Ю. Танака выполнил техническое усовершенствование Y2H. Эта работа поддерживается грантом JSPS KAKENHI No JP22K06336 и Институтом ферментации в Осаке.

Исследования биомолекулярного взаимодействия с использованием двухгибридной методики дрожжей 

<ol>
	<li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions.">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).</li><li>Leanna, C. A., Hannink, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reverse+two-hybrid+system:+A+genetic+scheme+for+selection+against+specific+protein/protein+interactions.">The reverse two-hybrid system: A genetic scheme for selection against specific protein/protein interactions.</a> Nucleic Acids Res. 24 (17), 3341-3347 (1996).</li><li>Vidal, M., Brachmann, R. K., Fattaey, A., Harlow, E., Boeke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+two-hybrid+and+one-hybrid+systems+to+detect+dissociation+of+protein-protein+and+DNA-protein+interactions.">Reverse two-hybrid and one-hybrid systems to detect dissociation of protein-protein and DNA-protein interactions.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (19), 10315-10320 (1996).</li><li>Tanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+the+isolation+of+interaction-null/impaired+mutants+using+the+yeast+two-hybrid+technique.">An efficient method for the isolation of interaction-null/impaired mutants using the yeast two-hybrid technique.</a> Genes Cells. 24 (12), 781-788 (2019).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: A laboratory manual. 4th edn. , (2012).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Gene. 96 (1), 23-28 (1990).</li><li>Birnboim, H. C., Doly, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+alkaline+extraction+procedure+for+screening+recombinant+plasmid+DNA.">A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA.</a> Nucleic Acids Res. 7 (6), 1513-1523 (1979).</li><li>Bartel, P. L., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+protein-protein+interactions+using+two-hybrid+system.">Analyzing protein-protein interactions using two-hybrid system.</a> Meth Enzymol. 254, 241-263 (1995).</li><li>Hollenberg, S. M., Sternglanz, R., Cheng, P. F., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+new+family+of+tissue-specific+basic+helix-loop-helix+proteins+with+a+two-hybrid+system.">Identification of a new family of tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid system.</a> Mol Cell Biol. 15 (7), 3813-3822 (1995).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate/single-stranded+carrier+DNA/polyethylene+glycol+method.">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Meth Enzymol. 350, 87-96 (2002).</li><li>Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+reliable+protein+extraction+from+yeast.">Rapid and reliable protein extraction from yeast.</a> Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).</li><li>Van Deursen, F., Sengupta, S., De Piccoli, G., Sanchez-Diaz, A., Labib, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mcm10+associates+with+the+loaded+DNA+helicase+at+replication+origins+and+defines+a+novel+step+in+its+activation.">Mcm10 associates with the loaded DNA helicase at replication origins and defines a novel step in its activation.</a> EMBO J. 31 (9), 2195-2206 (2012).</li><li>Watase, G., Takisawa, H., Kanemaki, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mcm10+plays+a+role+in+functioning+of+the+eukaryotic+replicative+DNA+helicase,+cdc45-mcm-gins.">Mcm10 plays a role in functioning of the eukaryotic replicative DNA helicase, cdc45-mcm-gins.</a> Current Biology: CB. 22 (4), 343-349 (2012).</li><li>Miyazawa-Onami, M., Araki, H., Tanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-initiation+complex+assembly+functions+as+a+molecular+switch+that+splits+the+mcm2-7+double+hexamer.">Pre-initiation complex assembly functions as a molecular switch that splits the mcm2-7 double hexamer.</a> EMBO Rep. 18 (10), 1752-1761 (2017).</li></ol>

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

В этой статье описывается, как изолировать мутанты с нулевым взаимодействием/ослабленные мутанты с помощью анализа Y2H. Такие мутанты являются мощными инструментами для анализа функции интересующего белка. Для выделения таких мутантов ранее были разработаны анализы rY2H путем модификац...

