بروتوكول لدينا تمكن من تحديد مفصل وتحليل أحاديات والخلايا الضامة والخلايا التائية و المجموعات الفرعية ذات الصلة داخل الخلايا العصبية وovium ومختلف الأنسجة الأخرى في الجهاز المناعي. تقنية لدينا يسهل الحصاد موثوق بها من خلايا المناعة الحياة من synovium وغيرها من الأنسجة ذات الصلة لتوصيف شامل للاستجابة المناعية العظام. لعزل الأنسجة ذات الاهتمام من الماوس نموذج هشاشة العظام، مع الماوس في وضع سوبين، مسح الصدر والبطن والساقين مع 70٪ الإيثانول.
استخدم المقص لفتح الجلد بعناية على طول خط الوسط في البطن مع ترك تجويف البطن سليمًا. وسحب بلطف الجلد على الجانب الأيمن من الحيوان بعيدا عن العضلات الكامنة، وترك الأنسجة الدهنية تحت الجلد تعلق على الجلد. ضع الفأر تحت مجهر تشريح واستخدام اثنين من ملقط ناعم المنحنية لندف بلطف خارج الأنسجة الدهنية الموجودة في الفخذ.
بعد تحديد الأوعية الثلاث المتقاطعة ، استخدم ملقطًا دقيقة لإزالة العقدة الليمفاوية الإربية الموجودة عند تقاطع الأوعية ، مع الحرص على عدم تمزق الكبسولة. استخدام ملقط لإزالة الدهون المتبقية من سطح العقدة الليمفاوية وفتح تجويف البطن. إذا لم يكن هناك ما تبقى من الدهون يمكن رؤيتها، ضع العقدة الليمفاوية على الفور في لوحة أعدت سابقا ووصفت ستة جيدا مليئة 0.5 ملليلتر من وسائل الإعلام RPMI.
بعد ذلك، افتح تجويف البطن. استخدام مقص غرامة لاستخراج الطحال واستخراج بلطف الأمعاء لفضح الشريان الأبهر وتشعب لها. بعد ذلك، ضع الطحال على الفور في أعدت سابقا ووصفت ستة لعبت بشكل جيد مليئة 0.5 ملليلتر من وسائل الإعلام RPMI.
إزالة العقدة اللمفاوية الحرقفية الموجودة في الجزء الطرفي من الشريان الأورطي البطني وأصل الشريان الحرقفي المشترك وإزالة الجلد بعناية من كلا الطرفين الخلفيين. ضع العقدة الليمفاوية على الفور في لوحة معدة مسبقًا ووصفت بطبقة سداسية مع 0.5 ملليلتر من وسائل الإعلام RPMI التي تجمع جميع الغدد الليمفاوية من حيوانين. باستخدام مقص غرامة أو مشرط تنظيف عظم الفخذ الأيسر من الأنسجة العضلية المرفقة وقطع بعناية كل من خنق والورك المشترك، وترك العظام كلها سليمة أثناء إزالة عظم الفخذ.
ثم وضعت عظم الفخذ في إعدادها سابقا ووصفت ستة لوحة جيدا مليئة 0.5 ملليلتر من وسائل الإعلام RPMI. تحديد وتر الرضفة من الحق خنق المفصل واستخدام مقص غرامة لإزالة الأنسجة العضلية المجاورة قريبة إلى مشترك حتى ما يقرب من خمسة ملليلترات من وتر رباعية وكيل الرضفة يتعرض. قطع من خلال وتر رباعية ما يقرب من ثلاثة إلى أربعة ملليمترات قريبة إلى الرضفة لتشكيل مقبض واستخدام ملقط غرامة لسحب بلطف التوتر بعيدا عن المفصل لفضح حواف المرفق كبسولة مشتركة.
بدءا من عظم الفخذ والتحرك نحو الساق، واستخدام مشرط لقطع بعناية على طول حواف كبسولة مشتركة على كلا الجانبين مع الحفاظ على الجر لطيف على وتر رباعية. عندما يتم إرفاق كتلة الأنسجة الزليلي فقط إلى الساق، وينبغي أن تكون لوحة الدهون داخل العين واضحة إلى الرضفة ويمكن فصل بلطف من الجانب المشترك والمرئي من مينسكي. ثم, قطع على طول الجزء المتبقي من كبسولة مشتركة لإزالة كتلة الأنسجة الزليلي ووضعها على الفور في لوحة أعدت سابقا ووصفت ستة جيدا مليئة 1.5 ملليلتر من وسائل الإعلام RPMI.
