אנו מודים Agencia Estatal de Investigación של ספרד עבור Severo Ochoa Center of Excellence Accreditation CEX2021-001136-S, במימון MCIN/AEI/10.13039/ 501100011033, ו- CIBERES, יוזמה של Instituto de Salud Carlos III (ISCIII, מדריד, ספרד). אנו מודים גם לנציבות האירופית על פרויקט GLYCOTWIN.

טכניקות NMR מתקדמות לניתוח אינטראקציה בין גליקן לחלבון

<ol>
	<li>Sol&#237;s, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+into+glycosciences:+How+chemistry,+biochemistry+and+biology+cooperate+to+crack+the+sugar+code.">A guide into glycosciences: How chemistry, biochemistry and biology cooperate to crack the sugar code.</a> Biochim Biophys Acta. 1850 (1), 186-235 (2015).</li><li>Poveda, A., Jimenez-Barbero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+studies+of+carbohydrate-protein+interactions+in+solution.">NMR studies of carbohydrate-protein interactions in solution.</a> Chem Soc Rev. 27, 133-144 (1998).</li><li>Kogelberg, H., Sol&#237;s, D., Jim&#233;nez-Barbero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+structural+insights+into+carbohydrate-protein+interactions+from+NMR+spectroscopy.">New structural insights into carbohydrate-protein interactions from NMR spectroscopy.</a> Curr Opin Struct Biol. 13 (5), 646-653 (2003).</li><li>Widmalm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycan+shape,+motions,+and+interactions+explored+by+NMR+spectroscopy.">Glycan shape, motions, and interactions explored by NMR spectroscopy.</a> JACS Au. 4 (1), 20-39 (2024).</li><li>Marchetti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=34;Rules+of+Engagement&amp;#34;+of+protein-glycoconjugate+interactions:+A+molecular+view+achievable+by+using+NMR+spectroscopy+and+molecular+modeling.">34;Rules of Engagement&amp;#34; of protein-glycoconjugate interactions: A molecular view achievable by using NMR spectroscopy and molecular modeling.</a> ChemistryOpen. 5 (4), 274-296 (2016).</li><li>Ard&#225;, A., Jim&#233;nez-Barbero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+recognition+of+glycans+by+protein+receptors.+Insights+from+NMR+spectroscopy.">The recognition of glycans by protein receptors. Insights from NMR spectroscopy.</a> Chem Commun. 54 (38), 4761-4769 (2018).</li><li>Gimeno, A., Valverde, P., Ard&#225;, A., Jim&#233;nez-Barbero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycan+structures+and+their+interactions+with+proteins.">Glycan structures and their interactions with proteins.</a> A NMR view. Curr Opin Struct Biol. 62, 22-30 (2020).</li><li>Ca&#241;ada, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+and+structural+characterization+of+carbohydrates+and+their+interactions+studied+by+NMR.">Conformational and structural characterization of carbohydrates and their interactions studied by NMR.</a> Curr Med Chem. 29 (7), 1147-1172 (2022).</li><li>Valverde, P., Quintana, J. I., Santos, J. I., Ard&#225;, A., Jim&#233;nez-Barbero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+NMR+avenues+to+explore+the+conformation+and+interactions+of+glycans.">Novel NMR avenues to explore the conformation and interactions of glycans.</a> ACS Omega. 4, 13618-13630 (2019).</li><li>Jim&#233;nez-Barbero, J., Asensio, J. L., Ca&#241;ada, F. J., Poveda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+and+protein-bound+carbohydrate+structures.">Free and protein-bound carbohydrate structures.</a> Curr Opin Struct Biol. 9 (5), 549-555 (1999).</li><li>Quintana, J. I., Atxabal, U., Unione, L., Ard&#225;, A., Jim&#233;nez-Barbero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+multivalent+carbohydrate-protein+interactions+by+NMR.">Exploring multivalent carbohydrate-protein interactions by NMR.