Name: isolating potentiated hsp104 variants using yeast proteinopathy models
Uploaded: 2014-11-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models at JoVE.com

We thank Sue Lindquist, Aaron Gitler, and Martin Duennwald for kindly sharing reagents. Our studies were supported by: an American Heart Association Post-Doctoral Fellowship (M.E.J); NIH Director's New Innovator Award DP2OD002177, NIH grants R21NS067354, R21HD074510, and R01GM099836, a Muscular Dystrophy Association Research Award (MDA277268), Packard Center for ALS Research at Johns Hopkins University, Target ALS, and an Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging Award (J.S.).

1. مكتبة الجيل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لبناء مكتبات Hsp104 باستخدام نطاق محدد عرضة للخطأ PCR، أولا تضخيم مجال الاهتمام مع وجود خطأ DNA عرضة البلمرة 20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية المنتج PCR عن طريق استخراج الهلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء خطوة التمديد megaprimer باستخدام بروتوكول الطفرات موقع الموجه القياسية: الجمع بين 50 نانوغرام قالب البلازميد، 250 نانوغرام megaprimer، 200 ميكرومتر dNTPs، وعالية الدقة البلمرة DNA العازلة في PCR، وتمييع إلى 50 ميكرولتر الحجم الكلي مع PCR الصف المياه 20 . تشغيل برنامج PCR القياسية. ملاحظة: الاشعال المحددة المستخدمة سوف تختلف بناء على منطقة معينة من الجين الذي سيتم تضخيمها. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد PCR، هضم الحمض النووي قالب الوالدين مع 1 ميكرولتر DPN أنا انزيم التقييد لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل مكتبة بواسطة الصعق الكهربائي أو غيرها من الوسائل في ultracompetent E. القولونية وتنقية من قبل miniprep. ملاحظة: الجيل المكتبةيختلف تستند إلى حد كبير على أهداف تجربة معينة. Hsp104 هو بروتين كبير جدا، لذلك هو غير عملي بطريقة عشوائية الجين بأكمله، وهو ما يدفعنا إلى الاستفادة من الخطأ نطاق محدد عرضة PCR. بالإضافة إلى ذلك، فإن هيكل Hsp104 تزال غير مفهومة تماما، مما يجعل من تصميم المكتبات موجها تحدي 21. المكتبات يمكن بناؤها باستخدام نهج موجهة أو عشوائية لالطفرات، مع التقييد الوحيد هو أن القالب البلازميد العمود الفقري يجب أن يحتوي على الجين URA3 للسماح لمدة 5-FOA مكافحة الاختيار على وسائل الإعلام الدكستروز. </li></ol> 2. التحول من مكتبة Hsp104 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دمج الركيزة المصاحبة للمرض في W303aΔ hsp104 الخميرة باستخدام خلات الليثيوم القياسية / PEG التحول بروتوكول 22. حدد المستعمرات واحد وفحص لهم لسمية لعزل سلالة مع سمية عالية للمرض الركيزة 23 المرتبطة بها. ملاحظة: استخدم سلالة وايزولا متكاملةالشركة المصرية للاتصالات مستعمرة واحدة لضمان التعبير على قدم المساواة في جميع الخلايا. استنساخ الركيزة المرض إلى البلازميد السماح دمج الجين تحت أي علامة أخرى من اليوراسيل (نستخدم الحامض الاميني) ومكتبة Hsp104 في البلازميد pAG416GAL (اليوراسيل علامة) 24. للسماح لمدة 5-FOA counterselection، وضمان أن يتم التعبير عن مكتبة من البلازميد مع علامة اليوراسيل. ويمكن أيضا أن تستخدم سلالات الخميرة الأخرى. لاحظنا مماثل النمط الظاهري سمية قمع باستخدام W303a وBY4741 سلالات الخميرة في كل وزن وΔ الخلفيات hsp104 (MEJ وشبيبة، والملاحظات غير منشورة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل مكتبة Hsp104 إلى هذه السلالة باستخدام نفس الليثيوم خلات / PEG التحول بروتوكول 22. توسيع نطاق التحول مناسب للحفاظ على الفضاء تسلسل المكتبة والحفاظ على حجم مكتبة المتوقعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة الخليط التحول إلى noninducing، لوحات منتقاة (مثل SD-صاحب-أورا) باستخدام لوحات كافية لضمان نمو عدد كبير من المستعمرات. استخدام أطباق بتري كبير (150 ملم) للحد من عدد من لوحات الحاجة. يتعافى transformants يسمح باستخدام لوحات كفاءة التحول ليتم تقييمها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل Hsp104 WT والضوابط السلبية ناقلات بالتوازي. </li></ol> 3. فحص لقمع Proteotoxicity <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل المستعمرات من لوحات باستخدام رافينوز تستكمل وسائل الاعلام التسرب (مثل SRaff-صاحب-أورا). استخدام ماصة المصلية وتطبيقها خشبية معقمة لتخفيف المستعمرات من لوحات. نقل يغسل السائل إلى 50 مل أنبوب مخروطي ودوامة تماما لفصل أي كتل من الخلايا. تمييع إلى ثقافة غائم قليلا، OD 600 ~ 0.025. ملاحظة: هنا يخدم رافينوز لتخفيف الخلايا من القمع بوساطة الجلوكوز من الاستقراء، وبالتالي فتيلة الخلايا للبوساطة الحث الجلاكتوز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو ثقافة المخفف بين عشية وضحاها في وسائل الإعلام التسرب رافينوز مع اهتزاز عند 30 درجة مئوية. نمو Hsp104 WT والضوابط ناقلات بالتوازي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في صباح اليوم التالي، لوحة مجموعة من تركيزات على اللبن الفردية (مثل SGal-صاحب-أورا) لوحات (1 ميكرولتر إلى 2 مل تتركز ثقافة في 400 ميكرولتر إجمالي حجم). سوف تصفيح مجموعة واسعة من تركيزات ضمان أن طبق سيكون لها مستعمرات واحدة. التركيز الفعلي المطلوب يعتمد على سمية الركيزة المرض من الاهتمام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيع ناقلات والثقافات Hsp104 WT إلى OD 600 من مكتبة ولوحة أحجام متساوية لمقارنة نمو مكتبة نسبة إلى الضوابط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتقييم اختيار صرامة، لوحة المكتبة على الجلوكوز (قمع) وسائل الاعلام. احتضان لوحات لمدة 2-3 أيام عند 30 درجة مئوية، حتى تظهر مستعمرات (الشكل 2). تقييم المستعمرات الناتجة عنها، ومقارنتها مع الضوابط. ملاحظة: غالبا ما يتم الحصول على كل من المستعمرات الكبيرة والصغيرة، ولكن لا علاقة بين حجم مستعمرة والعملويلاحظ ivity. فحص هذه الضربات المحتملة باستخدام تقنية مكافحة اختيار 5-FOA (الخطوة 4) للحد من ايجابيات كاذبة ترحيلها إلى التسلسل. </li></ol> 4. 