Взаимодействия между биомолекулами являются самой основной частью биологических явлений. Белок-белковые взаимодействия составляют значительную часть таких взаимодействий. Таким образом, идентификация партнера (партнеров) по взаимодействию представляющего интерес белка имеет решающее значение для дальнейшего выяснения функции представляющего интерес белка/гена. Двухгибридный метод дрожжей (Y2H) является популярным методом выявления белок-белковых взаимодействий in vivo1. В этой системе два белка (X и Y), взаимодействие которых необходимо проверить, сливаются с ДНК-связывающим доменом (DB) и доменом активации транскрипции (AD) соответственно. Слитый белок DB-X связывается с узнавающей последовательностью домена DB; следовательно, когда белки X и Y взаимодействуют, гибридный белок AD-Y оказывается в непосредственной близости от узнавающей последовательности. Следовательно, активируется транскрипция репортерного гена после узнавающей последовательности. Таким образом, наличие или отсутствие активности репортерного гена может быть использовано для определения наличия или отсутствия белок-белкового взаимодействия1.
После того, как определен конкретный партнер по взаимодействию с представляющим интерес белком, следует провести дальнейший анализ для выяснения биологической функции взаимодействия. С этой целью, если удастся выделить мутанты белков, которые нарушают или удаляют специфическое белок-белковое взаимодействие, они послужат мощными инструментами. Система Y2H может быть использована непосредственно для изоляции таких мутантов путем скрининга клонов с отрицательным взаимодействием, начиная с «положительного по взаимодействию» клона дикого типа. Для ускорения этого процессабыли разработаны «обратные» системы Y2H (rY2H) 2,3. В системах rY2H штаммы дрожжей-хозяев содержат контрселективные маркерные гены в качестве репортерных генов, что означает, что дрожжевые клетки растут только тогда, когда белки AD-Y и DB-X не взаимодействуют.
Несмотря на то, что системы Y2H и rY2H позволяют изолировать мутанты, отрицательные по отношению к взаимодействию, процесс выделения мутантов является трудоемким, поскольку не все кандидаты, полученные в результате скрининга, несут желаемый тип мутаций (обычно миссенс-мутации). Самая серьезная проблема заключается в том, что значительная часть кандидатов содержит сдвиг рамки считывания или бессмысленные мутации, и необходимо выполнять вестерн-блоттинг, чтобы исключить нежелательные клоны. Для решения этой проблемы были разработаны новые плазмидныевекторы4. В этих векторах KanMX, маркер лекарственной устойчивости, расположен вне кадра ниже домена DB или AD. Маркерный ген становится в кадре с доменом DB или AD только тогда, когда в него вставлен интересующий ген. Когда случайная мутация (мутации) вводится в интересующий ген, нежелательные мутанты, такие как мутанты со сдвигом рамки считывания или нонсенс-мутациями, могут быть легко элиминированы путем отбора лекарственной устойчивости, а кандидаты, несущие желательные миссенс-мутации, могут быть легко идентифицированы спомощью скрининга Y2H4. В данной статье представлен протокол выделения мутантов с нулевым взаимодействием/поврежденных белков, представляющих интерес, с использованием этой стратегии.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA (8.0)</td>
			<td>Nacalai Tesque Inc.</td>
			<td>14347-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% SDS Solution</td>
			<td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td>
			<td>313-90275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td>
			<td>135-07522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Kishida Chemical Co. Ltd.</td>
			<td>110-64785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-&#946;-D-galactopyranoside (X-Gal)</td>
			<td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td>
			<td>021-07852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>AGR60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium</td>
			<td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td>
			<td>68-52-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HA-tag mAb-HRP-DirecT&#160;&#160;</td>
			<td>Medical &#38; Biological Laboratories Co. Ltd.</td>
			<td>M180-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA from salmon testes</td>
			<td>Merck KGaA.</td>
			<td>D1626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck KGaA.</td>
			<td>9-0770-4-4L-J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper for colony lift (Grade 50)</td>
			<td>Whatman, Cytiva</td>
			<td>1450-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper for colony lift (No.4A)</td>
			<td>Advantec Toyo Kaisha, Ltd.</td>
			<td>01411090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper for replicaplating (No.1)</td>
			<td>Advantec Toyo Kaisha, Ltd.</td>
			<td>00011150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-418 Sulfate</td>
			<td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td>
			<td>075-05962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Kishida Chemical Co. Ltd.</td>
			<td>230-37585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td>
			<td>163-03545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Acetate Dihydrate</td>
			<td>Nacalai Tesque Inc.</td>
			<td>20604-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#8226;7H2O</td>
			<td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td>
			<td>131-00405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#8226;12H2O</td>
			<td>Nacalai Tesque Inc.</td>
			<td>10039-32-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Nacalai Tesque Inc.</td>
			<td>31319-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#8226;2H2O</td>
			<td>Nacalai Tesque Inc.</td>
			<td>31717-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towel</td>
			<td>AS ONE Corp.</td>
			<td>7-6200-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1</td>
			<td>Nacalai Tesque Inc.</td>
			<td>25970-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNAs</td>
			<td>the National BioResource Project - yeast (https://yeast.nig.ac.jp/yeast/top.xhtml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid isolation Kit</td>
			<td>Nippon Genetics Co. Ltd.</td>
			<td>FG-90502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol #4,000</td>
			<td>Nacalai Tesque Inc.</td>
			<td>11574-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC double drop-out mix -Leu -Trp</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DSCK172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seamless cloning kit (In-Fusion assembly )</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>#639648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk powder</td>
			<td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td>
			<td>190-12865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin Sulfate</td>
			<td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td>
			<td>3810-74-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq polymerase (GoTaq Green Master Mixes)</td>
			<td>Promega Corp.</td>
			<td>M7122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS (hydroxymethyl) aminomethane</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>TRIS01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Nacalai Tesque Inc.</td>
			<td>12967-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>ThermoFisher scientific Inc.</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Nacalai Tesque Inc.</td>
			<td>35624-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>ThermoFisher scientific Inc.</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Nitrogen Base (YNB)</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>CYN0210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolyase 100T</td>
			<td>Nacalai Tesque Inc.</td>
			<td>07665-55</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating interaction-null&#47;impaired mutants using the yeast two-hybrid assay