</a> Chem Soc Rev. 52 (5), 1591-1613 (2023).</li><li>Rold&#243;s, V., Ca&#241;ada, F. J., Jim&#233;nez-Barbero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbohydrate-protein+interactions:+a+3D+view+by+NMR.">Carbohydrate-protein interactions: a 3D view by NMR.</a> Chembiochem. 12 (7), 990-1005 (2011).</li><li>Unione, L., Ard&#225;, A., Jim&#233;nez-Barbero, J., Millet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+of+glycoproteins:+profiling,+structure,+conformation,+and+interactions.">NMR of glycoproteins: profiling, structure, conformation, and interactions.</a> Curr Opin Struct Biol. 68, 9-17 (2021).</li><li>del Carmen Fern&#225;ndez-Alonso, M., D&#237;az, D., Berbis, M. A., Marcelo, F., Ca&#241;ada, J., Jim&#233;nez-Barbero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-carbohydrate+interactions+studied+by+NMR:+from+molecular+recognition+to+drug+design.">Protein-carbohydrate interactions studied by NMR: from molecular recognition to drug design.</a> Curr Protein Pept Sci. 13 (8), 816-830 (2012).</li><li>Angulo, J., Nieto, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STD-NMR:+application+to+transient+interactions+between+biomolecules-a+quantitative+approach.">STD-NMR: application to transient interactions between biomolecules-a quantitative approach.</a> Eur Biophys J. 40 (12), 1357-1369 (2012).</li><li>Mayer, M., Meyer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Group+epitope+mapping+by+saturation+transfer+difference+NMR+to+identify+segments+of+a+ligand+in+direct+contact+with+a+protein+receptor.">Group epitope mapping by saturation transfer difference NMR to identify segments of a ligand in direct contact with a protein receptor.</a> J Am Chem Soc. 123 (25), 6108-6117 (2001).</li><li>Williamson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+chemical+shift+perturbation+to+characterise+ligand+binding.">Using chemical shift perturbation to characterise ligand binding.</a> Prog Nucl Magn Reson Spectrosc. 73, 1-16 (2013).</li><li>Fern&#225;ndez, C., Adeishvili, K., W&#252;thrich, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transverse+relaxation-optimized+NMR+spectroscopy+with+the+outer+membrane+protein+OmpX+in+dihexanoyl+phosphatidylcholine+micelles.">Transverse relaxation-optimized NMR spectroscopy with the outer membrane protein OmpX in dihexanoyl phosphatidylcholine micelles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2358-2363 (2001).</li><li>Yee, A., Gutmanas, A., Arrowsmith, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+NMR+in+structural+genomics.">Solution NMR in structural genomics.</a> Curr Opin Struct Biol. 16 (5), 611-617 (2006).</li><li>Skinner, S. P., Fogh, R. H., Boucher, W., Ragan, T. J., Mureddu, L. G., Vuister, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCPNMR+AnalysisAssign:+a+flexible+platform+for+integrated+NMR+analysis.">CCPNMR AnalysisAssign: a flexible platform for integrated NMR analysis.</a> J Biomol NMR. 66 (2), 111-124 (2016).</li><li>Gimeno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimizing+the+entropy+penalty+for+ligand+binding:+Lessons+from+the+molecular+recognition+of+the+histo+blood-group+antigens+by+human+Galectin-3.">Minimizing the entropy penalty for ligand binding: Lessons from the molecular recognition of the histo blood-group antigens by human Galectin-3.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 58 (22), 7268-7272 (2019).