الهدف العام من هذا البروتوكول هو تجميع الخلايا وتغليفها داخل مصفوفة شبه صلبة. يمكن بعد ذلك استخدام مجاميع الخلايا المدمجة في اتجاه مجرى النهر في ثقافة ثلاثية الأبعاد في المختبر ، أو كوسيلة لتجارب زرع الأعضاء في الجسم الحي. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها تستخدم منهجية ومعدات بسيطة لتحقيق تجميع الخلايا.
يمكن تطبيقه أيضا على مجموعة من أنواع الخلايا والأرقام. كشفت هذه التقنية عن نوع معين من الخلايا مطلوب لتجديد الطحال. يمكن أن يكشف عن المزيد من المنظمين لتجديد أنسجة الطحال ، أو يكون بمثابة منصة لدراسات هندسة الأنسجة الأوسع.
ابدأ بالتبريد المسبق لصندوق طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر داخل مجمد بدرجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر. ثم اغمر Parafilm في 80٪ إيثانول لمدة 10 دقائق ، متبوعا بغسل لمدة 10 دقائق في برنامج تلفزيوني. لتحضير محلول الخلية ، قم بقسمة رقم الخلية المطلوب في أنبوب مخروطي 14 ملليلتر.
أجهزة الطرد المركزي الخلايا عند 200 جرام و 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. ثم استنشق بعناية طاف ، وترك ما يقرب من 20 ميكرولتر من الحجم وراءه. يمكن بعد ذلك إعادة تعليق حبيبات الخلية في الحجم الطافي المتبقي.
باستخدام طرف ماصة مبرد مسبقا ، نضح 2 ميكرولتر من Matrigel المثلج البارد. قم باللف والإخراج برفق لإزالة طرف الماصة. قم بتمديد شريط Parafilm معقم مسبقا وضعه على نهاية طرف الماصة ، مع الحرص على عدم اختراق الفيلم.
استمر في لف Parafilm حول الجانب للتأكد من إغلاق الطرف. ثم ضع محلول الخلية برفق فوق Matrigel. اترك طرف الماصة على الثلج وقم بإعداد أنبوب مخروطي سعة 14 ملليلتر مع أنبوب عنقودي سعة 1.2 ملليلتر يوضع بالداخل.
يمكن بعد ذلك إدخال طرف الماصة داخل تكوين الأنبوب المتداخل ، والطرد المركزي عند 400 جرام و 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. احتضان الأنبوب عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. يمكن وضع الأنبوب على الجليد حتى الحاجة إلى مزيد من ذلك.
قم بإزالة Parafilm بعناية من طرف الماصة ، ثم أدخل مكبس سلكي رفيع ، واطرد قابس Matrigel في وسط زراعة الأنسجة. يمكن استزراع الخلايا المجمعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. احلق الفراء باستخدام كليبرز كهربائي وامسح الجلد بنسبة 80٪ من الإيثانول.
قم بعمل شق بطول سنتيمترين في الجلد عموديا على العمود الفقري ، وفضح الجدار البريتوني. ثم يتم إجراء شق ثان أصغر في الجدار البريتوني فوق الكلى. تطبيق الضغط وإضفاء الطابع الخارجي على الكلى.
تأكد من الحفاظ على رطوبة الكلى عن طريق تطبيق برنامج تلفزيوني معقم بانتظام. قرصة كبسولة الكلى مع زوج من ملقط فائقة الدقة ، وباستخدام زوج ثان ، المسيل للدموع بلطف في اتجاهات متعارضة. افصل غشاء الكبسولة بعناية عن حمة الكلى.
ارفع كبسولة الكلى بزوج واحد من الملقط وحرك طرف الماصة ببطء عبر الفتحة. أدخل مكبس سلكي برفق في طرف الماصة واطرد قابس Matrigel. بلل الكلى مع برنامج تلفزيوني وإعادة استيعابها في التجويف البريتوني.
أغلق الجدار البريتوني بخيوط 5-O-Vicryl ، وأغلق شق الجلد باستخدام أداة تطبيق AutoClip ومشبكين للجرح مقاس 9 ملم. الخطوة الرئيسية في هذا البروتوكول هي تجميع الخلايا داخل مصفوفة شبه صلبة. يتم تحقيق تحديد موضع الطبقة الوسطى من خلال سرعات الطرد المركزي المثلى.
تدفع السرعات العالية الخلايا إلى طرف الماصة ، بينما تمنع السرعات غير الكافية حركة الخلية عبر المصفوفة. بعد التصلب ، يمكن إخراج بنية Matrigel من طرف الماصة. تشكل التركيبات اللحمية الطحالية المستزرعة في المختبر هياكل عضوية كروية ثلاثية الأبعاد.
تعرض المواد العضوية بنية غير مجوفة مع وجود خلايا عبر قطر الأنسجة بالكامل. وهي تتألف من ثلاث مجموعات واسعة من الخلايا ، بما في ذلك خلايا الدم البيضاء وخلايا الدم الحمراء والخلايا اللحمية البطانية غير المكونة للدم. يمكن أيضا زرع التركيبات تحت كبسولة الكلى لدراسات تجديد الأنسجة.
بعد أربعة أسابيع ، يمكن ملاحظة بنية أنسجة الطحال المنظمة ، بما في ذلك الشرايين المركزية ، وبصيلات الخلايا البائية ، والخلايا الشبكية الليفية ، والخلايا النخاعية ذات اللب الأحمر ، والبلاعم المعدنية في المنطقة الهامشية ، والجيوب الأنفية لللب الأحمر ، وشبكات الخلايا المتغصنة المسامية ، ومنطقة الخلايا التائية ، وبلاعم اللب الأحمر ، والخلايا الشبكية الهامشية. أثناء محاولة تجميع الخلايا وتغليفها ، من المهم أن تتذكر العمل بسرعة والحفاظ على جميع المواد على الجليد. أهم خطوة لعمليات الزرع هي طرد سدادة Matrigel أثناء سحب طرف الماصة من الكلى.
يجب الحرص على عدم ثقب غشاء الكبسولة أو تمزق حمة الكلى. تم استخدام هذا البروتوكول للتحقيق في متطلبات مجموعتين من الخلايا اللحمية في تجديد أنسجة الطحال. في هذه التجربة التمثيلية ، فشلت المجاميع المستنفدة فقط من الخلايا السلبية لمستقبلات عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية - بيتا بيتا في بدء نمو الأنسجة ، مما يشير إلى أن هذه المجموعة من الخلايا الخاصة ضرورية لتجديد الطحال.
