مباشرة لعزل هذه الطفرات عن طريق فحص المستنسخة "السلبية التفاعل" ، بدءا من استنساخ "التفاعل الإيجابي" من النوع البري. لتسريع هذه العملية ، تم تطوير أنظمة Y2H (rY2H) "العكسية" 2,3. في أنظمة rY2H ، تحتوي سلالات الخميرة المضيفة على جينات علامة قابلة للاختيار كجينات مراسلة ، مما يعني أن خلايا الخميرة تنمو فقط عندما لا تتفاعل بروتينات AD-Y و DB-X.
على الرغم من أن كلا من نظامي Y2H و rY2H يسمحان بعزل الطفرات السلبية التفاعل ، إلا أن عملية عزل الطفرات شاقة لأنه ليس كل المرشحين الذين تم الحصول عليهم عن طريق الفحص يحملون النوع المطلوب من الطفرات (عادة طفرات خاطئة). القضية الأكثر خطورة هي أن جزءا كبيرا من المرشحين لديهم طفرات أو طفرات هراء ، ومن الضروري إجراء النشاف الغربي لاستبعاد المستنسخة غير المرغوب فيها. للتغلب على هذه المشكلة ، تم تطوير ناقلات البلازميد الجديدة4. في هذه المتجهات ، يتم وضع KanMX ، وهي علامة مقاومة للأدوية ، خارج الإطار في اتجاه مجرى مجرى مجال DB أو AD. يصبح جين العلامة في الإطار مع مجال DB أو AD فقط عند إدخال الجين محل الاهتمام. عندما يتم إدخال طفرة (طفرات) عشوائية في الجين محل الاهتمام ، يمكن بسهولة القضاء على الطفرات غير المرغوب فيها ، مثل تلك التي تحتوي على طفرات إطارية أو طفرات هراء ، عن طريق إجراء اختيار مقاومة الأدوية ، ويمكن بسهولة تحديد المرشحين الذين يحملون طفرات خاطئة مرغوبة باستخدام شاشة Y2H4. تقدم هذه المقالة بروتوكولا لعزل طفرات التفاعل الخالية / الضعيفة لبروتين مهم باستخدام هذه الإستراتيجية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA (8.0)</td>
			<td>Nacalai Tesque Inc.</td>
			<td>14347-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% SDS Solution</td>
			<td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td>
			<td>313-90275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td>
			<td>135-07522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Kishida Chemical Co. Ltd.</td>
			<td>110-64785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-&#946;-D-galactopyranoside (X-Gal)</td>
			<td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td>
			<td>021-07852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>AGR60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium</td>
			<td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td>
			<td>68-52-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HA-tag mAb-HRP-DirecT&#160;&#160;</td>
			<td>Medical &#38; Biological Laboratories Co. Ltd.</td>
			<td>M180-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA from salmon testes</td>
			<td>Merck KGaA.</td>
			<td>D1626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck KGaA.</td>
			<td>9-0770-4-4L-J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper for colony lift (Grade 50)</td>
			<td>Whatman, Cytiva</td>
			<td>1450-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper for colony lift (No.4A)</td>
			<td>Advantec Toyo Kaisha, Ltd.</td>
			<td>01411090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper for replicaplating (No.1)</td>
			<td>Advantec Toyo Kaisha, Ltd.</td>
			<td>00011150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-418 Sulfate</td>
			<td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td>
			<td>075-05962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Kishida Chemical Co. Ltd.</td>
			<td>230-37585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td>
			<td>163-03545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Acetate Dihydrate</td>
			<td>Nacalai Tesque Inc.</td>
			<td>20604-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#8226;7H2O</td>
			<td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td>
			<td>131-00405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#8226;12H2O</td>
			<td>Nacalai Tesque Inc.</td>
			<td>10039-32-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Nacalai Tesque Inc.</td>
			<td>31319-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#8226;2H2O</td>
			<td>Nacalai Tesque Inc.</td>
			<td>31717-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towel</td>
			<td>AS ONE Corp.</td>
			<td>7-6200-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1</td>
			<td>Nacalai Tesque Inc.</td>
			<td>25970-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNAs</td>
			<td>the National BioResource Project - yeast (https://yeast.nig.ac.jp/yeast/top.xhtml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid isolation Kit</td>
			<td>Nippon Genetics Co. Ltd.</td>
			<td>FG-90502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol #4,000</td>
			<td>Nacalai Tesque Inc.</td>
			<td>11574-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC double drop-out mix -Leu -Trp</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DSCK172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seamless cloning kit (In-Fusion assembly )</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>#639648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk powder</td>
			<td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td>
			<td>190-12865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin Sulfate</td>
			<td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td>
			<td>3810-74-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq polymerase (GoTaq Green Master Mixes)</td>
			<td>Promega Corp.</td>
			<td>M7122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS (hydroxymethyl) aminomethane</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>TRIS01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Nacalai Tesque Inc.</td>
			<td>12967-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>ThermoFisher scientific Inc.</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Nacalai Tesque Inc.</td>
			<td>35624-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>ThermoFisher scientific Inc.</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Nitrogen Base (YNB)</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>CYN0210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolyase 100T</td>
			<td>Nacalai Tesque Inc.</td>
			<td>07665-55</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating interaction-null&#47;impaired mutants using the yeast two-hybrid assay

