نشكر الوكالة الحكومية للبحوث في إسبانيا على اعتماد مركز سيفيرو أوتشوا للتميز CEX2021-001136-S ، بتمويل من MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 ، و CIBERES ، وهي مبادرة من معهد الصحة كارلوس الثالث (ISCIII ، مدريد ، إسبانيا). كما نشكر المفوضية الأوروبية على مشروع GLYCOTWINNING .

تقنيات الرنين المغناطيسي النووي المتقدمة لتحليل تفاعل البروتين الغليكان

<ol>
	<li>Sol&#237;s, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+into+glycosciences:+How+chemistry,+biochemistry+and+biology+cooperate+to+crack+the+sugar+code.">A guide into glycosciences: How chemistry, biochemistry and biology cooperate to crack the sugar code.</a> Biochim Biophys Acta. 1850 (1), 186-235 (2015).</li><li>Poveda, A., Jimenez-Barbero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+studies+of+carbohydrate-protein+interactions+in+solution.">NMR studies of carbohydrate-protein interactions in solution.</a> Chem Soc Rev. 27, 133-144 (1998).</li><li>Kogelberg, H., Sol&#237;s, D., Jim&#233;nez-Barbero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+structural+insights+into+carbohydrate-protein+interactions+from+NMR+spectroscopy.">New structural insights into carbohydrate-protein interactions from NMR spectroscopy.</a> Curr Opin Struct Biol. 13 (5), 646-653 (2003).</li><li>Widmalm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycan+shape,+motions,+and+interactions+explored+by+NMR+spectroscopy.">Glycan shape, motions, and interactions explored by NMR spectroscopy.</a> JACS Au. 4 (1), 20-39 (2024).</li><li>Marchetti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=34;Rules+of+Engagement&amp;#34;+of+protein-glycoconjugate+interactions:+A+molecular+view+achievable+by+using+NMR+spectroscopy+and+molecular+modeling.">34;Rules of Engagement&amp;#34; of protein-glycoconjugate interactions: A molecular view achievable by using NMR spectroscopy and molecular modeling.</a> ChemistryOpen. 5 (4), 274-296 (2016).</li><li>Ard&#225;, A., Jim&#233;nez-Barbero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+recognition+of+glycans+by+protein+receptors.+Insights+from+NMR+spectroscopy.">The recognition of glycans by protein receptors. Insights from NMR spectroscopy.</a> Chem Commun. 54 (38), 4761-4769 (2018).</li><li>Gimeno, A., Valverde, P., Ard&#225;, A., Jim&#233;nez-Barbero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycan+structures+and+their+interactions+with+proteins.">Glycan structures and their interactions with proteins.</a> A NMR view. Curr Opin Struct Biol. 62, 22-30 (2020).</li><li>Ca&#241;ada, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+and+structural+characterization+of+carbohydrates+and+their+interactions+studied+by+NMR.">Conformational and structural characterization of carbohydrates and their interactions studied by NMR.</a> Curr Med Chem. 29 (7), 1147-1172 (2022).</li><li>Valverde, P., Quintana, J. I., Santos, J. I., Ard&#225;, A., Jim&#233;nez-Barbero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+NMR+avenues+to+explore+the+conformation+and+interactions+of+glycans.">Novel NMR avenues to explore the conformation and interactions of glycans.</a> ACS Omega. 4, 13618-13630 (2019).</li><li>Jim&#233;nez-Barbero, J., Asensio, J. L., Ca&#241;ada, F. J., Poveda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+and+protein-bound+carbohydrate+structures.">Free and protein-bound carbohydrate structures.</a> Curr Opin Struct Biol. 9 (5), 549-555 (1999).</li><li>Quintana, J. I., Atxabal, U., Unione, L., Ard&#225;, A., Jim&#233;nez-Barbero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+multivalent+carbohydrate-protein+interactions+by+NMR.">Exploring multivalent carbohydrate-protein interactions by NMR.</a> Chem Soc Rev. 52 (5), 1591-1613 (2023).</li><li>Rold&#243;s, V., Ca&#241;ada, F. J., Jim&#233;nez-Barbero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbohydrate-protein+interactions:+a+3D+view+by+NMR.">Carbohydrate-protein interactions: a 3D view by NMR.</a> Chembiochem. 12 (7), 990-1005 (2011).</li><li>Unione, L., Ard&#225;, A., Jim&#233;nez-Barbero, J., Millet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+of+glycoproteins:+profiling,+structure,+conformation,+and+interactions.">NMR of glycoproteins: profiling, structure, conformation, and interactions.</a> Curr Opin Struct Biol. 68, 9-17 (2021).</li><li>del Carmen Fern&#225;ndez-Alonso, M., D&#237;az, D., Berbis, M. A., Marcelo, F., Ca&#241;ada, J., Jim&#233;nez-Barbero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-carbohydrate+interactions+studied+by+NMR:+from+molecular+recognition+to+drug+design.">Protein-carbohydrate interactions studied by NMR: from molecular recognition to drug design.</a> Curr Protein Pept Sci. 13 (8), 816-830 (2012).</li><li>Angulo, J., Nieto, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STD-NMR:+application+to+transient+interactions+between+biomolecules-a+quantitative+approach.">STD-NMR: application to transient interactions between biomolecules-a quantitative approach.</a> Eur Biophys J. 40 (12), 1357-1369 (2012).</li><li>Mayer, M., Meyer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Group+epitope+mapping+by+saturation+transfer+difference+NMR+to+identify+segments+of+a+ligand+in+direct+contact+with+a+protein+receptor.">Group epitope mapping by saturation transfer difference NMR to identify segments of a ligand in direct contact with a protein receptor.</a> J Am Chem Soc. 123 (25), 6108-6117 (2001).</li><li>Williamson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+chemical+shift+perturbation+to+characterise+ligand+binding.">Using chemical shift perturbation to characterise ligand binding.</a> Prog Nucl Magn Reson Spectrosc. 73, 1-16 (2013).</li><li>Fern&#225;ndez, C., Adeishvili, K., W&#252;thrich, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transverse+relaxation-optimized+NMR+spectroscopy+with+the+outer+membrane+protein+OmpX+in+dihexanoyl+phosphatidylcholine+micelles.">Transverse relaxation-optimized NMR spectroscopy with the outer membrane protein OmpX in dihexanoyl phosphatidylcholine micelles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2358-2363 (2001).</li><li>Yee, A., Gutmanas, A., Arrowsmith, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+NMR+in+structural+genomics.">Solution NMR in structural genomics.</a> Curr Opin Struct Biol. 16 (5), 611-617 (2006).</li><li>Skinner, S. P., Fogh, R. H., Boucher, W., Ragan, T. J., Mureddu, L. G., Vuister, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCPNMR+AnalysisAssign:+a+flexible+platform+for+integrated+NMR+analysis.">CCPNMR AnalysisAssign: a flexible platform for integrated NMR analysis.</a> J Biomol NMR. 66 (2), 111-124 (2016).</li><li>Gimeno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimizing+the+entropy+penalty+for+ligand+binding:+Lessons+from+the+molecular+recognition+of+the+histo+blood-group+antigens+by+human+Galectin-3.">Minimizing the entropy penalty for ligand binding: Lessons from the molecular recognition of the histo blood-group antigens by human Galectin-3.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 58 (22), 7268-7272 (2019).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