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הפרש העברת רוויה NMR (STD-NMR) הפך לשיטת NMR הנפוצה והמגוונת ביותר לחקר אינטראקציות ליגנד-חלבון. כפי שמוצג לעיל, היא מסתמכת על תופעת העברת הרוויה, והמערך הניסויי כרוך ברכישה של שני ספקטרום חד-ממדי (1D) 1H: ספקטרום התהודה¬ וספקטרום ¬off-resonance. במהלך ניסוי התהודה, הרוויה של פרוטונים ספציפיים של החלבון מושגת על ידי הפעלת רכבת של פולסים בתדרי רדיו בהספק נמוך במהלך תקופה מסוימת (זמן הרוויה נע בדרך כלל בין 1-3 שניות). כדי למנוע רוויה ישירה של הליגנד, התדירות והאורך של פעימות הרוויה מותאמים להקרנה סלקטיבית של פרוטונים ספציפיים של החלבון; כלומר, יש ליישם אותם בתדר פנוי מכל אותות הליגנד ובאורך מתאים (איור 1). ככלל אצבע לפעימות רוויה של 50 אלפיות השנייה, יש לשמור על הפרש של 1 חל"מ מאזור הרוויה לאותות הליגנד הקרובים ביותר. בדרך כלל, פעימות רוויה סלקטיבית המיושמות על האזור האליפאטי של החלבון מספקות השפעות רוויה מוגברות. לחלופין, פרוטונים ארומטיים (6-7 ppm) יכולים להיות מוקרנים גם אם מולקולת הליגנד אינה מכילה אותות ארומטיים. זה מאוד שימושי עבור גליקנים המתרחשים באופן טבעי, כפי שהם אינם נושאים קבוצות ארומטיות. ברגע שאזור מסוים של החלבון מוקרן באופן סלקטיבי, הרוויה מתפשטת לאורך החלבון באמצעות הרפיה צולבת דיפולרית 1 H-1H (דיפוזיית ספין). בסופו של דבר, הרוויה מגיעה לפרוטוני החלבונים באתר הקשירה, אשר מועברים לאחר מכן לפרוטוני הסוכר הנמצאים במגע הדוק (r < 5 Å) עם הקולטן באמצעות אינטרמולקולרי 1 H-1H NOEs. ברור שעוצמת האותות של פרוטוני הליגנד הרווי פוחתת. לאחר קבלת הרוויה, בשל הקינטיקה המחייבת, הליגנדות הקשורות באופן ארעי (נדרש חילוף מהיר) מתנתקות ומידע הרוויה נצבר במצב החופשי. בשל התהליך הזה, ספקטרום התהודה של NMR מציג אותות מופחתים (איור 2).
כדי להציג בבירור הפרעה בעוצמה זו של גרעיני 1H של גליקן קשירה, נרכש ספקטרום NMR של פרוטון בקרה (off-resonance) שבו הרוויה מוחלת הרחק מכל קולטן או אות פחמימות (בדרך כלל בין 40-100 ppm), באותם תנאים. הספקטרום ה-1D שהוחסר בין ה-off-resonance ל-on-resonance מראה באופן בלעדי את האותות של גרעיני 1Hשל הליגנד ששינו את העוצמות: אלה שהיו קרובים מספיק לאתר הקישור של הקולטן כדי לקבל את המגנטיזציה (איור 2).
עם זאת, לא כל גרעיני 1H של פחמימה קשורה מקבלים את אותה כמות רוויה. תיאורטית, העברת המגנטיזציה מהקולטן לליגנד הכבול היא תלוית מרחק (1/r6). משמעות הדבר היא שעוצמות הרוויה המועברת בין גרעיני גליקן 1H מכילות מידע על הקרבה המרחבית בין פרוטוני הליגנד לאלה של הקולטן, ועוצמות STD NMR גדולות יותר עבור אותם פרוטונים הקרובים יותר לקולטן. בהתאם לכך, ניסוי STD NMR מאפשר גם לקבוע את אפיטופ הקישור של הפחמימה (איור 2 ואיור 3) מאחר שפרוטונים של הליגנד היושב קרוב יותר לפני השטח של החלבון מראים עוצמות גבוהות יותר מאלה שאינם משתתפים ישירות בקשירה.
הניסוי יכול להיות מיושם על מערכות עם זיקה חלשה-בינונית, לעתים רחוקות על מערכות עם זיקות חזקות בתחום μM או nM נמוך. אכן, היא דורשת שקצב הדיסוציאציה יהיה מהיר בסקאלת זמן ההרפיה. אחרת, מידע העברת הרוויה הולך לאיבוד באמצעות הרפיה לפני שהליגנד מתנתק.
מצד שני, ניסויי NMR מבוססי חלבון הם ייחודיים לפענוח אינטראקציה ליגנד-חלבון עם דיוק ברמת חומצות אמינו מבלי לפתור את מבני הרזולוציה האטומית. הוא בוחן ישירות תופעות של זיהוי מולקולרי בתמיסה ללא צורך בהתגבשות משותפת. מיפוי ניתוח CSP הוא בעל עוצמה יוצאת דופן לגילוי ליגנדות ולמיפוי אתר קשירת החלבונים (איור 4 ואיור 5). שיטה זו ישימה לכל טווח של זיקות בין תחום mM ו- nM, אפילו עבור מערכות שבהן שער החליפין איטי בסקאלת זמן השינוי הכימי21.
עם זאת, גישה זו כנראה לא תעבוד עבור חלבונים עם משקל מולקולרי מעל 30-40 kDa בשל בעיות הרפיה. לאחר מכן ניתן להשתמש בחלופה18 של TROSY, והיא חזקה במיוחד בשילוב עם דאוטרציה של חלבונים. יתר על כן, החלבון צריך להיות מסומן באופן אחיד עם 15N (ועוד מדגם כפול מסומן עם 13C ו 15N כדי להיות מסוגל להשלים את המשימה עמוד השדרה הנדרש). לכן, תנאי ביטוי החלבון, כולל מערכת הביטוי המתאימה צריכים להיות אופטימליים כדי להיות מסוגלים לקבל כמויות מיליגרם של חלבון. חלבונים המציגים נטייה לאוליגומריזציה או צבירה גם אינם מתאימים לניתוח זה. המכשיר המשמש כאן להקלטת נתוני NMR הוא ספקטרומטר Bruker 800 MHz המצויד בקריופרוב TCI. יהיה מאתגר מאוד להשתמש במתודולוגיה זו באמצעות מכשירים מתחת ל-600 מגה-הרץ או ללא בדיקה קריוגנית.