5-FOA Counterselection والإكتشاف للقضاء على ايجابيات كاذبة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسحة من المستعمرات واحدة من نسختين على مزدوج واحد وسائل الاعلام التسرب (مثل SD-صاحب-SD-أورا وصاحب لوحات) وتنمو بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية. كرر مع النواقل وHsp104 WT الضوابط. طلي على SD-صاحب قبل 5 FOA يزيد من كفاءة الخطوة 5 FOA عن طريق زيادة احتمال أن الخلايا ستكون قد فقدت البلازميد Hsp104 عندما ومطلي انهم على 5 FOA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحيلولة دون لوحات من الجفاف، والتفاف على لوحات في بارافيلم صاحب أورا-SD-وتخزينها في 4 درجات مئوية أثناء أداء الشاشة 5-FOA. في نهاية المطاف يمكن استخدام هذه اللوحات لتسلسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خط المستعمرات من لوحات لالمستعمرات واحد على لوحات 5 FOA (YPD وسائل الاعلام + 1G / L 5-FOA)، واحتضان لمدة 1-2 أيام في 30 و صاحب SD-# 186؛ C حتى تظهر المستعمرات واحد. هنا، يتم تحويل 5 FOA إلى منتج سام (5 fluorodeoxyuridine) في الخلايا التي تحتوي على الجين URA3. وبالتالي، فإن أي خلايا لا تزال تؤوي البلازميد Hsp104 يموت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خط المستعمرات واحدة من لوحات 5 FOA في نسختين على SD-SD-أورا وصاحب لوحات. بلغت اختبار 3 مستعمرات لكل لزيادة احتمال أن مستعمرة واحدة على الأقل لكل ضرب سيكون قد خسر البلازميد Hsp104. احتضان لمدة 1-2 أيام عند 30 درجة مئوية. المستعمرات التي فقدت البلازميد Hsp104 سوف تنمو على SD-صاحب لوحات ولكن ليس SD-أورا لوحات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زراعة السلالات التي فقدت البلازميدات Hsp104 لاكتشاف المقايسات. زراعة سلالات من التشبع في رافينوز التسرب وسائل الإعلام (على سبيل المثال، صاحب SRaff) في 96 DeepWell 2 مل لوحات بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية مع اهتزاز. تأكد من تضمين سلالات السيطرة 5-FOA المعالجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد لوحات لاكتشاف الفحص. باستخدام ماصة الأقنية، قسامة 200 ميكرولتر رافينوز التسرب وسائل الإعلام (على سبيل المثال، صاحب SRaff) للبئر من 96 لوحة جيدا، حجز الأعمدة 1 و 7 للثقافات أنيق. قسامة 250 ميكرولتر من كل واحد من 16 الثقافات المشبعة في الأعمدة 1 و 7 من لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متسلسل تمييع الثقافات 5 أضعاف في كل عمود من لوحة، والخلط تماما مع ماصة الأقنية. إزالة 50 ميكرولتر من ثقافة المخفف من أعمدة 6 و 12 لضمان الحجم النهائي من كل بئر 200 ميكرولتر. هذا أمر ضروري لضمان حتى بقع دم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام أداة المكرر 96-الترباس (FROGGER)، بقعة الثقافات في نسختين على SD-صاحب وSGal-صاحب وحات. احتضان لوحات عند 30 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحديد تسلسل السلالات التي تظهر سمية على SGal-صاحب لوحات مماثلة لتلك الضوابط. تجاهل ايجابيات كاذبة سلالات كما أن ليست كما سامة مثل الضوابط. 5-FOA هي أيضا في كثير من الأحيان السامة من تلقاء نفسها، لذلك تجاهل السلالات التي تظهر وجود خلل في النمو SD-صاحب لوحات أو أن المعرض أكبر بكثير من سمية الركيزة المرض وحده ( <stronز&gt; الشكل 3). </li></ol> 5. تسلسل Hsp104 المتغيرات التي كتبها مستعمرة PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كشط ~ 10 ميكرولتر من الخميرة لوحات SD-صاحب-أورا في 3 ميكرولتر 20 ملي هيدروكسيد الصوديوم في أنابيب الشريط PCR وليز الخلايا عن طريق تجميد ذوبان الجليد. وضع أنابيب الشريط في الفريزر -80 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة أو في النيتروجين السائل، ثم احتضان عند 99 درجة مئوية في thermocycler لمدة 10 دقيقة. تخفيف الضغوط على 100 ميكرولتر مع PCR المياه الصف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد ردود الفعل PCR: قالب PCR 5 ميكرولتر 0.5 ميكرولتر من 100 ميكرومتر لكل التمهيدي، 0.5 ميكرولتر dNTPs 10MM، 0.25 البلمرة DNA ميكرولتر العازلة في PCR، وجعل ما يصل إلى 25 ميكرولتر الحجم الكلي مع PCR المياه الصف. تصميم الاشعال لتضخيم المنطقة العشوائية بالإضافة إلى ما يقرب من 100 شركة بريتيش بتروليوم على حد سواء. تقليل حجم المنطقة تضخيمها إلى زيادة احتمالات التضخيم ناجحة. تشغيل برنامج PCR القياسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل العينات بواسطة الاغاروز الكهربائي للهلام لتأكيد التضخيم للمنتج PCR من الاحجام المناسبةه. تكرار PCR إذا أي منتج موجود. ملاحظة: فشل PCR هو عادة بسبب الكثير من الخميرة المستخدمة في الخطوة 5.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير عينات للتسلسل الحمض النووي. إزالة الاشعال PCR إما عن طريق PCR تنقية أو استخدام منتج PCR تنظيف كاشف مثل نوكلياز خارجية الأول والروبيان إنزيم الفوسفاتيز القلوية (ExoSAP-IT) للحط من الحمض النووي واحد الذين تقطعت بهم السبل. هذا كاشف يحط إنزيمي الاشعال الفردية وdNTPs، والسماح لأعلى إنتاجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسلسل المنتجات PCR. تأكد من تحليل دقيق الاستشرابية تسلسل للطفرات. يمكن ملاحظة تحولات على شكل مزيج من اثنين من النيوكليوتيدات في موقع معين (الشكل 4)، والخميرة غالبا ما تؤوي البلازميدات متعددة. </li></ol>