أصبح فرق نقل التشبع NMR (STD-NMR) أكثر طرق الرنين المغناطيسي النووي استخداما وتنوعا لدراسة تفاعلات بروتين الليجند. كما هو موضح أعلاه ، فإنه يعتمد على ظاهرة نقل التشبع ، ويتضمن الإعداد التجريبي الحصول على اثنين من الأطياف أحادية البعد (1D) 1H: أطياف الرنين ¬ و ¬ خارج الرنين. أثناء تجربة الرنين ، يتم تحقيق تشبع بروتونات معينة من البروتين عن طريق تطبيق قطار من نبضات الترددات الراديوية منخفضة الطاقة خلال فترة معينة (يتراوح وقت التشبع عادة من 1-3 ثوان). لتجنب التشبع المباشر لليجند ، يتم تحسين تواتر وطول نبضات التشبع لتشعيع بروتونات معينة من البروتين بشكل انتقائي ؛ أي أنه يجب تطبيقها على تردد شاغر لأي إشارات ليجند وبطول مناسب (الشكل 1). كقاعدة عامة لنبضات تشبع 50 مللي ثانية ، يجب الحفاظ على فرق 1 جزء في المليون من منطقة التشبع إلى أقرب إشارات اليجند. بشكل عام ، توفر نبضات التشبع الانتقائية المطبقة على المنطقة الأليفاتية للبروتين تأثيرات تشبع متزايدة. بدلا من ذلك ، يمكن أيضا تشعيع البروتونات العطرية (6-7 جزء في المليون) إذا كان جزيء الربيطة لا يحتوي على أي إشارات عطرية. هذا مفيد جدا للجليكان الذي يحدث بشكل طبيعي ، لأنها لا تحمل مجموعات عطرية. بمجرد تشعيع منطقة معينة من البروتين بشكل انتقائي ، ينتشر التشبع على طول البروتين عبر الاسترخاء المتقاطع ثنائي القطب 1 H-1 H-1H (انتشار الدوران). في النهاية ، يصل التشبع إلى بروتونات البروتين في موقع الارتباط ، والذي يتم نقله بعد ذلك إلى بروتونات السكر التي تكون على اتصال وثيق (r < 5 Å) مع المستقبل عبر 1 H-1 H-1H NOEs بين الجزيئات. من الواضح أن شدة إشارات بروتونات الليجند المشبعة تتناقص. بعد تلقي التشبع ، بسبب حركية الربط ، تنفصل الروابط المرتبطة بشكل عابر (التبادل السريع مطلوب) وتتراكم معلومات التشبع في الحالة الحرة. بسبب هذه العملية ، تقدم أطياف الرنين المغناطيسي النووي إشارات متناقصة (الشكل 2).
لإظهار هذا الاضطراب الشديد بوضوح لنوى 1H من جليكان ملزم ، يتم الحصول على طيف التحكم في البروتون NMR (خارج الرنين) حيث يتم تطبيق التشبع بعيدا عن أي مستقبلات أو إشارة كربوهيدرات (عادة بين 40-100 جزء في المليون) ، في ظل نفس الظروف. يظهر الطيف 1D المطروح بين الرنين والرنين حصريا إشارات نوى 1H من الربيطة التي عدلت شدتها: تلك التي كانت قريبة بما يكفي من موقع ربط المستقبلات لتلقي المغنطة (الشكل 2).
ومع ذلك ، لا تتلقى جميع نوى 1H من الكربوهيدرات المرتبطة نفس الكمية من التشبع. من الناحية النظرية ، يعتمد نقل المغنطة من المستقبل إلى الربيطة المرتبطة على المسافة (1 / r6). هذا يعني أن شدة التشبع المنقول بين نوى الجليكان 1H تحتوي على معلومات حول القرب المكاني بين بروتونات الربيطة وبروتونات المستقبل ، وشدة الرنين المغناطيسي النووي STD أكبر لتلك البروتونات الأقرب إلى المستقبل. وفقا لذلك ، تسمح تجربة الرنين المغناطيسي النووي STD أيضا بتحديد حاتمة الربط للكربوهيدرات (الشكل 2 والشكل 3) لأن بروتونات الرباط التي تجلس بالقرب من سطح البروتين تظهر كثافة أعلى من تلك التي لا تشارك مباشرة في الربط.
يمكن تطبيق التجربة على الأنظمة ذات التقارب الضعيف المتوسط ، ونادرا ما يتم تطبيقها على الأنظمة ذات الصلات القوية في النطاق المنخفض μM أو nM. في الواقع ، يتطلب أن يكون معدل التفكك سريعا في مقياس وقت الاسترخاء. خلاف ذلك ، يتم فقدان معلومات نقل التشبع من خلال الاسترخاء قبل أن ينفصل الرباط.
من ناحية أخرى ، تعد تجارب الرنين المغناطيسي النووي القائمة على البروتين فريدة من نوعها لكشف تفاعل بروتين الليجند بدقة مستوى الأحماض الأمينية دون حل هياكل الدقة الذرية. يفحص مباشرة ظواهر التعرف الجزيئي في المحلول دون الحاجة إلى التبلور المشترك. يعد رسم خرائط تحليل الطاقة الشمسية المركزة قويا بشكل استثنائي لاكتشاف الروابط ورسم خرائط موقع ارتباط البروتين (الشكل 4 والشكل 5). تنطبق هذه الطريقة على أي نطاق من الصلات بين نطاق mM و nM ، حتى بالنسبة للأنظمة التي يكون فيها سعر الصرف بطيئا في مقياس وقت التحول الكيميائي21.
ومع ذلك ، من المحتمل ألا يعمل هذا النهج مع البروتينات ذات الأوزان الجزيئية التي تزيد عن 30-40 كيلو دالتون بسبب مشاكل الاسترخاء. يمكن بعد ذلك استخدام بديل TROSY18 ، حيث يكون قويا بشكل خاص عندما يقترن بتثنية البروتين. علاوة على ذلك ، يجب تسمية البروتين بشكل موحد ب 15N (وعينة أخرى تحمل علامة مزدوجة ب 13C و 15N لتتمكن من إكمال تعيين العمود الفقري المطلوب). لذلك ، يجب تحسين ظروف التعبير عن البروتين ، بما في ذلك نظام التعبير المقابل لتتمكن من الحصول على كميات ملليغرام من البروتين. البروتينات التي تظهر ميلا إلى قلة القلة، أو التجميع، ليست مناسبة أيضا لهذا التحليل. الأداة المستخدمة هنا لتسجيل بيانات الرنين المغناطيسي النووي هي مطياف Bruker 800 MHz مجهز بمسبار تبريد TCI. سيكون من الصعب للغاية استخدام هذه المنهجية باستخدام أدوات أقل من MHz 600 أو بدون مسبار مبرد.