זיהוי מולקולרי של גליקנים חיוני לתהליכים רבים הקשורים לבריאות ולמחלות. הספציפיות והסלקטיביות של קולטנים ביולוגיים (לקטינים, נוגדנים, אנזימים) עבור גליקנים תלויה במידה רבה בהתאמת האיזון הרעוע בין המרכיבים השונים של אנתלפיה (CH-π ואן דר ואלס, קשרי מימן, אלקטרוסטטיקה) ואנטרופיה (הידרופוביות, דינמיקה, המסה-המסה)1.
בהתחשב במגוון הכימי הגדול ובאופי הדינמי של גליקנים, שיטות NMR נמצאות בשימוש נרחב לניתוח אינטראקציות גליקן במשך יותר מ -25 שנה2, שכן מתודולוגיות אלה מספקות מידע מעולה על אירועי זיהוי מולקולרי עם פרטים מדויקים, ברזולוציה אטומית 3,4, גם כאשר לא ניתן לאחזר את ראיות האינטראקציה הנדרשות על ידי שימוש במתודולוגיות אחרות. כנקודת מפתח, NMR הוא רב-תכליתי ומאפשר לחקור אירועים דינמיים, ברמה האטומית, בסקאלות זמן שונות, המהווים את הטכניקה הטובה ביותר ללא ספק לחקר המבנה, הקונפורמציה והדינמיקה של גליקנים בתמיסה. עם זאת, התרת מידע זה עשויה להיות תהליך מורכב למדי הדורש שימוש באסטרטגיות מוגדרות היטב יחד עם ניתוח נתונים זהיר5.
טכניקות NMR הן מגוונות, ואכן, ישנן מתודולוגיות רבות שניתן להשתמש בהן כדי לפענח אינטראקציות גליקן-חלבון6. אנו מתארים כאן שתי גישות NMR בסיסיות המשמשות כיום לפענוח אינטראקציות קולטן גליקן 7,8, תוך שימת דגש על האופן שבו ניתן להתיר את ההצגה של אפיטופ המפתח גליקן כמו גם את אתר קישור החלבונים9.
בכל אירוע זיהוי מולקולרי, כאשר קולטן נקשר לליגנד נתון, מתרחש תהליך חילופי כימיקלים המשפיע על פרמטרים רבים של NMR של המשתתפים בקישור10. לכן, מנקודת המבט של NMR, ניתן לעקוב אחר האינטראקציה מנקודת המבט של ליגנד הגליקן או מזה של קולטן החלבון11. באופן כללי, קולטן החלבון הוא ביומולקולה גדולה (תנועה סיבובית איטית, עם קצב בציר הזמן, ולכן הרפיה רוחבית מהירה), בעוד שהגליקן המקיים אינטראקציה יכול להיחשב כמולקולה בגודל קטן-בינוני (תנועה סיבובית מהירה, עם קצב בציר הזמן ps, והרפיה רוחבית איטית)12. מנקודת מבט סטנדרטית, אותות ה-NMR של הגליקן צרים, בעוד אלה של הקולטן רחבים13.
שיטות NMR מבוססות ליגנד מסתמכות על השינוי הדרמטי שחווים פרמטרים רבים של NMR גליקני בעת מעבר מהמצב החופשי למצב המוגבל14. STD-NMR היא טכניקת ה-NMR הניסיונית הנפוצה ביותר להערכת תכונות קשירת גליקן מגוונות15, החל מהסקת קיומה של קשירה במצב תמיסה ועד לקביעת אפיטופ קשירת גליקן; כלומר, האטומים של הליגנד הנמצאים במגע עם קולטן החלבון16.
לחלופין, שיטות NMR מבוססות קולטן מנטרות את השינויים המתרחשים באותות של קולטן החלבון בנוכחות הגליקן ביחס לאלה שנרשמו עבור מצב apo17. אלה מתמקדים בעיקר בסינון הפרעות השינוי הכימי של אותות החלבון בין שני המצבים. הניסוי הנפוץ ביותר הוא 1 H-15N HSQC, או חלופות TROSY18.
השילוב של שתי הגישות מאפשר יישום תמ"ג במערכות רבות ומגוונות המציגות מגוון רחב של זיקות. עם זאת, עבור שיטות NMR מבוססות קולטן, בניגוד לאלה המבוססות על ליגנד, כמות גדולה יחסית של חלבון מסיס, לא מצטבר ויציב מסומן איזוטופ (15N) חייב להיות זמין.
נתאר כאן את שתי השיטות, תוך הדגשת נקודות החוזק והחולשה שלהן. שים לב שהשלבים הבסיסיים המתוארים בפרוטוקול משמשים דוגמאות לשימוש בספקטרומטרים של Bruker. כתוצאה מכך, שמות הפקודות והפרמטרים מתיישרים עם אלה המשמשים ב- TopSpin (תוכנת בקרת הספקטרומטרים של Bruker).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mm Shigemi microtube set mat</td>
			<td>CortecNet SAS</td>
			<td>S30BMS-005B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-Lactose-Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich Qu&#237;mica S.L.</td>
			<td>7634-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride (15 N, 99%)</td>
			<td>LC-0179-N-50G</td>
			<td>Tracer Tecnolog&#237;as Anal&#237;ticas S.L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin (Sodium Salt)&#160;</td>
			<td>Melford Laboratories LTD</td>
			<td>A40040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIOVIA Discovery studio&#160;</td>
			<td>BIOVIA, Dassault Syst&#232;mes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3) Chemically Competent Cells&#160;</td>
			<td>Merck Life Science, S.L.U.</td>
			<td>CMC0014-40X40UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra X-22R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2O&#160;</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc.</td>
			<td>DLM-4-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Innova 42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (Isopropyl &#223;-D-1-thiogalactopyranoside)</td>
			<td>VWR International Eurolab S.L.</td>
			<td>VW437144N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LacNAc</td>
			<td>Elicityl</td>
			<td>GLY008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani (LB) Broth</td>
			<td>Merck Life Science, S.L.U.</td>
			<td>3397-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matraz Erlenmeyer B N 5000 CC&#160;</td>
			<td>VWR International Eurolab S.L.</td>
			<td>214-1137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyMOL</td>
			<td>PyMOL Molecular Graphics System</td>
			<td>Version 2.0 Schr&#246;dinger</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Sonics &#38; Materials, Inc.</td>
			<td>VC 505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superconducting NMR magnet</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>600 MHz AVANCE III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superconducting NMR magnet</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>800 MHz AVANCE III</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