<ol>
	<li>Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+TDP-43+proteinopathy+model:+Exploring+the+molecular+determinants+of+TDP-43+aggregation+and+cellular+toxicity.">A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105 (17), 6439-6444 (2008).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Determinants+and+Genetic+Modifiers+of+Aggregation+and+Toxicity+for+the+ALS+Disease+Protein+FUS/TLS.">Molecular Determinants and Genetic Modifiers of Aggregation and Toxicity for the ALS Disease Protein FUS/TLS.</a> PLoS Biol. 9 (4), (2011).</li><li>Outeiro, T. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+Cells+Provide+Insight+into+Alpha-Synuclein+Biology+and+Pathobiology.">Yeast Cells Provide Insight into Alpha-Synuclein Biology and Pathobiology.</a> Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).</li><li>Forman, M. S., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+diseases:+a+decade+of+discoveries+paves+the+way+for+therapeutic+breakthroughs.">Neurodegenerative diseases: a decade of discoveries paves the way for therapeutic breakthroughs.</a> Nat Med. 10 (10), 1055-1063 (2004).</li><li>Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress,+aging,+and+neurodegenerative+disease.">Stress, aging, and neurodegenerative disease.</a> N Engl J Med. 355 (21), 2254-2255 (2006).</li><li>Elden, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ataxin-2+intermediate-length+polyglutamine+expansions+are+associated+with+increased+risk+for+ALS.">Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS.</a> Nature. 466 (7310), 1069-1075 (2010).</li><li>Cooper, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+blocks+ER-Golgi+traffic+and+Rab1+rescues+neuron+loss+in+Parkinson's+models.">Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models.</a> Science. 313 (5785), 324-328 (2006).</li><li>Gitler, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+is+part+of+a+diverse+and+highly+conserved+interaction+network+that+includes+PARK9+and+manganese+toxicity.">Alpha-synuclein is part of a diverse and highly conserved interaction network that includes PARK9 and manganese toxicity.</a> Nature genetics. 41 (3), 308-315 (2009).</li><li>Su, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+from+an+unbiased+chemical+screen+reverse+both+ER-to-Golgi+trafficking+defects+and+mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson's+disease+models.">Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models.</a> Disease models &amp; mechanisms. (3-4), 194-208 (2010).</li><li>Tardiff, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+reveal+a+'druggable'+Rsp5/Nedd4+network+that+ameliorates+alpha-synuclein+toxicity+in+neurons.">Yeast reveal a 'druggable' Rsp5/Nedd4 network that ameliorates alpha-synuclein toxicity in neurons.</a> Science. 342 (6161), 979-983 (2013).</li><li>Tardiff, D. F., Tucci, M. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+8-hydroxyquinolines+protect+models+of+TDP-43+protein,+alpha-synuclein,+and+polyglutamine+proteotoxicity+through+distinct+mechanisms.">Different 8-hydroxyquinolines protect models of TDP-43 protein, alpha-synuclein, and polyglutamine proteotoxicity through distinct mechanisms.</a> The Journal of biological chemistry. 287 (6), 4107-4120 (2012).</li><li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+modulation+of+eIF2alpha+phosphorylation+rescues+TDP-43+toxicity+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+disease+models.">Therapeutic modulation of eIF2alpha phosphorylation rescues TDP-43 toxicity in amyotrophic lateral sclerosis disease models.</a> Nature. 46 (2), 152-160 (2014).</li><li>Ju, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+model+of+FUS/TLS-dependent+cytotoxicity.">A yeast model of FUS/TLS-dependent cytotoxicity.</a> PLoS Biol. 9 (4), (2011).</li><li>Shorter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp104:+a+weapon+to+combat+diverse+neurodegenerative+disorders.">Hsp104: a weapon to combat diverse neurodegenerative disorders.</a> Neurosignals. 16 (1), 63-74 (2008).</li><li>Vashist, S., Cushman, M., Shorter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+Hsp104+to+protein-misfolding+disorders.">Applying Hsp104 to protein-misfolding disorders.</a> Biochem Cell Biol. 88 (1), 1-13 (2010).</li><li>DeSantis, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Operational+Plasticity+Enables+Hsp104+to+Disaggregate+Diverse+Amyloid+and+Nonamyloid+Clients.">Operational Plasticity Enables Hsp104 to Disaggregate Diverse Amyloid and Nonamyloid Clients.</a> Cell. 151 (4), 778-793 (2012).</li><li>Jackrel, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentiated+Hsp104+Variants+Antagonize+Diverse+Proteotoxic+Misfolding+Events.">Potentiated Hsp104 Variants Antagonize Diverse Proteotoxic Misfolding Events.</a> Cell. 156 (1-2), 170-182 (2014).</li><li>Wittrup, K. D., Verdine, G. L., Wittrup, K. D., Verdine, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 503, 13-14 (2012).</li><li>Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 154, 164-175 (1987).</li><li>Miyazaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+Random+Mutagenesis+Libraries+by+Megaprimer+PCR+of+Whole+Plasmid+(MEGAWHOP).+Directed+Evolution+Library+Creation:+Methods+in+Molecular+Biology.">Creating Random Mutagenesis Libraries by Megaprimer PCR of Whole Plasmid (MEGAWHOP). Directed Evolution Library Creation: Methods in Molecular Biology.</a> eds FrancesH Arnold &amp; George Georgiou. 231, 23-28 (2003).</li><li>Saibil, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone+machines+for+protein+folding,+unfolding+and+disaggregation.">Chaperone machines for protein folding, unfolding and disaggregation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (10), 630-642 (2013).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+yeast+transformation+using+the+LiAc/SS+carrier+DNA/PEG+method.">High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).</li><li>Armakola, M., Hart, M. P., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+toxicity+in+yeast.">TDP-43 toxicity in yeast.</a> Methods. 53 (3), 238-245 (2011).</li><li>Alberti, S., Gitler, A. D., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+suite+of+Gateway&#174;+cloning+vectors+for+high-throughput+genetic+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A suite of Gateway&#174; cloning vectors for high-throughput genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 24 (10), 913-919 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