يعد التعرف الجزيئي على الجليكان أمرا ضروريا للعديد من العمليات المتعلقة بالصحة والمرض. تعتمد خصوصية وانتقائية المستقبلات البيولوجية (المحاضرات والأجسام المضادة والإنزيمات) للجليكان بشكل كبير على ضبط التوازن غير المستقر بين المكونات المتنوعة للمحتوى الحراري (CH-π و van der Waals ، روابط الهيدروجين ، الكهرباء الساكنة) والانتروبيا (الكارهة للماء ، الديناميات ، الذوبان الذوبان)1.
نظرا للتنوع الكيميائي الكبير والطبيعة الديناميكية للجليكان ، فقد تم استخدام طرق الرنين المغناطيسي النووي على نطاق واسع لتشريح تفاعلات الجليكان لأكثر من 25 عاما2 ، نظرا لأن هذه المنهجيات توفر معلومات رائعة عن أحداث التعرف الجزيئي بتفاصيل دقيقة ، بدقةذرية 3,4 ، حتى عندما لا يمكن استرداد دليل التفاعل المطلوب باستخدام منهجيات أخرى. كنقطة أساسية ، فإن الرنين المغناطيسي النووي متعدد الاستخدامات ويسمح بدراسة الأحداث الديناميكية ، على المستوى الذري ، على نطاقات زمنية مختلفة ، مما يشكل أفضل تقنية حتى الآن لدراسة بنية وتشكيل وديناميكيات الجليكان في المحلول. ومع ذلك ، قد يكون فك تشابك هذه المعلومات عملية معقدة إلى حد ما تتطلب استخدام استراتيجيات محددة جيدا جنبا إلى جنب مع تحليل دقيق للبيانات5.
تقنيات الرنين المغناطيسي النووي متنوعة ، وفي الواقع ، هناك العديد من المنهجيات التي يمكن استخدامها لكشف تفاعلات البروتين الغليكان6. نصف هنا نهجين أساسيين للرنين المغناطيسي النووي يستخدمان حاليا لفك تشفير تفاعلات مستقبلات الجليكان 7,8 ، مع التركيز على كيفية فك تشابك عرض حاتمة الجليكان الرئيسية بالإضافة إلى موقع ربط البروتين9.
في أي حدث التعرف الجزيئي ، عندما يرتبط مستقبل برابط معين ، هناك عملية تبادل كيميائي تؤثر على العديد من معلمات الرنين المغناطيسي النووي للمشاركين في الارتباط10. لذلك ، من منظور الرنين المغناطيسي النووي ، يمكن مراقبة التفاعل إما من وجهة نظر ليجند الجليكان أو من وجهة نظر مستقبل البروتين11. بشكل عام ، مستقبل البروتين هو جزيء حيوي كبير (حركة دورانية بطيئة ، مع معدلات في المقياس الزمني ns ، وبالتالي ، استرخاء عرضي سريع) ، في حين يمكن اعتبار الجليكان المتفاعل جزيئا صغيرا ومتوسط الحجم (حركة دورانية سريعة ، مع معدلات في المقياس الزمني ps ، والاسترخاء المستعرض البطيء)12. من منظور قياسي ، تكون إشارات الرنين المغناطيسي النووي للجليكان ضيقة ، في حين أن إشارات المستقبل واسعة13.
تعتمد طرق الرنين المغناطيسي النووي القائمة على الليجند على التغيير الدراماتيكي الذي تتعرض له العديد من معلمات الرنين المغناطيسي النووي الجليكان عند الانتقال من الحالة الحرة إلى الحالةالمقيدة 14. STD-NMR هي تقنية الرنين المغناطيسي النووي التجريبية الأكثر استخداما لتقييم ميزات ربط الجليكان المتنوعة15 ، من استنتاج وجود الارتباط في حالة المحلول إلى تحديد حاتم ربط الجليكان. أي ذرات الرباط التي تتلامس مع مستقبلات البروتين16.
بدلا من ذلك ، تراقب طرق الرنين المغناطيسي النووي القائمة على المستقبلات التغييرات التي تحدث في إشارات مستقبلات البروتين في وجود الجليكان فيما يتعلق بتلك المسجلة لحالة apo17. تركز هذه بشكل أساسي على فحص اضطرابات التحول الكيميائي لإشارات البروتين بين الحالتين. التجربة الأكثر استخداما هي 1 H-15N HSQC ، أو بدائلها TROSY18.
يسمح الجمع بين كلا النهجين بتطبيق الرنين المغناطيسي النووي على العديد من الأنظمة المتنوعة التي تعرض مجموعة واسعة من التقاربات. ومع ذلك ، بالنسبة لطرق الرنين المغناطيسي النووي القائمة على المستقبلات ، على عكس تلك القائمة على الرباط ، يجب أن تتوفر كمية كبيرة نسبيا من البروتين القابل للذوبان وغير المجمع والمستقر الموسوم بالنظائر (15N).
نصف هنا كلتا الطريقتين ، ونسلط الضوء على نقاط القوة والضعف لديهما. لاحظ أن الخطوات الأساسية الموضحة في البروتوكول تعمل كأمثلة لاستخدام مطياف بروكر. وبالتالي ، تتوافق أسماء الأوامر والمعلمات مع تلك المستخدمة في TopSpin (برنامج التحكم في مطياف Bruker).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mm Shigemi microtube set mat</td>
			<td>CortecNet SAS</td>
			<td>S30BMS-005B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-Lactose-Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich Qu&#237;mica S.L.</td>
			<td>7634-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride (15 N, 99%)</td>
			<td>LC-0179-N-50G</td>
			<td>Tracer Tecnolog&#237;as Anal&#237;ticas S.L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin (Sodium Salt)&#160;</td>
			<td>Melford Laboratories LTD</td>
			<td>A40040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIOVIA Discovery studio&#160;</td>
			<td>BIOVIA, Dassault Syst&#232;mes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3) Chemically Competent Cells&#160;</td>
			<td>Merck Life Science, S.L.U.</td>
			<td>CMC0014-40X40UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra X-22R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2O&#160;</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc.</td>
			<td>DLM-4-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Innova 42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (Isopropyl &#223;-D-1-thiogalactopyranoside)</td>
			<td>VWR International Eurolab S.L.</td>
			<td>VW437144N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LacNAc</td>
			<td>Elicityl</td>
			<td>GLY008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani (LB) Broth</td>
			<td>Merck Life Science, S.L.U.</td>
			<td>3397-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matraz Erlenmeyer B N 5000 CC&#160;</td>
			<td>VWR International Eurolab S.L.</td>
			<td>214-1137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyMOL</td>
			<td>PyMOL Molecular Graphics System</td>
			<td>Version 2.0 Schr&#246;dinger</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Sonics &#38; Materials, Inc.</td>
			<td>VC 505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superconducting NMR magnet</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>600 MHz AVANCE III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superconducting NMR magnet</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>800 MHz AVANCE III</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