Белок-белковые взаимодействия являются одним из самых основных процессов, лежащих в основе биологических явлений. Одним из самых простых и лучших способов понять роль и функцию (функции) конкретного белок-белкового взаимодействия является сравнение фенотипа дикого типа (с соответствующим белок-белковым взаимодействием) и тех мутантов, у которых отсутствует соответствующее взаимодействие. Поэтому, если таких мутантов удастся выделить, они помогут пролить свет на связанные с ними биологические процессы. Двухгибридная процедура дрожжей (Y2H) является мощным подходом не только к обнаружению белок-белковых взаимодействий, но и к выделению мутантов с нулевым взаимодействием. В данной статье представлен протокол для выделения мутантов с нулевым взаимодействием/ослабленных с использованием технологии Y2H. Во-первых, библиотека мутаций создается путем объединения полимеразной цепной реакции и эффективной технологии бесшовного клонирования, которая эффективно исключает пустой вектор из библиотеки. Во-вторых, мутанты с нулевым взаимодействием/поврежденные мутанты проверяются с помощью анализа Y2H. Из-за хитрости вектора Y2H нежелательные мутанты, такие как мутанты со сдвигом рамки считывания и нонсенс-мутациями, эффективно устраняются из процесса скрининга. Эта стратегия проста и поэтому может быть применена к любой комбинации белков, взаимодействие которых может быть обнаружено с помощью двухгибридной системы.