هنا نقدم نهجنا لعزل potentiated Hsp104 المتغيرات التي تقمع سمية ركائز المرتبط المرض باستخدام نماذج الخميرة proteinopathy. باستخدام هذا النهج، مكتبات كبيرة من المتغيرات يمكن عرضه في إنتاجية عالية، والحد الوحيد هو في عدد من المتغيرات التي تمر على الشاشة الثانوية 5-FOA. قبل تنفيذ هذه الخطوات في 96 شكل جيد، ونحن فحص روتيني ما يصل الى 200 ضربات في وقت في الخطوة 5-FOA على مدى 1-2 أسابيع. وعدد الزيارات التي تم الحصول عليها أثناء الفحص خطوة أولية تختلف اعتمادا إلى حد كبير على سمية الركيزة وماكياج من كل مكتبة معينة. عندما تسلسل الضربات، فمن الضروري أن نحلل بعناية كل الاستشرابية التسلسل منذ خليط من البلازميدات وعادة ما تكون موجودة في كل خلية. لاحظنا في بعض الأحيان نسبة كبيرة من Hsp104 WT يجري عزل باسم &#39;يضرب&#39;. هذا هو الأرجح بسبب وجود عفوية الوراثيةالمكثفات أو نشاط ضعيف جدا. للتحايل على هذه المشكلة، وجدنا أن الفحص في درجات حرارة مرتفعة (على سبيل المثال 34 درجة مئوية) يمكن أن تقلل من نسبة &quot;الزيارات&quot; التي هي Hsp104 WT. ومن الضروري أيضا إعادة استنساخ، أي ضربات متسلسلة لتقييم مستقل لنشاط من أي متغيرات جديدة وضمان بلازميد النقاء. مرة واحدة يتم تحديد الزيارات جديدة، فإنها يمكن تقييم لقمع تجميع في الخميرة ويتميز كيميائيا. وقد استخدمنا هذه الطرق لعزل potentiated Hsp104 المتغيرات ضد TDP-43، الفتح، وα-synuclein والتحقق منها نشاطهم باستخدام البروتين النقي فحوصات الكيمياء الحيوية 17. في نهاية المطاف، ويمكن استخدام هذه الطرق لفحص البروتين المكتبات ضد أي ركيزة من الفائدة التي هي سامة في الخميرة.