disentangling glycan-protein interactions: nuclear magnetic resonance (nmr) to the rescue

האינטראקציות של גליקנים עם חלבונים מווסתות אירועים רבים הקשורים לבריאות ומחלות. למעשה, הקמת אירועי הכרה אלה והשלכותיהם הביולוגיות קשורים קשר הדוק למבנים התלת-ממדיים של שני בני הזוג, כמו גם לתכונותיהם הדינמיות ולהצגתם על תאי התא המתאימים. טכניקות NMR הן ייחודיות להתרת מאפיינים אלה, ואכן, מתודולוגיות מגוונות מבוססות NMR פותחו ויושמו כדי לנטר את אירועי הקישור של גליקנים עם הקולטנים הקשורים אליהם. פרוטוקול זה מתאר את ההליכים לרכישה, עיבוד וניתוח של שתיים ממתודולוגיות ה- NMR החזקות ביותר המשמשות בתחום הגליקוביולוגיה של NMR, 1H-Saturation Transfer Difference (STD) ו- 1 H,15N-Heteronuclear Single Quantum Coherence (HSQC) ניסויי טיטרציה, המציעים מידע משלים מנקודת המבט של גליקן וחלבון, בהתאמה. ואכן, כאשר הם משולבים הם מציעים ערכת כלים רבת עוצמה להבהרת ההיבטים המבניים והדינמיים של תהליכי זיהוי מולקולרי. גישה מקיפה זו משפרת את הבנתנו את יחסי הגומלין בין גליקן-חלבון ותורמת לקידום המחקר בתחום הגליקוביולוגיה הכימית.

Molecular recognition of glycans is essential for many processes related to health and disease. The specificity and selectivity of biological receptors (lectins, antibodies, enzymes) for glycans heavily depend on adjusting the precarious balance between the diverse components of enthalpy (CH-&#960; and van der Waals, hydrogen bonds, electrostatics) and entropy (hydrophobicity, dynamics, solvation-desolvation)1.
Given the large chemical diversity and dynamic nature of glycans, NMR methods have been widely employed to dissect glycan interactions for more than 25 years2, since these methodologies afford superb information on molecular recognition events with precise details, at atomic resolution3,4, even when the required interaction evidence cannot be retrieved by employing other methodologies. As key point, NMR is versatile and allows studying dynamic events, at the atomic level, at different time scales, constituting the best technique by far for studying the structure, conformation, and dynamics of glycans in solution. Nevertheless, disentangling this information may be a rather complex process that requires the employment of well-defined strategies together with careful data analysis5.
NMR techniques are diverse and, indeed, there are many methodologies that can be employed to unravel glycan-protein interactions6. We herein describe two basic NMR approaches that are currently employed to decipher glycan-receptor interactions7,8, making emphasis on how to untangle the presentation of the key glycan epitope as well as the protein binding site9.
In any molecular recognition event, when a receptor binds to a given ligand, there is a chemical exchange process that affects many NMR parameters of the participants in the binding10. Therefore, from the NMR perspective, the interaction can be monitored either from the point of view of the glycan ligand or from that of the protein receptor11. Generally speaking, the protein receptor is a large biomolecule (slow rotational motion, with rates in the ns timescale, and therefore, fast transverse relaxation), while the interacting glycan can be considered as a small-medium size molecule (fast rotational motion, with rates in the ps timescale, and slow transverse relaxation)12. From a standard perspective, the NMR signals of the glycan are narrow, while those of the receptor are broad13.
Ligand-based NMR methods rely on the dramatic change that many glycan NMR parameters experience when passing from the free to the bound state14. STD-NMR is the most employed experimental NMR technique to assess diverse glycan binding features15, from deducing the existence of binding in the solution state to the determination of the glycan binding epitope; that is, the atoms of the ligand that are in contact with the protein receptor16.
Alternatively, receptor-based NMR methods monitor the changes that take place in the signals of the protein receptor in the presence of the glycan with respect to those recorded for the apo state17. These are mainly focused on screening the chemical shift perturbations of the protein signals between both states. The most commonly employed experiment is 1H-15N HSQC, or its TROSY alternatives18.
The combination of both approaches allows applying NMR to many diverse systems that display a wide range of affinities. However, for the receptor-based NMR methods, in contrast to those based on the ligand, a relatively large amount of soluble, non-aggregated, stable isotope-labelled (15N) protein must be available.
We herein describe both methods, highlighting their strengths, and weaknesses. Note that the basic steps described in the protocol serve as examples for the use of Bruker spectrometers. Consequently, commands and parameters names align with those utilized in TopSpin (Bruker&#39;s spectrometers control software).