Interactions between biomolecules are the most basic part of biological phenomena. Protein-protein interactions constitute a significant part of such interactions. Therefore, identification of the interaction partner(s) of a protein of interest is critical to further elucidate the function of the protein/gene of interest. The yeast two-hybrid (Y2H) method is a popular technique to identify protein-protein interactions in vivo1. In this system, two proteins (X and Y) whose interaction is to be tested are fused to the DNA-binding (DB) domain and transcriptional activation domain (AD), respectively. The DB-X fusion protein binds to a recognition sequence of the DB domain; therefore, when proteins X and Y interact, the AD-Y fusion protein comes into the proximity of the recognition sequence. Consequently, transcription of the reporter gene downstream of the recognition sequence is activated. Therefore, the presence or absence of reporter gene activity can be used to determine the presence or absence of the protein-protein interaction1.
Once a specific interaction partner of the protein of interest is identified, further analyses should be performed to elucidate the biological function of the interaction. For this purpose, if mutants of the proteins that impair or remove the specific protein-protein interaction can be isolated, they will serve as powerful tools. The Y2H system can be used directly to isolate such mutants by screening 'interaction-negative' clones, starting with the wild-type 'interaction-positive' clone. To accelerate this process, 'reverse' Y2H (rY2H) systems were developed2,3. In rY2H systems, the host yeast strains harbor counter-selectable marker genes as reporter genes, meaning yeast cells grow only when the AD-Y and DB-X proteins do not interact.
Although both the Y2H and rY2H systems allow the isolation of interaction-negative mutants, the process of isolating the mutants is laborious because not all of the candidates obtained by screening carry the desired type of mutations (usually missense mutations). The most serious issue is that a significant fraction of candidates harbor frameshift or nonsense mutations, and it is necessary to perform western blotting to exclude undesired clones. To overcome this problem, new plasmid vectors have been developed4. In these vectors, KanMX, a drug resistance marker, is positioned out-of-frame downstream of the DB domain or AD. The marker gene becomes in-frame with the DB domain or AD only when the gene of interest is inserted. When a random mutation(s) is introduced in the gene of interest, undesirable mutants, such as those with frameshift or nonsense mutations, can be easily eliminated by performing drug resistance selection, and candidates carrying desirable missense mutations can be easily identified with the Y2H screen4. This article presents a protocol to isolate interaction-null/impaired mutants of a protein of interest using this strategy.

В центре внимания автора: Улучшенная изоляция мутантов Interaction-Null в дрожжах

Выделение мутантов Interaction-Null/Impairment с помощью двухгибридного анализа дрожжей

We are interested in understanding the regulatory mechanisms of the cell cycle in Eukaryotes, especially the relationship between DNA replication, stable germ maintenance, and cell proliferation. The progression of the cell cycle is regulated by cyclin-dependent kinases, or CDKs, in Eukaryotes. This is the case for the initiation of DNA replication.We have identified a way, on substrates of CDKs, to initiate DNA replication. To understand the function of the protein of your interest, a comparison of the wild-type and mutant is a direct and effective way. Yeast two-hybrid assay, being simple detection and will enhance the process of isolating interaction-null mutants.This will contribute to advancement of research in the field.

Недавно было обнаружено, что С-концевая половина белка Pol2 (Pol2-C) взаимодействует с Mcm10. Оба белка необходимы для инициации репликации ДНК и, следовательно, для роста клеток почковающихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae 13,14,15. Чтобы помочь понят...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Enhanced Isolation of Interaction-Null Mutants in Yeast at JoVE.com

Взаимодействия биомолекул, такие как белок-белковые взаимодействия, являются молекулярной основой биологических функций. Если можно изолировать мутантов с нулевым взаимодействием, у которых отсутствует соответствующее взаимодействие, это значительно поможет понять функцию (функции) этого взаимодействия. В этой статье представлен эффективный способ выделения мутантов с нулевым взаимодействием.