وقد تم تطوير نماذج proteinopathy الخميرة للاضطرابات misfolding البروتين بما في ذلك التصلب الضموري الجانبي (ALS) ومرض باركنسون (PD) 1-3. التعبير عن البروتينات TDP-43 والفتح الرباطي، الذي misfold في مرضى ALS، هي سامة وmislocalize لتشكيل المجاميع حشوية في الخميرة 1،2. وبالمثل، فإن التعبير عن α-synuclein (α-SYN)، والذي تورط في PD، غير سامة وmislocalizes لتشكيل المجاميع حشوية في الخميرة 3. هذه الميزات ألخص الظواهر في المرضى الذين يعانون من هذه الاضطرابات 4،5. وبالتالي، نماذج الخميرة توفر منبرا مفيدا لفحص للبروتينات أو الجزيئات الصغيرة التي منع أو عكس هذه الظواهر 2،6-13. ونحن مهتمون في تطوير بروتينات قادرة على عكس التجميع وسمية بسبب TDP-43، الفتح، وα-SYN. ونحن نركز على Hsp104، وهو AAA + البروتين من الخميرة قادرة فريد من تجزئة البروتينات سواء الابالمجاميع غير متبلور أوم واميلويد في الخميرة، إلا أنه لا يوجد لديه نديد البشري 14،15. يتم ضبطها بدقة Hsp104 إلى تفصيل البريونات الخميرة الذاتية وليس لديها سوى قدرة محدودة على تفصيل ركائز المتورطين في أمراض الاعصاب الإنسان، وهو ما لم يصادف عادة 16،17. وبالتالي، فإننا نهدف إلى مهندس إصدارات محسنة من Hsp104 التي تكون قادرة على تفصيل هذه ركائز الإنسان بشكل فعال. للقيام بذلك، ونحن بناء مكتبات كبيرة من Hsp104 المتغيرات باستخدام عرضة للخطأ PCR. هذه المكتبات يمكن عرضه باستخدام نماذج الخميرة proteinopathy 17. اعتمدنا نهجا المستهدفة المجال إلى بناء وفحص والمكتبات، كما Hsp104 هي كبيرة جدا 17. ركزنا في البداية على المجال المتوسط ​​(MD) من Hsp104 17، على الرغم من نهج مماثلة يمكن استخدامها لفحص المجالات الأخرى. هذه النماذج تمكين الكشف عن النشاط disaggregase مباشرة، بدلا من تقنيات بديلة مثل سطح الشاشة، والتي هي بقيةricted لاستخدامها لمراقبة ملزمة 18. ويستند بروتوكول لدينا على خطوتين الفرز (الشكل 1). أولا، يتم اختيار المتغيرات Hsp104 التي تقمع سمية الركيزة المرض في الخميرة. للقيام بذلك، وHsp104 المتغيرات وcotransformed من الأمراض المرتبطة الركيزة في Δ hsp104 الخميرة. نحن توظيف Δ hsp104 الخميرة لاستكشاف الفضاء تسلسل Hsp104 في غياب البرية من نوع (WT) Hsp104 17. الأهم من ذلك، حذف Hsp104 لا يؤثر α-SYN، الفتح، أو TDP-43 سمية في الخميرة، والتعبير عن Hsp104 WT يوفر الحد الأدنى الإنقاذ 1،13،17. ثم يتم مطلي الخميرة على حمل وسائل الإعلام للحث على التعبير عن كل من البروتينات. الخميرة إيواء Hsp104 المتغيرات التي تقمع سمية النمو الركيزة تتداول المرتبط المرض للمستعمرة. ويتم اختيار هذه المتغيرات لمزيد من التحليل، في حين أن المستعمرات الحفاظ على المتغيرات التي لا قمع سمية يموت. ومع ذلك،ايجابيات كاذبة هي مشكلة كبيرة في هذه الشاشة. التعبير عن TDP-43، الفتح، وα-SYN شديدة السمية، مما يخلق ضغط انتقائي قوي لظهور المكثفات الوراثية عفوية سمية لا علاقة لها البديل Hsp104 يجري التعبير عنها. وبالتالي، فإننا قد استخدمت شاشة الثانوية التي هي أيضا إنتاجية عالية نسبيا للقضاء على هذه المكثفات سمية غير محددة 17. في هذه الشاشة الثانوية، ويتم التعامل مع الخميرة اختيار 5-Fluorootic حمض (5 FOA) لمواجهة حدد لالبلازميد Hsp104 19. ثم يتم تقييم السلالات لالركيزة (TDP-43، الفتح، أو α-SYN) سمية عن طريق اكتشاف فحص للتأكد من أن يتم استعادة سمية الركيزة بعد فقدان البلازميد Hsp104. وبالتالي، الخميرة التي يتم استعادة سمية في هذه شاشة عرض ثانوية يفترض أصلا سمية قمع بسبب وجود البديل Hsp104. وتتم تسمية هذه الخميرة باسم &#39;يضرب&#39; ويجب أن يكون البلازميد ثم Hsp104تعافى والتسلسل لتحديد الطفرات في الجين Hsp104 17 (الشكل 1). وينبغي بعد ذلك إعادة تأكيد أي إصابات عن طريق بناء الطفرة بشكل مستقل باستخدام الطفرات موقع الموجه ثم إعادة الاختبار لقمع سمية. التطبيقات المحتملة لهذا البروتوكول واسعة. باستخدام هذه الأساليب، يمكن فرزهم المكتبات من أي نوع من البروتين للمتغيرات التي تقمع سمية من أي بروتين الركيزة التي هي سامة في الخميرة.

<table><tbody><tr><td>GeneMorphII EZClone Domain Mutagenesis Kit</td><td>Agilent</td><td>200552</td><td></td></tr><tr><td>150 mm Petri dishes</td><td>Falcon</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluorootic Acid</td><td>Research Products International</td><td>f10501-5.0</td><td></td></tr><tr><td>96-DeepWell 2 ml Plates</td><td>Eppendorf</td><td>0030 502.302</td><td></td></tr><tr><td>96 bold replicator tool</td><td>V&amp;amp;P Scientific</td><td>vp-404</td><td></td></tr><tr><td>ExoSAP-IT</td><td>Affymetrix</td><td>78200</td><td></td></tr></tbody></table>

isolating potentiated hsp104 variants using yeast proteinopathy models

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic lateral sclerosis, and &#945;-synuclein, implicated in Parkinson&#8217;s disease, are toxic and form cytoplasmic aggregates in yeast. These features recapitulate protein pathologies observed in patients with these disorders. Thus, yeast are an ideal platform for isolating toxicity suppressors from libraries of protein variants. We are interested in applying protein disaggregases to eliminate misfolded toxic protein conformers. Specifically, we are engineering Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast that is uniquely capable of solubilizing both disordered aggregates and amyloid and returning the proteins to their native conformations. While Hsp104 is highly conserved in eukaryotes and eubacteria, it has no known metazoan homologue. Hsp104 has only limited ability to eliminate disordered aggregates and amyloid fibers implicated in human disease. Thus, we aim to engineer Hsp104 variants to reverse the protein misfolding implicated in neurodegenerative disorders. We have developed methods to screen large libraries of Hsp104 variants for suppression of proteotoxicity in yeast. As yeast are prone to spontaneous nonspecific suppression of toxicity, a two-step screening process has been developed to eliminate false positives. Using these methods, we have identified a series of potentiated Hsp104 variants that potently suppress the toxicity and aggregation of TDP-43, FUS, and &#945;-synuclein. Here, we describe this optimized protocol, which could be adapted to screen libraries constructed using any protein backbone for suppression of toxicity of any protein that is toxic in yeast.