מחבר זרקור: חשיפת ההיבטים המבניים והדינמיים של זיהוי מולקולרי גליקני

התרת אינטראקציות גליקן-חלבון: תהודה מגנטית גרעינית (NMR) להצלה

Our research delves into the study of diverse glycan lectin systems, exploring their connections to health and disease. We merged methodologies from chemistry, biology, and biomedicine to deeply investigate the roles in immune responses to pathologists from cancer to bacterial and viral infections. Recently, glyco sciences have marked groundbreaking milestones by transforming glycan design, synthesis and analysis of a structural molecular recognition aspects from the atomic to the cell level.These advances collectively set the stage for fluorescent or advanced glycan-based therapies. This protocol outlines the procedures for acquiring, processing, and analyzing two of the most powerful NMR methodologies employed in the glycan field. These methodologies, saturation transfer difference, and chemical safe perturbation analysis complimentarily offer precise information of the structural and dynamic aspects of molecular recognition of lichens.

במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול לניצול ניסויים מסוג 1H-STD NMR ו-1 H-15N HSQC כדי לפענח את פרטי האינטראקציה הקושרת בין לקטינים ואוליגוסכרידים קטנים. התוצאות שהתקבלו בניתוח הזיהוי המולקולרי של LacNAc על ידי hGalectin-7 (hGal-7) כלולות, ומשמשות דוגמה להמחשה ליישום מוצלח של הפרוטוקול וליעילות של מתודולוגיות NMR אלה לחקר הפרטים הקטנים של תהליך הזיהוי המולקולרי. איור 3 מראה אתספקטרום 1 H-STD NMR עבור האינטראקציה של LacNAc עם hGal-7. קיומם של אותות STD NMR מצביע על קשירה (איור 3A). יתר על כן, רק האותות השייכים לפרוטונים הנמצאים במגע הדוק עם החלבון מופיעים, מה שמאפשר את תיחום האפיטופ הקושר (איור 3B). איור 4 מדגיש כיצד ספקטרום H-15N HSQC 1של חלבון יכול לשמש כטביעת האצבע שלו, ואיור 5 מדגים את היישום של ניסויי טיטרציה של 1 H-15N הטרו-גרעיני בקוהרנטיות קוונטית יחידה (HSQC) כדי להגדיר את הפרעות השינוי הכימי של קבוצותאמיד עמוד השדרה h Galectin-7 בעת קשירת LacNAc. נתונים אלה לא רק חושפים את קיומה של אינטראקציה, אלא גם משרטטים את ממשק הקשירה של הלקטין. איור 6 מדגים כיצד ניתוח נתוני הטיטרציה מאפשר להעריך את זיקת הקישור של LacNAc על ידי hGalectin-7, אשר נמצא בטווח המיקרומולרי הגבוה. ממצא זה עולה בקנה אחד עם התוצאות המתקבלות באמצעות טכניקות חלופיות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66530/66530fig01.jpg"> איור 1: בחירת תדר התהודה. 1ספקטרום H-NMR של LacNAc:hGal-7 יחס 50:1 במי מלח חוצצי פוספט ב-pH 7.4. אותות של ליגנד (LacNAc) מוגבלים באזור בין 2.0-5.2 ppm. תדירות הרוויה נבחרת בקפידה כדי להבטיח היעדר פרוטוני ליגנד בטווח של 1-2 ppm, מה שמאפשר הקרנה סלקטיבית של פרוטוני החלבון. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66530/66530fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66530/66530fig02.jpg"> איור 2: ניסוי STD NMR. ייצוג סכמטי של ניסוי STD: הספקטרום הראשון (off-resonance) משמש כנקודת ייחוס ואילו בספקטרום השני (on-resonance) מבוצעת רוויית חלבונים. הרוויה מופצת ביעילות על פני החלבון כולו ומועברת לפרוטוני הליגנד במגע הדוק עם החלבון. ספקטרום ההבדל המתקבל (ספקטרום STD) מניב רק את התהודה שחוו רוויה. ניתוח ניסוי STD מאפשר מיפוי אפיטופי של הסוכר הקושר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66530/66530fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66530/66530fig03.jpg"> איור 3: ניתוח מחייב מנקודת מבטו של הליגנד. (A) סופראימפוזיציה של ספקטרום מחוץ לתהודה וספקטרום STD-NMR של 1H עבור האינטראקציה של LacNAc עם hGal-7. בספקטרום מחלות מין, רק אותות השייכים לפרוטונים הנמצאים במגע הדוק עם החלבון מופיעים. הביאור של תהודה 1H של הליגנד מדווח בספקטרום מחוץ לתהודה. (B) העוצמות היחסיות של מחלות מין מופו למבנה הכימי של LacNAc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66530/66530fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66530/66530fig04.jpg"> איור 4: ספקטרום H-15N HSQC 1של חלבון מייצג את טביעת האצבע שלו. (A) 1 H-15N HSQC ספקטרום של 100 מיקרומטר של hGal-7 בצורת apo. הספקטרום נרשם ב 25 ° C. כמה פסגות צולבות NH היו מבוארות עם התווית של חומצת האמינו המתאימה להם. (B) כל זוג NH מציג שינוי כימי ייחודי התלוי בסביבה הכימית וכתוצאה מכך, במבנה התלת-ממדי של החלבון. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66530/66530fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66530/66530fig05.jpg"> איור 5: ניתוח קשירה מנקודת המבט של החלבון. (A) מוצגת סופר-אימפוזיציה של ספקטרום H-15N HSQC 1שנרשם לטיטרציה של LacNAc לתמיסת HGal-7. בחינה של הספקטרה, שבה כמה פסגות צולבות חוות שינויים כימיים, מצביעה בבירור על אינטראקציה. (B) תרשים הפרעות ההסטה הכימיות המרביות (maxCSP) של אותות האמיד בעמוד השדרה שהוסקו מהטיטרציה של LacNAc (15 שווה ערך) עם hGal-7. (C) חומצות האמינו המוטרדות ביותר של hGal-7, על פי ניתוח CSP, ממופות למבנה PDB 5gal. במודל התלת-ממדי, הצבע האדום מתייחס לערך CSP מעל 2σ, ואילו הצבע הוורוד מתייחס לערכים בין 1σ ל-2σ. האזור הצבעוני מייצג ככל הנראה את אתר הקשירה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66530/66530fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66530/66530fig06.jpg"> איור 6: קביעת KD בהתבסס על ניסויי טיטרציה H-15N HSQC. (A) ייצוג התבנית שלטיטרציה מבוססת H-15N HSQC בהתאם לשער החליפין הכימי בסקאלת הזמן של NMR של המערכת במחקר (מהיר, בינוני או איטי). משטר החלפה מהיר נצפה במקרה של אינטראקציה LacNAc/hGal-7. (B) עקומת התאמה ואומדן KD המתקבל מניתוח CSP בריכוזי ליגנדים משתנים עבור מערכת המודל של hGal-7 ו- LacNAc disaccharide. KD המשוער מדווח עם השגיאה המתאימה כממוצע של הנתונים עבור 20 חומצות אמינו שונות; (C) קטעים של ספקטרום N-HSQC של 1 H,15המציגים את השינוי של פסגות צולבות נבחרות במהלך הטיטרציה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66530/66530fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