التفاعلات بين البروتين والبروتين هي واحدة من العمليات الأساسية التي تكمن وراء الظواهر البيولوجية. واحدة من أبسط وأفضل الطرق لفهم دور (أدوار) ووظيفة (وظائف) تفاعل معين بين البروتين والبروتين هي مقارنة النمط الظاهري للنوع البري (مع تفاعل البروتين والبروتين ذي الصلة) وتلك الخاصة بالطفرات التي تفتقر إلى التفاعل ذي الصلة. لذلك ، إذا كان من الممكن عزل هذه الطفرات ، فإنها ستساعد على توضيح العمليات البيولوجية ذات الصلة. يعد إجراء الخميرة ثنائي الهجين (Y2H) نهجا قويا ليس فقط للكشف عن تفاعلات البروتين والبروتين ولكن أيضا لعزل الطفرات الخالية / الضعيفة. في هذه المقالة ، يتم تقديم بروتوكول لعزل طفرات التفاعل الفارغة / الضعيفة باستخدام تقنية Y2H. أولا ، يتم إنشاء مكتبة الطفرات من خلال الجمع بين تفاعل البلمرة المتسلسل وتقنية الاستنساخ غير الملحومة الفعالة ، والتي تستبعد بكفاءة المتجه الفارغ من المكتبة. ثانيا ، يتم فحص طفرات التفاعل الفارغة / الضعيفة بواسطة مقايسة Y2H. بسبب خدعة في ناقل Y2H ، يتم التخلص بكفاءة من الطفرات غير المرغوب فيها ، مثل تلك التي تحتوي على طفرات في الإطار وهراء ، من عملية الفحص. هذه الاستراتيجية بسيطة ويمكن تطبيقها على أي مجموعة من البروتينات التي يمكن اكتشاف تفاعلها بواسطة النظام الهجين.