disentangling glycan-protein interactions: nuclear magnetic resonance (nmr) to the rescue

تفاعلات الجليكان مع البروتينات تعدل العديد من الأحداث المتعلقة بالصحة والمرض. في الواقع ، يرتبط إنشاء أحداث التعرف هذه وعواقبها البيولوجية ارتباطا وثيقا بالهياكل ثلاثية الأبعاد لكلا الشريكين ، وكذلك بخصائصها الديناميكية وعرضها على مقصورات الخلايا المقابلة. تعتبر تقنيات الرنين المغناطيسي النووي فريدة من نوعها لفصل هذه الخصائص ، وفي الواقع ، تم تطوير منهجيات متنوعة قائمة على الرنين المغناطيسي النووي وتطبيقها لمراقبة أحداث ارتباط الجليكان مع المستقبلات المرتبطة بها. يحدد هذا البروتوكول إجراءات الحصول على اثنتين من أقوى منهجيات الرنين المغناطيسي النووي المستخدمة في مجال البيولوجيا السكرية بالرنين المغناطيسي النووي ومعالجتها وتحليلها ، 1H-Saturation Transfer Difference (STD) و 1H ، 15N-Heterocore أحادي التماسك الكمي (HSQC) تجارب المعايرة ، والتي تقدم معلومات مكملة من منظور الجليكان والبروتين ، على التوالي. في الواقع ، عند دمجها ، فإنها توفر مجموعة أدوات قوية لتوضيح الجوانب الهيكلية والديناميكية لعمليات التعرف الجزيئي. يعزز هذا النهج الشامل فهمنا لتفاعلات البروتين الغليكان ويساهم في تطوير البحث في مجال علم الأحياء السكرية الكيميائي.

Molecular recognition of glycans is essential for many processes related to health and disease. The specificity and selectivity of biological receptors (lectins, antibodies, enzymes) for glycans heavily depend on adjusting the precarious balance between the diverse components of enthalpy (CH-&#960; and van der Waals, hydrogen bonds, electrostatics) and entropy (hydrophobicity, dynamics, solvation-desolvation)1.
Given the large chemical diversity and dynamic nature of glycans, NMR methods have been widely employed to dissect glycan interactions for more than 25 years2, since these methodologies afford superb information on molecular recognition events with precise details, at atomic resolution3,4, even when the required interaction evidence cannot be retrieved by employing other methodologies. As key point, NMR is versatile and allows studying dynamic events, at the atomic level, at different time scales, constituting the best technique by far for studying the structure, conformation, and dynamics of glycans in solution. Nevertheless, disentangling this information may be a rather complex process that requires the employment of well-defined strategies together with careful data analysis5.
NMR techniques are diverse and, indeed, there are many methodologies that can be employed to unravel glycan-protein interactions6. We herein describe two basic NMR approaches that are currently employed to decipher glycan-receptor interactions7,8, making emphasis on how to untangle the presentation of the key glycan epitope as well as the protein binding site9.
In any molecular recognition event, when a receptor binds to a given ligand, there is a chemical exchange process that affects many NMR parameters of the participants in the binding10. Therefore, from the NMR perspective, the interaction can be monitored either from the point of view of the glycan ligand or from that of the protein receptor11. Generally speaking, the protein receptor is a large biomolecule (slow rotational motion, with rates in the ns timescale, and therefore, fast transverse relaxation), while the interacting glycan can be considered as a small-medium size molecule (fast rotational motion, with rates in the ps timescale, and slow transverse relaxation)12. From a standard perspective, the NMR signals of the glycan are narrow, while those of the receptor are broad13.
Ligand-based NMR methods rely on the dramatic change that many glycan NMR parameters experience when passing from the free to the bound state14. STD-NMR is the most employed experimental NMR technique to assess diverse glycan binding features15, from deducing the existence of binding in the solution state to the determination of the glycan binding epitope; that is, the atoms of the ligand that are in contact with the protein receptor16.
Alternatively, receptor-based NMR methods monitor the changes that take place in the signals of the protein receptor in the presence of the glycan with respect to those recorded for the apo state17. These are mainly focused on screening the chemical shift perturbations of the protein signals between both states. The most commonly employed experiment is 1H-15N HSQC, or its TROSY alternatives18.
The combination of both approaches allows applying NMR to many diverse systems that display a wide range of affinities. However, for the receptor-based NMR methods, in contrast to those based on the ligand, a relatively large amount of soluble, non-aggregated, stable isotope-labelled (15N) protein must be available.
We herein describe both methods, highlighting their strengths, and weaknesses. Note that the basic steps described in the protocol serve as examples for the use of Bruker spectrometers. Consequently, commands and parameters names align with those utilized in TopSpin (Bruker&#39;s spectrometers control software).