لقد شيدت مكتبة من المتغيرات العشوائية Hsp104 في المجال المتوسط ​​وذلك لفحص قمع TDP-43 سمية. تحولت المكتبة ومطلي على الجلوكوز والجلاكتوز لوحات (الشكل 2) لتقييم صرامة من الشاشة. وقد تم اختيار المستعمرات واحد وتم اختيار السلالات مضادة باستخدام 5-FOA للقضاء على البلازميد Hsp104. ثم تم تقييم هذه السلالات لتأكيد أن سمية كان من المقرر أن TDP-43 وحدها، من دون متغيرات Hsp104. وأظهرت فحوصات اكتشاف مجموعة فرعية من المتغيرات المختارة في الشاشة الأولية التي من المستعمرات 4 المختارة، 2 عرض Hsp104 بوساطة قمع TDP-43 سمية (1)، كانت كاذبة إيجابي، وعرض 1 تعزيز سمية بعد العلاج 5-FOA (الشكل 3). وكان 2 ثم يضرب الحقيقية متسلسلة من قبل مستعمرة PCR لتحديد الطفرات النطاق المتوسط ​​(الشكل 4). مرة واحدة وقد تم تحديد هذه الطفرات، شيد الطفرة Hsp104<html> من جديد في البلازميد Hsp104 الوالدين من قبل الطفرات موقع الموجه لتأكيد سمية قمع. وقد أكد المتغيرات المحدد باستخدام هذه الأساليب في وقت لاحق لقمع تجميع في الخميرة، واضحة في المجاميع بريفورميد فحوصات البيوكيميائية، وقمع التنكس العصبي الدوبامين في C. ايليجانس نموذج PD 17. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52089/52089fig1highres.jpg" width="700" /> الشكل 1: تدفق البياني لعزل المتغيرات Hsp104 potentiated المكتبات Hsp104 (علامة URA3، GAL1 المروج) تتحول في الخميرة تحتوي على ركائز المرض (علامة HIS3، GAL1 المروج) وفحص المكثفات لسمية بواسطة الطلاء على وسائل الإعلام تحريض. ثم يتم فحص ضربات محتملة مرة أخرى باستخدام خطوة counterselection 5 FOA للقضاء على المكثفات سمية غير محددة. المتغيرات المختارة في هذه الخطوة الثانية بعد ذلك التسلسل من قبل مستعمرة PCR.<html> أ href = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/52089/52089fig1large.jpg&quot; الهدف = &quot;_ فارغا&quot;&gt; اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/52089/52089fig2highres.jpg" /> تم مطلي الكشف عن المكثفات سمية الخميرة cotransformed مع pAG303GAL-TDP-43 والمكتبة pAG416GAL-Hsp104 على الجلوكوز (قمع) أو اللبن (تحملها) وسائل الإعلام: الرقم 2. TDP-43 هو شديدة السمية، لذلك قليل جدا من المتغيرات Hsp104 قادرة على قمع هذه السمية، وهذه الشاشة هي صارمة جدا. ويتم اختيار المستعمرات واحدة كما يضرب من لوحة اللبن الثانوية للشاشة 5-FOA. كلاهما عادة الحصول على المستعمرات الكبيرة والصغيرة، لكننا لم يلاحظ أي الاتجاهات التي تملي كيف حجم مستعمرة يرتبط النشاط. s.jpg و&quot;/&gt; الرقم 3: 5 FOA الشاشة الثانوية الخميرة تعامل مع 5-FOA لمواجهة حدد لالبلازميد Hsp104 تم تقييمها من قبل اكتشاف الفحص. كانت تزرع سلالات في SRaff-صاحب وسائل الإعلام، المخفف متسلسل 5 أضعاف، ورصدت في نسختين على SD-صاحب وSGal-صاحب وحات. Hsp104 A503V هو ضرب صحيح أننا قد تحققت سابقا وتظهر هنا كعنصر تحكم مع ناقلات وحدها 17. الصفوف 3 و 4 هي ضربات المكتبة التي تحتفظ TDP-43 سمية فقدان التالية من القامع Hsp104. الصف 5 يظهر إيجابية كاذبة، حيث TDP-43 لم تعد سامة، ولذلك فإن سمية القامع غير محدد موجودا. الصف 6 يظهر السلالة التي هي أكثر سمية من TDP-43 هو عادة، وربما يعود ذلك إلى 5 FOA سمية. لا يزال من الممكن التسلسل هذه السلالة ولكن قد لا تكون ضربة صالح. <img alt="الرقم 4" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52089/52089fig4highres.jpg" width="300" /> الرقم 4. شرجيyzing النتائج التسلسل. وغالبا ما يحتوي على الخميرة مختارة البلازميدات متعددة. لذا، وبعد تسلسل المنتجات PCR مستعمرة، يجب توخي الحذر لضمان عدم التغاضي أي طفرات في الاستشرابية. في هذا اللوني، يمكن التغاضي اثنين من الطفرات المحتملة (الرمز بواسطة *). في المقام الأول، هناك خليط من A و T و في الثانية، وهي مزيج من T و C.

Watch this Scientific Journal Video about Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models at JoVE.com

Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models

Yeast proteinopathy models are valuable tools to assess the toxicity and aggregation of proteins implicated in disease. Here, we present methods for screening Hsp104 variant libraries for toxicity suppressors. This protocol could be adapted to screen any protein library for toxicity suppressors of any protein that is toxic in yeast.