Interactions between biomolecules are the most basic part of biological phenomena. Protein-protein interactions constitute a significant part of such interactions. Therefore, identification of the interaction partner(s) of a protein of interest is critical to further elucidate the function of the protein/gene of interest. The yeast two-hybrid (Y2H) method is a popular technique to identify protein-protein interactions in vivo1. In this system, two proteins (X and Y) whose interaction is to be tested are fused to the DNA-binding (DB) domain and transcriptional activation domain (AD), respectively. The DB-X fusion protein binds to a recognition sequence of the DB domain; therefore, when proteins X and Y interact, the AD-Y fusion protein comes into the proximity of the recognition sequence. Consequently, transcription of the reporter gene downstream of the recognition sequence is activated. Therefore, the presence or absence of reporter gene activity can be used to determine the presence or absence of the protein-protein interaction1.
Once a specific interaction partner of the protein of interest is identified, further analyses should be performed to elucidate the biological function of the interaction. For this purpose, if mutants of the proteins that impair or remove the specific protein-protein interaction can be isolated, they will serve as powerful tools. The Y2H system can be used directly to isolate such mutants by screening 'interaction-negative' clones, starting with the wild-type 'interaction-positive' clone. To accelerate this process, 'reverse' Y2H (rY2H) systems were developed2,3. In rY2H systems, the host yeast strains harbor counter-selectable marker genes as reporter genes, meaning yeast cells grow only when the AD-Y and DB-X proteins do not interact.
Although both the Y2H and rY2H systems allow the isolation of interaction-negative mutants, the process of isolating the mutants is laborious because not all of the candidates obtained by screening carry the desired type of mutations (usually missense mutations). The most serious issue is that a significant fraction of candidates harbor frameshift or nonsense mutations, and it is necessary to perform western blotting to exclude undesired clones. To overcome this problem, new plasmid vectors have been developed4. In these vectors, KanMX, a drug resistance marker, is positioned out-of-frame downstream of the DB domain or AD. The marker gene becomes in-frame with the DB domain or AD only when the gene of interest is inserted. When a random mutation(s) is introduced in the gene of interest, undesirable mutants, such as those with frameshift or nonsense mutations, can be easily eliminated by performing drug resistance selection, and candidates carrying desirable missense mutations can be easily identified with the Y2H screen4. This article presents a protocol to isolate interaction-null/impaired mutants of a protein of interest using this strategy.

تسليط الضوء على المؤلف: تعزيز عزل الطفرات الفارغة للتفاعل في الخميرة

عزل الطفرات التفاعلية الفارغة / الضعيفة باستخدام مقايسة الخميرة ثنائية الهجين

We are interested in understanding the regulatory mechanisms of the cell cycle in Eukaryotes, especially the relationship between DNA replication, stable germ maintenance, and cell proliferation. The progression of the cell cycle is regulated by cyclin-dependent kinases, or CDKs, in Eukaryotes. This is the case for the initiation of DNA replication.We have identified a way, on substrates of CDKs, to initiate DNA replication. To understand the function of the protein of your interest, a comparison of the wild-type and mutant is a direct and effective way. Yeast two-hybrid assay, being simple detection and will enhance the process of isolating interaction-null mutants.This will contribute to advancement of research in the field.

في الآونة الأخيرة ، وجد أن النصف الطرفي C من بروتين Pol2 (Pol2-C) يتفاعل مع Mcm10. كلا البروتينين ضروريان لبدء تكرار الحمض النووي ، وبالتالي لنمو الخلايا في الخميرة الناشئة Saccharomyces cerevisiae13،14،15. للمساعدة في فهم الأهمية البيولوجية لهذا التفاعل ?...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Enhanced Isolation of Interaction-Null Mutants in Yeast at JoVE.com

تفاعلات الجزيئات الحيوية ، مثل تفاعلات البروتين والبروتين ، هي الأساس الجزيئي للوظائف البيولوجية. إذا كان من الممكن عزل طفرات التفاعل الخالية / الضعيفة التي تفتقر على وجه التحديد إلى التفاعل ذي الصلة ، فإنها ستساعد بشكل كبير على فهم وظيفة (وظائف) هذا التفاعل. تقدم هذه المقالة طريقة فعالة لعزل طفرات التفاعل الفارغة / الضعيفة.

Protein-protein interactions are one of the most basic processes that underlie biological phenomena. One of the simplest and best ways to understand the ...