تسليط الضوء على المؤلف: كشف النقاب عن الجوانب الهيكلية والديناميكية للتعرف الجزيئي على الجليكان

فك تشابك تفاعلات بروتين الجليكان: الرنين المغناطيسي النووي (NMR) للإنقاذ

Our research delves into the study of diverse glycan lectin systems, exploring their connections to health and disease. We merged methodologies from chemistry, biology, and biomedicine to deeply investigate the roles in immune responses to pathologists from cancer to bacterial and viral infections. Recently, glyco sciences have marked groundbreaking milestones by transforming glycan design, synthesis and analysis of a structural molecular recognition aspects from the atomic to the cell level.These advances collectively set the stage for fluorescent or advanced glycan-based therapies. This protocol outlines the procedures for acquiring, processing, and analyzing two of the most powerful NMR methodologies employed in the glycan field. These methodologies, saturation transfer difference, and chemical safe perturbation analysis complimentarily offer precise information of the structural and dynamic aspects of molecular recognition of lichens.

هنا ، نقدم بروتوكولا لاستغلال 1H-STD NMR و 1 H-15N HSQC لكشف تفاصيل التفاعل الملزم بين المحاضرات والسكريات قليلة السكاريد الصغيرة. يتم تضمين النتائج التي تم الحصول عليها في تحليل التعرف الجزيئي ل LacNAc بواسطة hGalectin-7 (hGal-7) ، لتكون بمثابة مثال توضيحي للتنفيذ الناجح للبروتوكول وفعالية منهجيات الرنين المغناطيسي النووي هذه لدراسة التفاصيل الدقيقة لعملية التعرف الجزيئي. يوضح الشكل 3 طيف الرنين المغناطيسي النووي 1H-STD لتفاعل LacNAc مع hGal-7. يشير وجود إشارات الرنين المغناطيسي النووي STD إلى الارتباط (الشكل 3 أ). علاوة على ذلك ، تظهر فقط تلك الإشارات التي تنتمي إلى البروتونات على اتصال وثيق بالبروتين ، مما يسمح بتحديد حاتم الربط (الشكل 3 ب). يوضح الشكل 4 كيف يمكن استخدام طيف 1 H-15N HSQC للبروتين كبصمة له ، ويوضح الشكل 5 تطبيق 1 H-15N تجارب معايرة التماسك الكمي أحادي النواة غير المتجانسة (HSQC) لتحديد اضطراب التحول الكيميائي لمجموعات أميد العمود الفقري hGalectin-7 عند ارتباط LacNAc. لا تكشف هذه البيانات عن وجود تفاعل فحسب ، بل تحدد أيضا واجهة ربط الليكتين. يوضح الشكل 6 كيف يتيح تحليل بيانات المعايرة بالتحليل الحجمي تقدير تقارب الارتباط ل LacNAc بواسطة hGalectin-7 ، والذي يقع في النطاق الدقيق العالي. وتتفق هذه النتيجة مع النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام تقنيات بديلة.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66530/66530fig01.jpg"> الشكل 1: اختيار تردد الرنين. 1طيف H-NMR من LacNAc: hGal-7 نسبة 50: 1 في محلول ملحي مخزن بالفوسفات عند الرقم الهيدروجيني 7.4. إشارات الربيطة (LacNAc) محصورة في المنطقة بين 2.0-5.2 جزء في المليون. يتم اختيار تردد التشبع بعناية لضمان عدم وجود بروتونات ليجند ضمن نطاق 1-2 جزء في المليون ، مما يسمح بالإشعاع الانتقائي لبروتونات البروتين. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66530/66530fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66530/66530fig02.jpg"> الشكل 2: تجربة الرنين المغناطيسي النووي للأمراض المنقولة جنسيا. التمثيل التخطيطي لتجربة الأمراض المنقولة جنسيا: يعمل الطيف الأول (خارج الرنين) كمرجع بينما في الثاني (على الرنين) ، يتم إجراء تشبع البروتين. يتم نشر التشبع بكفاءة عبر البروتين بأكمله ونقله إلى بروتونات الليجند على اتصال وثيق بالبروتين. طيف الفرق الناتج (طيف الأمراض المنقولة جنسيا) ينتج فقط تلك الرنين التي شهدت التشبع. يسمح تحليل تجربة الأمراض المنقولة بالاتصال الجنسي برسم خرائط خاتمة للسكر الملزم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66530/66530fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66530/66530fig03.jpg"> الشكل 3: تحليل ملزم من منظور الرباط. (أ) تراكب أطياف الرنين المتقطع و 1H STD-NMR لتفاعل LacNAc مع hGal-7. في طيف الأمراض المنقولة جنسيا ، تظهر فقط تلك الإشارات التي تنتمي إلى البروتونات على اتصال وثيق بالبروتين. تم الإبلاغ عن التعليق التوضيحي لرنين 1H لليجند في الطيف خارج الرنين. (ب) تم تلوين الشدة النسبية للأمراض المنقولة جنسيا في التركيب الكيميائي ل LacNAc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66530/66530fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66530/66530fig04.jpg"> الشكل 4: يمثل طيف 1 H-15N HSQC للبروتين بصمته. (أ) طيف 1 H-15N HSQC من 100 ميكرومتر من hGal-7 في شكل apo. تم تسجيل الطيف عند 25 درجة مئوية. تم شرح بعض قمم NH المتقاطعة بتسمية الأحماض الأمينية المقابلة لها. (ب) يعرض كل زوج NH تحولا كيميائيا فريدا يعتمد على البيئة الكيميائية وبالتالي على بنية 3D للبروتين. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66530/66530fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66530/66530fig05.jpg"> الشكل 5: تحليل ملزم من منظور البروتين. (أ) يظهر تراكب أطياف H-15N HSQC 1 المسجلة لمعايرة LacNAc إلى محلول hGal-7. يشير فحص الأطياف ، حيث تشهد العديد من القمم المتقاطعة تغيرات في التحول الكيميائي ، بوضوح إلى التفاعل. (B) مخطط أقصى اضطرابات التحول الكيميائي (maxCSP) لإشارات أميد العمود الفقري المستنبطة من معايرة LacNAc (15 مكافئا) مع hGal-7. (ج) يتم تعيين الأحماض الأمينية الأكثر اضطرابا في hGal-7 ، وفقا لتحليل CSP في هيكل PDB 5gal. في النموذج ثلاثي الأبعاد ، يشير اللون الأحمر إلى قيمة CSP التي تزيد عن 2σ ، في حين أن اللون الوردي إلى قيم تتراوح بين 1σ و 2σ. من المحتمل أن تمثل المنطقة الملونة موقع الارتباط. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66530/66530fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66530/66530fig06.jpg"> الشكل 6: تحديد KD بناء على 1 H-15N HSQC تجارب المعايرة. (أ) تمثيل نمط المعايرة بالتحليل الحجمي 1 H-15N HSQC اعتمادا على معدل التبادل الكيميائي في المقياس الزمني للرنين المغناطيسي النووي للنظام في الدراسة (سريع أو متوسط أو بطيء). لوحظ نظام تبادل سريع في حالة تفاعل LacNAc / hGal-7. (ب) منحنى التركيب وتقدير KD الذي تم الحصول عليه من تحليل CSP بتركيزات مختلفة من الرباط للنظام النموذجي ل hGal-7 و LacNAc disaccharide. يتم الإبلاغ عن KD المقدر مع الخطأ المقابل كمتوسط للبيانات ل 20 من الأحماض الأمينية المختلفة ؛ (C) مقتطفات من أطياف 1 H,15N-HSQC تعرض إزاحة قمم متقاطعة مختارة أثناء المعايرة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66530/66530fig06large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