عندما تم جمع جميع الأنسجة، ضع طحالين مجمعين لكل حالة على مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب 15 ملليلتر واستخدم ممسحة حقنة معقمة تبلغ ثلاث ملليلتر لمعدل الكتلة بلطف للأنسجة من خلال مرشح الشبكة الذي ينظف المصفاة بشكل متكرر مع ما مجموعه ستة ملليلترات من RPMI 1640 متوسطة مكمّلة بنسبة 10٪ FBS. رواسب الخلايا عن طريق الطرد المركزي، وإعادة تعليق بيليه في خمسة ملليلتر من تحلل خلايا الدم الحمراء. بعد خمس دقائق، ووقف رد فعل مع 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني وطاردة مركزية الخلايا.
عندما لا يتم ملاحظة المزيد من خلايا الدم الحمراء، إعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني جديد للعد. لمعالجة العقدة الليمفاوية مكان جميع الغدد الليمفاوية الأربع على مصفاة خلية ميكرومتر 70 في أنبوب جديد 15 ملليلتر واستخدام جديد معقمة ثلاثة المليلتر المكبس ندف بلطف الغدد الليمفاوية من خلال شبكة في تعليق خلية واحدة، ثم الطرد المركزي الخلايا في 500 مرة G لمدة خمس دقائق، والتخلص من السوبر وإعادة تعليق بيليه في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني للعد. لعزل نخاع العظم، استخدم ملقط إبهام الأنسجة لإدراك عظم الفخذ السليم بعناية واستخدام مقص حاد لقطع نهاية عظم الفخذ القريب.
أدخل إبرة قياس 23 في منتصف الشق بين الأوعية من عظم الفخذ وتدوير الإبرة أثناء تطبيق ضغط لطيف لحفر ثقب في الشق. تغيير الإبرة حسب الضرورة، طرد محتويات العظام مع ستة ملليلتر من RPMI تكملها 10٪ FBS على مصفاة خلية 70 ميكرومتر على أنبوب جديد 15 ملليلتر واستخدام جديد ثلاثة ملليلتر المكبس حقنة للضغط بلطف نخاع العظم من خلال شبكة. بعد ذلك، تنفيذ خطوة RBC كما هو موضح بالنسبة الطحال.
عندما لا يتم ملاحظة المزيد من خلايا الدم الحمراء، إعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني جديد للعد. لمعالجة الأنسجة الزليلي استخدام مقص الجراحية غرامة لنرد كتل النسيج الزليلي اثنين إلى قطع صغيرة ونقل العينات إلى أنبوب جديد 15 ملليلتر. شطف حاوية جمع مع 500 ميكرولترات من المتوسطة لجمع أي الخلايا المتبقية والأنسجة الزليلي وسحب الغسيل في أنبوب جمع العينة.
بعد ذلك، إضافة كمية كافية من الانزيم لتحقيق في وحدة واحدة لكل ملليلتر التركيز النهائي وهضم عينة الأنسجة الزليلي في 37 درجة مئوية في حاضنة لمدة ساعتين من الدوار. ضمان حركة كافية عند وضع الأنابيب في الدوار. في نهاية الحضانة، ووقف الهضم مع ثمانية ملليلتر من RPMI تستكمل مع 10٪ FBS وتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب جديد 15 ملليلتر.
شطف أنبوب 15 ملليلتر القديمة مع خمسة ملليلتر من المتوسطة واستخدام هذا لغسل مرشح. ثم، رواسب الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في 500 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني للعد. لأداء تلطيخ البقاء للخلايا المناعية المعزولة، إضافة خمس مرات 10 إلى الخلايا الخمس من كل تعليق خلية إلى الآبار المناسبة من اثنين من مختلف 96 جيدا يو القاع لوحات وجمع الخلايا إلى الجزء السفلي من كل بئر.