نحن مهتمون بفهم الآليات التنظيمية لدورة الخلية في حقيقيات النوى، وخاصة العلاقة بين تضاعف الحمض النووي (DNA)، والصيانة الجرثومية المستقرة، وتكاثر الخلايا. يتم تنظيم تطور دورة الخلية بواسطة كينازات تعتمد على السيكلين ، أو CDKs ، في حقيقيات النوى. هذا هو الحال بالنسبة لبدء تضاعف الحمض النووي.لقد حددنا طريقة ، على ركائز CDKs ، لبدء تضاعف الحمض النووي. لفهم وظيفة البروتين الذي يهمك ، فإن المقارنة بين النوع البري والمتحولة هي طريقة مباشرة وفعالة. مقايسة الخميرة ثنائية الهجين ، كونها كشفا بسيطا وستعزز عملية عزل طفرات التفاعل الفارغة.هذا سوف يسهم في النهوض بالبحوث في هذا المجال.

isolating-interaction-nullimpaired-mutants-using-yeast-two-hybrid

Research

JoVE Journal

Biology

Isolating Interaction-Null&#47;Impaired Mutants Using the Yeast Two-Hybrid Assay

293 Views.  Kochi University of Technology. نحن مهتمون بفهم الآليات التنظيمية لدورة الخلية في حقيقيات النوى، وخاصة العلاقة بين تضاعف الحمض النووي (DNA)، والصيانة الجرثومية المستقرة، وتكاثر الخلايا. يتم تنظيم تطور دورة الخلية بواسطة كينازات تعتمد على السيكلين ، أو CDKs ، في حقيقيات النوى. هذا هو الحال بالنسبة لبدء تضاعف...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: تعزيز عزل الطفرات الفارغة للتفاعل في الخميرة

Protein-protein interactions are one of the most basic processes that underlie biological phenomena. One of the simplest and best ways to understand the role(s) and function(s) of a specific protein-protein interaction is to compare the phenotype of the wild-type (with the relevant protein-protein interaction) and those of mutants that lack the relevant interaction. Therefore, if such mutants can be isolated, they will help to elucidate the related biological processes. The yeast two-hybrid (Y2H) procedure is a powerful approach not only to detect protein-protein interactions but also to isolate interaction-null/impaired mutants. In this article, a protocol is presented to isolate interaction-null/impaired mutants using Y2H technology. First, a mutation library is constructed by combining the polymerase chain reaction and efficient seamless cloning technology, which efficiently excludes the empty vector from the library. Second, interaction-null/impaired mutants are screened by the Y2H assay. Because of a trick in the Y2H vector, undesired mutants, such as those with frameshift and nonsense mutations, are efficiently eliminated from the screening process. This strategy is simple and can, therefore, be applied to any combination of proteins whose interaction can be detected by the two-hybrid system.

The interactions of biomolecules, such as protein-protein interactions, are the molecular basis of biological functions. If interaction-null/impaired mutants that specifically lack the relevant interaction can be isolated, they will greatly help to understand the function(s) of this interaction. This article presents an efficient way to isolate interaction-null/impaired mutants.

Employment of Two Hybrid Assay to Identify Interaction-Impaired Mutants in Yeast

To begin, obtain the host yeast strain, transformed with the bait plasmid. After introducing the mutant library into it, select a plate with 500 to 2000 colonies. Set two sheets of filter paper on a replica block and make several replicas of the plate, and incubate the plates at 30 degrees Celsius for one to two days.For the yeast two hybrid color assay, place a sheet of filter paper on the replica plate until it is completely moistened. Remove excess moisture using several sheets of paper towel, twice. Then, using tweezers, peel the filter paper off the plate from the edge and quickly immerse it in liquid nitrogen.Thaw the frozen filter paper on a dry paper towel with the colony side up. Once thawed, immediately transfer it onto another filter paper soaked with buffer. Cover the plastic tray containing the filter paper, put it into an airtight container, and incubate it at 37 degrees Celsius.Once blue color appears, place the filter paper on 500 microliters of stop solution taken in a plastic tray and immediately dry it on a fresh paper towel. The color assay produced blue or white dots, differentiating the mutants that did not interact with the bait.