هنا ، نقدم بروتوكولا يوضح بالتفصيل اكتساب ومعالجة وتحليل سلسلة من تجارب الرنين المغناطيسي النووي التي تهدف إلى توصيف تفاعلات البروتين والجليكان في المحلول. تم تحديد المنهجيات الأكثر شيوعا القائمة على الليجند والبروتين ، والتي تساهم بلا شك في مجالات علم الأحياء السكري الهيكلي ودراسات التعرف الجزيئي.

The interactions of glycans with proteins modulate many events related to health and disease. In fact, the establishment of these recognition events and ...

يتعمق بحثنا في دراسة أنظمة الليكتين الغليكان المتنوعة ، واستكشاف صلاتها بالصحة والمرض. قمنا بدمج منهجيات من الكيمياء والبيولوجيا والطب الحيوي للتحقيق بعمق في الأدوار في الاستجابات المناعية لأخصائيي علم الأمراض من السرطان إلى الالتهابات البكتيرية والفيروسية. في الآونة الأخيرة ، تميزت علوم الجليكو بمعالم رائدة من خلال تحويل تصميم الجليكان والتوليف وتحليل جوانب التعرف الجزيئي الهيكلي من المستوى الذري إلى مستوى الخلية.هذه التطورات مجتمعة تمهد الطريق للعلاجات الفلورية أو المتقدمة القائمة على الجليكان. يحدد هذا البروتوكول إجراءات الحصول على اثنين من أقوى منهجيات الرنين المغناطيسي النووي المستخدمة في مجال الجليكان ومعالجتها وتحليلها. تقدم هذه المنهجيات وفرق نقل التشبع وتحليل الاضطراب الآمن الكيميائي معلومات دقيقة عن الجوانب الهيكلية والديناميكية للتعرف الجزيئي على الأشنات.

disentangling-glycan-protein-interactions-nuclear-magnetic-resonance

Research

JoVE Journal

Chemistry

Disentangling Glycan-Protein Interactions: Nuclear Magnetic Resonance (NMR) to the Rescue