Protein-protein interactions are one of the most basic processes that underlie biological phenomena. One of the simplest and best ways to understand the ...

Мы заинтересованы в понимании регуляторных механизмов клеточного цикла у эукариот, особенно взаимосвязи между репликацией ДНК, поддержанием стабильного микроба и пролиферацией клеток. Прогрессирование клеточного цикла регулируется циклин-зависимыми киназами, или CDK, у эукариот. Это относится к инициации репликации ДНК.Мы определили способ инициирования репликации ДНК на субстратах CDK. Чтобы понять функцию интересующего вас белка, сравнение дикого типа и мутантного является прямым и эффективным способом. Двухгибридный анализ дрожжей, являясь простым обнаружением и улучшит процесс выделения взаимодействия-нулевого мутанта.Это будет способствовать продвижению исследований в этой области.

isolating-interaction-nullimpaired-mutants-using-yeast-two-hybrid

Research

JoVE Journal

Biology

Isolating Interaction-Null&#47;Impaired Mutants Using the Yeast Two-Hybrid Assay

293 Views.  Kochi University of Technology. Мы заинтересованы в понимании регуляторных механизмов клеточного цикла у эукариот, особенно взаимосвязи между репликацией ДНК, поддержанием стабильного микроба и пролиферацией клеток. Прогрессирование клеточного цикла регулируется циклин-зависимыми киназами, или CDK,...

Video: В центре внимания автора: Улучшенная изоляция мутантов Interaction-Null в дрожжах

Protein-protein interactions are one of the most basic processes that underlie biological phenomena. One of the simplest and best ways to understand the role(s) and function(s) of a specific protein-protein interaction is to compare the phenotype of the wild-type (with the relevant protein-protein interaction) and those of mutants that lack the relevant interaction. Therefore, if such mutants can be isolated, they will help to elucidate the related biological processes. The yeast two-hybrid (Y2H) procedure is a powerful approach not only to detect protein-protein interactions but also to isolate interaction-null/impaired mutants. In this article, a protocol is presented to isolate interaction-null/impaired mutants using Y2H technology. First, a mutation library is constructed by combining the polymerase chain reaction and efficient seamless cloning technology, which efficiently excludes the empty vector from the library. Second, interaction-null/impaired mutants are screened by the Y2H assay. Because of a trick in the Y2H vector, undesired mutants, such as those with frameshift and nonsense mutations, are efficiently eliminated from the screening process. This strategy is simple and can, therefore, be applied to any combination of proteins whose interaction can be detected by the two-hybrid system.

The interactions of biomolecules, such as protein-protein interactions, are the molecular basis of biological functions. If interaction-null/impaired mutants that specifically lack the relevant interaction can be isolated, they will greatly help to understand the function(s) of this interaction. This article presents an efficient way to isolate interaction-null/impaired mutants.

Employment of Two Hybrid Assay to Identify Interaction-Impaired Mutants in Yeast

To begin, obtain the host yeast strain, transformed with the bait plasmid. After introducing the mutant library into it, select a plate with 500 to 2000 colonies. Set two sheets of filter paper on a replica block and make several replicas of the plate, and incubate the plates at 30 degrees Celsius for one to two days.For the yeast two hybrid color assay, place a sheet of filter paper on the replica plate until it is completely moistened. Remove excess moisture using several sheets of paper towel, twice. Then, using tweezers, peel the filter paper off the plate from the edge and quickly immerse it in liquid nitrogen.Thaw the frozen filter paper on a dry paper towel with the colony side up. Once thawed, immediately transfer it onto another filter paper soaked with buffer. Cover the plastic tray containing the filter paper, put it into an airtight container, and incubate it at 37 degrees Celsius.Once blue color appears, place the filter paper on 500 microliters of stop solution taken in a plastic tray and immediately dry it on a fresh paper towel. The color assay produced blue or white dots, differentiating the mutants that did not interact with the bait.