כאן אנו מציגים פרוטוקול המפרט רכישה, עיבוד וניתוח של סדרת ניסויי NMR שמטרתם לאפיין אינטראקציות חלבון-גליקן בתמיסה. מתוארות רוב המתודולוגיות הנפוצות המבוססות על ליגנדות וחלבונים, אשר ללא ספק תורמות לתחומי הגליקוביולוגיה המבנית ומחקרי הזיהוי המולקולרי.

The interactions of glycans with proteins modulate many events related to health and disease. In fact, the establishment of these recognition events and ...

המחקר שלנו מתעמק בחקר מערכות גליקן לקטין מגוונות, ובוחן את הקשר שלהן לבריאות ולמחלות. מיזגנו מתודולוגיות מכימיה, ביולוגיה וביו-רפואה כדי לחקור לעומק את התפקידים בתגובות חיסוניות לפתולוגים, מסרטן ועד זיהומים חיידקיים ונגיפיים. לאחרונה, מדעי הגליקו סימנו אבני דרך פורצות דרך על ידי שינוי עיצוב, סינתזה וניתוח גליקניים של היבטי זיהוי מולקולרי מבני מרמת האטום לרמת התא.פיתוחים אלה ביחד מכינים את הקרקע לטיפולים פלואורסצנטיים או מתקדמים מבוססי גליקאן. פרוטוקול זה מתאר את הנהלים לרכישה, עיבוד וניתוח של שתיים ממתודולוגיות ה- NMR החזקות ביותר המיושמות בתחום הגליקן. מתודולוגיות אלה, הפרש העברת רוויה וניתוח הפרעות כימיות בטוחות מציעות מידע מדויק על ההיבטים המבניים והדינמיים של זיהוי מולקולרי של חזזיות.

disentangling-glycan-protein-interactions-nuclear-magnetic-resonance

Research

JoVE Journal

Chemistry

Disentangling Glycan-Protein Interactions: Nuclear Magnetic Resonance (NMR) to the Rescue

574 Views.  CIC bioGUNE, Basque Research and Technology Alliance (BRTA). המחקר שלנו מתעמק בחקר מערכות גליקן לקטין מגוונות, ובוחן את הקשר שלהן לבריאות ולמחלות. מיזגנו מתודולוגיות מכימיה, ביולוגיה וביו-רפואה כדי לחקור לעומק את התפקידים בתגובות חיסוניות לפתולוגים, מסרטן ועד זיהומים חיידקיים ונגיפיים. לאחרונה, מדעי הגליקו סימנו אבני דרך פורצות דר?...