عزل Potentiated Hsp104 المتغيرات عن طريق الخميرة Proteinopathy نماذج

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic ...

isolating-potentiated-hsp104-variants-using-yeast-proteinopathy-models

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

8.1K Views.  Perelman School of Medicine at the University of Pennsylvania. Yeast proteinopathy models are valuable tools to assess the toxicity and aggregation of proteins implicated in disease. Here, we present methods for screening Hsp104 variant libraries for toxicity suppressors. This protocol could be adapted to screen any protein library for toxicity suppressors of any protein that is toxic in yeast.

Video: Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of different functional assays to study the impacts of 1) binding site [i.e., response element (RE)] sequence variants on P53 transactivation specificity or 2) TP53 mutations, co-expressed cofactors, or small molecules on P53 transactivation activity. Different basic and translational research applications have been developed. Experimentally, these approaches exploit two major advantages of the yeast model. On one hand, the ease of genome editing enables quick construction of qualitative or quantitative reporter systems by exploiting isogenic strains that differ only at the level of a specific P53-RE to investigate sequence-specificity of P53-dependent transactivation. On the other hand, the availability of regulated systems for ectopic P53 expression allows the evaluation of transactivation in a wide range of protein expression. Reviewed in this report are extensively used systems that are based on color reporter genes, luciferase, and the growth of yeast to illustrate their main methodological steps and to critically assess their predictive power. Moreover, the extreme versatility of these approaches can be easily exploited to study different TFs including P63 and P73, which are other members of TP53 gene family.

Presented here are four protocols to construct and exploit yeast Saccharomyces cerevisiae reporter strains to study human P53 transactivation potential, impacts of its various cancer-associated mutations, co-expressed interacting proteins, and the effects of specific small molecules.

الخميرة كهيكل لتطوير الاختبارات الوظيفية لدراسة P53 الإنسان

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Cancer Research

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives each year. Effective treatment options able to halt disease progression are lacking. Despite the extensive sequencing efforts in large patient populations, the majority of ALS and PD cases remain unexplained by genetic mutations alone. Epigenetics mechanisms, such as the post-translational modification of histone proteins, may be involved in neurodegenerative disease etiology and progression and lead to new targets for pharmaceutical intervention. Mammalian in vivo and in vitro models of ALS and PD are costly and often require prolonged and laborious experimental protocols. Here, we outline a practical, fast, and cost-effective approach to determining genome-wide alterations in histone modification levels using Saccharomyces cerevisiae as a model system. This protocol allows for comprehensive investigations into epigenetic changes connected to neurodegenerative proteinopathies that corroborate previous findings in different model systems while significantly expanding our knowledge of the neurodegenerative disease epigenome.

This protocol outlines experimental procedures to characterize genome-wide changes in the levels of histone post-translational modifications (PTM) occurring in connection with the overexpression of proteins associated with ALS and Parkinson&#39;s disease in Saccharomyces cerevisiae models. After SDS-PAGE separation, individual histone PTM levels are detected with modification-specific antibodies via Western blotting.

يصف هستون تعديل بوستترانسلاشونال التعديلات في نماذج بروتينوباثي الأعصاب الخميرة

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Genetics

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

A المنهج المقارن لتوصيف المشهد من المضيف الممرض البروتين البروتين التفاعلات

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Immunology and Infection

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

الدراسات الجينية البشرية البروتينات إصلاح الحمض النووي باستخدام خميرة كنظام النموذجي

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key selective advantages. First, renaturation of disordered aggregates by Hsp104 empowers yeast survival after various protein-misfolding stresses, including heat shock3,5,11,12. Second, remodeling of cross-beta amyloid fibrils by Hsp104 enables yeast to exploit myriad prions (infectious amyloids) as a reservoir of beneficial and heritable phenotypic variation13-22. Remarkably, Hsp104 directly remodels preamyloid oligomers and amyloid fibrils, including those comprised of the yeast prion proteins Sup35 and Ure223-30. This amyloid-remodeling functionality is a specialized facet of yeast Hsp104. The E. coli orthologue, ClpB, fails to remodel preamyloid oligomers or amyloid fibrils26,31,32.
Hsp104 orthologues are found in all kingdoms of life except, perplexingly, animals. Indeed, whether animal cells possess any enzymatic system that couples protein disaggregation to renaturation (rather than degradation) remains unknown33-35. Thus, we and others have proposed that Hsp104 might be developed as a therapeutic agent for various neurodegenerative diseases connected with the misfolding of specific proteins into toxic preamyloid oligomers and amyloid fibrils4,7,23,36-38. There are no treatments that directly target the aggregated species associated with these diseases. Yet, Hsp104 dissolves toxic oligomers and amyloid fibrils composed of alpha-synuclein, which are connected with Parkinson's Disease23 as well as amyloid forms of PrP39. Importantly, Hsp104 reduces protein aggregation and ameliorates neurodegeneration in rodent models of Parkinson's Disease23 and Huntington's disease38. Ideally, to optimize therapy and minimize side effects, Hsp104 would be engineered and potentiated to selectively remodel specific aggregates central to the disease in question4,7. However, the limited structural and mechanistic understanding of how Hsp104 disaggregates such a diverse repertoire of aggregated structures and unrelated proteins frustrates these endeavors30,40-42.
To understand the structure and mechanism of Hsp104, it is essential to study the pure protein and reconstitute its disaggregase activity with minimal components. Hsp104 is a 102kDa protein with a pI of ~5.3, which hexamerizes in the presence of ADP or ATP, or at high protein concentrations in the absence of nucleotide43-46. Here, we describe an optimized protocol for the purification of highly active, stable Hsp104 from E. coli. The use of E. coli allows simplified large-scale production and our method can be performed quickly and reliably for numerous Hsp104 variants. Our protocol increases Hsp104 purity and simplifies His6-tag removal compared to a previous purification method from E. coli47. Moreover, our protocol is more facile and convenient than two more recent protocols26,48.