574 Views.  CIC bioGUNE, Basque Research and Technology Alliance (BRTA). يتعمق بحثنا في دراسة أنظمة الليكتين الغليكان المتنوعة ، واستكشاف صلاتها بالصحة والمرض. قمنا بدمج منهجيات من الكيمياء والبيولوجيا والطب الحيوي للتحقيق بعمق في الأدوار في الاستجابات المناعية لأخصائيي علم الأمراض من السرطان إلى الالتهابات البكتيرية والفيروسية. في الآونة ا...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: كشف النقاب عن الجوانب الهيكلية والديناميكية للتعرف الجزيئي على الجليكان

The interactions of glycans with proteins modulate many events related to health and disease. In fact, the establishment of these recognition events and their biological consequences are intimately related to the three-dimensional structures of both partners, as well as to their dynamic features and their presentation on the corresponding cell compartments. NMR techniques are unique to disentangle these characteristics and, indeed, diverse NMR-based methodologies have been developed and applied to monitor the binding events of glycans with their associate receptors. This protocol outlines the procedures to acquire, process and analyze two of the most powerful NMR methodologies employed in the NMR-glycobiology field, 1H-Saturation transfer difference (STD) and 1H,15N-Heteronuclear single quantum coherence (HSQC) titration experiments, which complementarily offer information from the glycan and protein perspective, respectively. Indeed, when combined they offer a powerful toolkit for elucidating both the structural and dynamic aspects of molecular recognition processes. This comprehensive approach enhances our understanding of glycan-protein interactions and contributes to advancing research in the chemical glycobiology field.

Here, we present a protocol detailing the acquisition, processing, and analysis of a series of NMR experiments aimed at characterizing protein-glycan interactions in solution. Most common ligand-based and protein-based methodologies are outlined, which undoubtedly contribute to the fields of structural glycobiology and molecular recognition studies.

Acquisition, Processing, and Analysis of 1H-Saturation Transfer Difference (STD) NMR to Characterize Protein-Glycan Interactions

Begin by preparing a sample with a protein-ligand complex. Then, using a pipette, carefully transfer 0.6 milliliters of the prepared solution into a five milliliter NMR tube. To set up the NMR instrument to the required temperature, use the EDT command to open the temperature control monitor and adjust the desired temperature.Then, place the sample at the sample changer. Use an autosampler to insert the sample into the magnet and run the command sx, followed by the position number, N, corresponding to the position of the NMR tube in the autosampler tray. After this, the sample enters the NMR magnet.To lock on the solvent signal, type the lock command and select the appropriate solvent from the menu. Use either the automatic module, atma, or the manual module, atmm, to complete the tuning and matching process. Now, using the topshim command, start the automatic shimming, then execute the pulsecal command to determine the proton 90 degree pulse.After that, create a new data set and upload the STD NMR pulse sequence. Define the off and on resonance frequencies for the STD NMR experiment under the FQLIST entry in the ACQUPARS window. Set the off resonance frequency in a region without any ligand or protein proton signals.Then, choose an on resonance frequency in a spectral region devoid of glycan signals. Define the shaped pulse to be used during the saturation time in the ACQUPARS parameters of the ASED window. Afterwards, set the proton 90 degree pulse length, adjust the total saturation time and the relaxation delay to three seconds.Set the number of scans to a multiple of eight and dummy scans to eight. Then, set the number of points in F2 to 16K, 32K, or 64K, and an F1 to two. Now, using the automatic command rga, set the receiver gain to avoid overflow.Calculate the total experiment time using the experiment command. Finally, use the zg command to send the experiment for acquisition. After the experiment, perform the Fourier transform of the first FID, and select the destination of the processed spectra.Then, using the lb command, adjust the line broadening factor. To manually phase the spectrum, access the process tab, and then the adjust phase sub-menu. Click and drag on the corresponding button to perform zero and first order corrections and save the phasing results.After performing the Fourier transform for the second experiment, save the processed spectrum with a different code. Load the two processed spectra with the multiple functions, and, using the subtraction button available in the multiple visualization, subtract them. Then, open the off resonance spectrum and execute the MD command to initiate the multiple display window.Subsequently, upload the STD spectrum. Next, conduct a comparative analysis of the frequencies and intensities of the signals present in the STD NMR spectrum. In the off resonance experiment, measure the signal intensities.Navigate through the menu to select process, and then integrate. Carefully define the regions of interest and record the integrals in a file. Similarly, measure the intensities in the STD NMR experiment, ensuring that identical parameters are used, and document these integrals in a separate file.Alternatively, STD values can be determined by comparing signal intensities between the STD and off resonance spectra. To calculate the relative STD as a percentage, assign a 100%value to the proton exhibiting the maximum STD intensity. The proton STD NMR spectrum for the interaction of N-acetyl lactose amine, with human galectin 7, showed STD NMR signals indicating binding.Moreover, signals belonging to protons in close contact with the protein showed up, allowing delineation of the binding epitope.

اكتساب ومعالجة وتحليل 1H-Saturation Transfer Difference (STD) NMR لتوصيف تفاعلات البروتين والجليكان

15N-Heteronuclear Single Quantum Coherence (HSQC) Titration Experiments to Monitor the Chemical Shifts of the 1H and 15N NMR Resonances