وتشمل دائما الخلايا غير المطّوعة كافية من كل نوع الأنسجة والضوابط السلبية. غسل الخلايا مع 200 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني وإعادة تعليق الكريات في 100 ميكرولتر من الخلايا في صبغة تفاعلية أمين permeant في البئر لاحتضان 15 دقيقة في أربع درجات مئوية محمية من الضوء. في نهاية الحضانة يغسل الخلايا مرتين في 200 ميكرولترات من FACS العازلة في غسل وإعادة تعليق كل بيليه في 100 ميكرولترات من الأجسام المضادة المناسبة من الفائدة أو السيطرة كوكتيل.
إذا تم إجراء كل من داخل وخارج الخلية تلطيخ في نفس أداء خطوة التلطيخ خارج الخلية الآن. بعد 30 دقيقة حضانة في أربع درجات مئوية محمية من الضوء غسل الخلايا مرتين مع 200 ميكرولترات من FACS العازلة في البئر وإعادة تعليق الخلايا ولوحة لوحة فرعية monocyte في 250 ميكرولترات من FACS العازلة تستكمل مع EDTA EDTA واحد ملليمولار. إجراء هذه الخطوة فقط إذا لم يتم التخطيط لتلطيخ داخل الخلايا، وإلا انتقل إلى جانب تلوين داخل الخلايا من البروتوكول.
ثم، نقل كل عينة فرعية أحادية إلى أنبوب FACS المقابل المناسب على الجليد المحمي من الضوء. بالنسبة للتلوين بين الخلايا لخلايا اللوحة الفرعية T-cell، قم بإعادة تعليق الكريات في 200 ميكرولترات من عازل التثبيت من مجموعة التثبيت والنفاذ المناسبة لاحتضان لمدة 40 دقيقة عند أربع درجات مئوية محمية من الضوء. في نهاية الحضانة غسل الخلايا مرتين مع 200 microliters من permeabilization غسل العازلة وإعادة تعليق الكريات في 100 microliters من الأجسام المضادة المناسبة من الفائدة أو السيطرة كوكتيل لاحتضان 40 دقيقة في أربع درجات مئوية محمية من الضوء.
ثم، وغسل الخلايا مرتين في 200 ميكرولتر من permeabilization غسل العازلة في غسل. وإعادة تعليق الخلايا في 250 ميكرولتردات من FACS بالإضافة إلى مخزن EDTA قبل نقل العينات إلى أنابيب FACS المناسبة على الجليد المحمية من الضوء. هنا ، يمكن ملاحظة استراتيجية البوابات الهرمية للوحة الفرعية أحادية الخلايا على الخلايا المناعية التي تم جمعها من نخاع العظم للحيوانات المعالجة DMM.
يمكن استخدام المتصيدون غير الملطخة لتحديد السلبيات الحقيقية للثوّل الحي الميت ويمكن تعديل البوابات في كل مرة يتم فيها إجراء التجربة حسب الضرورة. في هذا التحليل التمثيلي، تم عزل الخلايا المناعية من الأنسجة الزليلية وملطخة بعلامات سطحية خارج الخلية، بعد ستة أسابيع من جراحة DMM أو التحكم الصوري. ولوحظت نسبة أعلى من Ly-SC إيجابية MHC2 السلبية و الضامة M2 في الحيوانات المعالجة DMM مقارنة مع مجموعات الخلايا لوحظت في الفئران جراحة صورية.
هنا، يمكن ملاحظة استراتيجية التراتبية الهرمية للوحة الخلايا التائية الإضافية والخلية داخل الخلايا على الخلايا المناعية المعزولة عن طحال الحيوانات المعالجة DMM. ويلاحظ نسبة أعلى من خلايا TH1 في الغدد الليمفاوية والأنسجة الزليلية للحيوانات DMM فضلا عن أعداد أكبر من الخلايا التنظيمية T وخلايا TH17. لضمان الحصول على عينات عالية الجودة ، يجب حصاد الأنسجة بطريقة سريعة ودقيقة ومتسقة.
مرة واحدة وقد تم عزل الخلايا المناعية، يمكن إجراء تحليل المصب الأخرى مثل RTPCR، وثقافة الخلية والراحة على الدم لتسليط الضوء على العمليات الجزيئية ذات الاهتمام.