Here, we describe a protocol for the purification of highly active Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation. This scheme exploits a His6-tagged construct for affinity purification from E. coli followed by anion-exchange chromatography, His6-tag removal with TEV protease, and size-exclusion chromatography.

تنقية Hsp104 ، وهو بروتين Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's disease, and Huntington's disease 1. Huntington's disease (HD) is caused by the abnormal expansion of a polyglutamine (polyQ) region within the protein huntingtin. The polyQ-expanded huntingtin protein attains an aberrant conformation (i.e. it misfolds) and causes cellular toxicity 2. At least eight further neurodegenerative diseases are caused by polyQ-expansions, including the Spinocerebellar Ataxias and Kennedy&#x2019;s disease 3.
The model organism yeast has facilitated significant insights into the cellular and molecular basis of polyQ-toxicity, including the impact of intra- and inter-molecular factors of polyQ-toxicity, and the identification of cellular pathways that are impaired in cells expressing polyQ-expansion proteins 3-8. Importantly, many aspects of polyQ-toxicity that were found in yeast were reproduced in other experimental systems and to some extent in samples from HD patients, thus demonstrating the significance of the yeast model for the discovery of basic mechanisms underpinning polyQ-toxicity. 
A direct and relatively simple way to determine polyQ-toxicity in yeast is to measure growth defects of yeast cells expressing polyQ-expansion proteins. This manuscript describes three complementary experimental approaches to determine polyQ-toxicity in yeast by measuring the growth of yeast cells expressing polyQ-expansion proteins. The first two experimental approaches monitor yeast growth on plates, the third approach monitors the growth of liquid yeast cultures using the BioscreenC instrument. 
Furthermore, this manuscript describes experimental difficulties that can occur when handling yeast polyQ models and outlines strategies that will help to avoid or minimize these difficulties. The protocols described here can be used to identify and to characterize genetic pathways and small molecules that modulate polyQ-toxicity. Moreover, the described assays may serve as templates for accurate analyses of the toxicity caused by other disease-associated misfolded proteins in yeast models.

This manuscript describes three complementary protocols for assessing the toxicity of polyglutamine (polyQ)-expansion proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. These protocols can easily be modified to monitor the toxicity of other misfolded proteins in yeast.

نمو فحوصات لتقييم السمية في الخميرة Polyglutamine

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

فحوصات بالإضافة لرصد طوي ثانية بروتين في<em&gt; خميرة الخباز</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by &#946;-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

النهج الوراثية والبيوكيميائية ل<em&gt; في فيفو</em&gt; و<em&gt; في المختبر</em&gt; تقييم Oligomerization البروتين: دراسة حالة Ryanodine مستقبلات

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived inheritance encoded in protein conformation (rather than sequence) has long been viewed as paradigm-shifting but rare. The best characterized examples of such epigenetic elements are prions, which possess a self-assembling behavior that can drive the heritable manifestation of new phenotypes. Many archetypal prions display a striking N/Q-rich sequence bias and assemble into an amyloid fold. These unusual features have informed most screening efforts to identify new prion proteins. However, at least three known prions (including the founding prion, PrPSc) do not harbor these biochemical characteristics. We therefore developed an alternative method to probe the scope of protein-based inheritance based on a property of mass action: the transient overexpression of prion proteins increases the frequency at which they acquire a self-templating conformation. This paper describes a method for analyzing the capacity of the yeast ORFeome to elicit protein-based inheritance. Using this strategy, we previously found that &gt;1% of yeast proteins could fuel the emergence of biological traits that were long-lived, stable, and arose more frequently than genetic mutation. This approach can be employed in high throughput across entire ORFeomes or as a targeted screening paradigm for specific genetic networks or environmental stimuli. Just as forward genetic screens define numerous developmental and signaling pathways, these techniques provide a methodology to investigate the influence of protein-based inheritance in biological processes.

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

This protocol describes a high-throughput methodology to functionally screen for protein-based inheritance in S. cerevisiae.

الفرز الفائق للإرث القائم على البروتين في سيريفيسيا س.

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived ...

A Method to Study &#945;-Synuclein Toxicity and Aggregation Using a Humanized Yeast Model

Parkinson's disease is the second most common neurodegenerative disorder and is characterized by progressive cell death caused by the formation of Lewy bodies containing misfolded and aggregated &#945;-synuclein. &#945;-synuclein is an abundant presynaptic protein that regulates synaptic vesicle trafficking, but the accumulation of its proteinaceous inclusions results in neurotoxicity. Recent studies have revealed that various genetic factors, including bacterial chaperones, could reduce the formation of &#945;-synuclein aggregates in vitro. However, it is also important to monitor the anti-aggregation effect in the cell to apply this as a potential treatment for the patients. It would be ideal to use neuronal cells, but these cells are difficult to handle and take a long time to exhibit the anti-aggregation phenotype. Therefore, a quick and effective in vivo tool is required for the further evaluation of in vivo anti-aggregation activity. The method described here was used to monitor and analyze the anti-aggregation phenotype in the humanized yeast Saccharomyces cerevisiae, which expressed human &#945;-synuclein. This protocol demonstrates in vivo tools that could be used for monitoring &#945;-synuclein-induced cellular toxicity, as well as the formation of &#945;-synuclein aggregates in cells.

An in vivo physiological model of &#945;-synuclein is required to study and understand the pathogenesis of Parkinson's disease. We describe a method to monitor the cytotoxicity and aggregate formation of &#945;-synuclein using a humanized yeast model.

طريقة لدراسة سمية α-سينوكلين وتجميعها باستخدام نموذج خميرة متوافق مع البشر

Parkinson's disease is the second most common neurodegenerative disorder and is characterized by progressive cell death caused by the formation of Lewy ...

عزل Potentiated Hsp104 المتغيرات عن طريق الخميرة Proteinopathy نماذج

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video