Video: מחבר זרקור: חשיפת ההיבטים המבניים והדינמיים של זיהוי מולקולרי גליקני

The interactions of glycans with proteins modulate many events related to health and disease. In fact, the establishment of these recognition events and their biological consequences are intimately related to the three-dimensional structures of both partners, as well as to their dynamic features and their presentation on the corresponding cell compartments. NMR techniques are unique to disentangle these characteristics and, indeed, diverse NMR-based methodologies have been developed and applied to monitor the binding events of glycans with their associate receptors. This protocol outlines the procedures to acquire, process and analyze two of the most powerful NMR methodologies employed in the NMR-glycobiology field, 1H-Saturation transfer difference (STD) and 1H,15N-Heteronuclear single quantum coherence (HSQC) titration experiments, which complementarily offer information from the glycan and protein perspective, respectively. Indeed, when combined they offer a powerful toolkit for elucidating both the structural and dynamic aspects of molecular recognition processes. This comprehensive approach enhances our understanding of glycan-protein interactions and contributes to advancing research in the chemical glycobiology field.

Here, we present a protocol detailing the acquisition, processing, and analysis of a series of NMR experiments aimed at characterizing protein-glycan interactions in solution. Most common ligand-based and protein-based methodologies are outlined, which undoubtedly contribute to the fields of structural glycobiology and molecular recognition studies.

Acquisition, Processing, and Analysis of 1H-Saturation Transfer Difference (STD) NMR to Characterize Protein-Glycan Interactions

Begin by preparing a sample with a protein-ligand complex. Then, using a pipette, carefully transfer 0.6 milliliters of the prepared solution into a five milliliter NMR tube. To set up the NMR instrument to the required temperature, use the EDT command to open the temperature control monitor and adjust the desired temperature.Then, place the sample at the sample changer. Use an autosampler to insert the sample into the magnet and run the command sx, followed by the position number, N, corresponding to the position of the NMR tube in the autosampler tray. After this, the sample enters the NMR magnet.To lock on the solvent signal, type the lock command and select the appropriate solvent from the menu. Use either the automatic module, atma, or the manual module, atmm, to complete the tuning and matching process. Now, using the topshim command, start the automatic shimming, then execute the pulsecal command to determine the proton 90 degree pulse.After that, create a new data set and upload the STD NMR pulse sequence. Define the off and on resonance frequencies for the STD NMR experiment under the FQLIST entry in the ACQUPARS window. Set the off resonance frequency in a region without any ligand or protein proton signals.Then, choose an on resonance frequency in a spectral region devoid of glycan signals. Define the shaped pulse to be used during the saturation time in the ACQUPARS parameters of the ASED window. Afterwards, set the proton 90 degree pulse length, adjust the total saturation time and the relaxation delay to three seconds.Set the number of scans to a multiple of eight and dummy scans to eight. Then, set the number of points in F2 to 16K, 32K, or 64K, and an F1 to two. Now, using the automatic command rga, set the receiver gain to avoid overflow.Calculate the total experiment time using the experiment command. Finally, use the zg command to send the experiment for acquisition. After the experiment, perform the Fourier transform of the first FID, and select the destination of the processed spectra.Then, using the lb command, adjust the line broadening factor. To manually phase the spectrum, access the process tab, and then the adjust phase sub-menu. Click and drag on the corresponding button to perform zero and first order corrections and save the phasing results.After performing the Fourier transform for the second experiment, save the processed spectrum with a different code. Load the two processed spectra with the multiple functions, and, using the subtraction button available in the multiple visualization, subtract them. Then, open the off resonance spectrum and execute the MD command to initiate the multiple display window.Subsequently, upload the STD spectrum. Next, conduct a comparative analysis of the frequencies and intensities of the signals present in the STD NMR spectrum. In the off resonance experiment, measure the signal intensities.Navigate through the menu to select process, and then integrate. Carefully define the regions of interest and record the integrals in a file. Similarly, measure the intensities in the STD NMR experiment, ensuring that identical parameters are used, and document these integrals in a separate file.Alternatively, STD values can be determined by comparing signal intensities between the STD and off resonance spectra. To calculate the relative STD as a percentage, assign a 100%value to the proton exhibiting the maximum STD intensity. The proton STD NMR spectrum for the interaction of N-acetyl lactose amine, with human galectin 7, showed STD NMR signals indicating binding.Moreover, signals belonging to protons in close contact with the protein showed up, allowing delineation of the binding epitope.

רכישה, עיבוד וניתוח של 1H-Saturation Transfer Difference (STD) NMR לאפיון אינטראקציות חלבון-גליקן

15N-Heteronuclear Single Quantum Coherence (HSQC) Titration Experiments to Monitor the Chemical Shifts of the 1H and 15N NMR Resonances