شكر خاص لحفظة مخزون B. coprophila السابقين (جاكوب إي بليس ، بولا بونازينجا ، آن دبليو كيريبروك ، إنغريد إم ميرسر ، هايدي إس سميث) وموظفي البحث (خاصة روبرت بيرد ، مايكل س. فولك ، دونا كوباي ، جون إم أوربان ، يوتاكا ياماموتو) لضبط بروتوكولات التربية. تم تقديم التعليمات الأولية حول رعاية B. coprophila من قبل هيلين ف. كروس ، وناتاليا غابروسفيتش غارسيا ، وريبا إم جودمان ، وتشارلز دبليو ميتز ، وإلين راش. مع الامتنان ليوكيكو ياماشيتا وآن دبليو كيريبروك لتوليهما مركز أسهم Bradysia (Sciara). الكثير من التقدير للأشخاص التالية أسماؤهم لإعدادهم المفيد للشخصيات: بريان ويجمان (الشكل 1) ، جون إم أوربان (الشكل 4 اللوحة العلوية) ، لورا روس (الشكل 4 اللوحة السفلية) ، يوتاكا ياماموتو (الشكل 5 اللوحة اليسرى) ، ليو كادوتا (الشكل 7 والشكل 8). شكرا جزيلا لآفا فيليس ومختبر جامعة براون متعدد التخصصات لمساعدتهم في التصوير الفوتوغرافي والتصوير. شكرا لروبرت بيرد على تعليقاته على هذه المخطوطة. تم دعم أبحاثنا وصيانتها ل B. coprophila من قبل المعاهد الوطنية للصحة و NSF ، بما في ذلك أحدث دعم من GM121455 المعاهد الوطنية للصحة إلى SAG يتوفر مزيد من التفاصيل حول B. coprophila على مواقع مركز Bradysia (Sciara) Stock Center (https://sites.brown.edu/sciara/ و https://sciara.wi.mit.edu) التي يتم إنشاؤها حاليا.

&lt;i&gt;Bradysia coprophila&lt;/i&gt; Lab Protocols and Chromosomal Research

ليس لدى صاحب البلاغ أي تضارب في المصالح للإعلان.

ستكون البروتوكولات المقدمة هنا لتربية B. coprophila مفيدة للعلماء الذين يرغبون في رفع هذا الكائن الحي في مختبراتهم لإجراء تجارب للتعمق في خصائصه البيولوجية الفريدة. تم استخدام الوصف الأولي لطريقة التغذية باستخدام الخميرة ومسحوق الفطر المرشوش على قاعدة أجار للحفاظ على B. coprophila29 في مختبر ميتز لتربية 14 نوعا مختلفا من الذباب Sciarid5. في وقت لاحق ، لوحظ أن إضافة نبات القراص و / أو مسحوق السبانخ زاد من حيوية B. coprophila (Gabrusewycz-Garcia ، التواصل الشخصي). وقد نجحت هذه الطرق في الحفاظ على الأنواع ذات الصلة داخل عائلة Sciaridae ، بما في ذلك Bradysia impatiens و Lycoriella ingenua الموجودة حاليا في الاستزراع (روبرت بيرد ، التواصل الشخصي).
تمت تجربة طرق أخرى (مثل طرق التغذية البديلة الموضحة أدناه) لرفع B. coprophila ، ولكن تم تحسين البروتوكولات الموضحة هنا للحصول على أفضل نسبة من اليرقات لكل مساحة سطح من أجار للحصول على البالغين الأكثر خصوبة من الدهون وتقليل نمو العفن. لتوسيع النطاق ، يمكن إجراء التزاوج الجماعي في قوارير زجاجية كما هو موضح في البروتوكول 2 أعلاه. بدلا من ذلك ، يمكن وضع عدد قليل (2-4) من الإناث البالغات مع ضعف عدد الذكور البالغين في قارورة مثل تلك المستخدمة لرفع ذبابة الفاكهة (يمكن التخلص منها 6 أونصات = 177.4 مل زجاجة بولي بروبيلين ذبابة الفاكهة ذات القاع المربع). في كلتا الحالتين ، يجب أن يكون الباحث واثقا تماما من أن القارورة تحتوي فقط على جميع الإناث المنتجات أو جميع الأمهات المنتجات الذكور.
إطعام اليرقات فقط لأن الشرانق والبالغين لا يأكلون. لا تطعم القارورة إذا تحولت اليرقات إلى الشرانق (علامة على ذلك عندما تظهر أول ذباب بالغ مبكر الظهور). بمجرد إغلاق البالغين ، ضع القوارير في حاضنة أكثر برودة (على سبيل المثال ، 16 درجة مئوية) إذا كانت متوفرة لأن هذا سيسمح للبالغين بالعيش لفترة أطول. قم بالتغذية ثلاث مرات في الأسبوع (على سبيل المثال ، الاثنين والأربعاء والجمعة) ، مما يزيد من كمية الطعام المعطاة لكل قارورة مع تقدم اليرقات في السن. إطعام بسخاء ، وسوف تكافأ مع البالغين الدهون الخصبة. ومع ذلك ، إذا كنت تتغذى كثيرا ، فسيظهر العفن الأبيض وهذه علامة لتقليل كمية الطعام التي تودعها في قارورة. علاوة على ذلك ، إذا كنت تتغذى أكثر من اللازم ، فسوف تتطور وسادة سميكة من الطعام فوق الآجار وتجعل من الصعب على البالغين الظهور (يمكنك إزالة الوسادة بالملقط ، ولكن احرص على عدم إخراج اليرقات باستخدام الوسادة - من الأفضل عدم القيام بذلك على الإطلاق). تحتاج القوارير التي تحتوي على عدد قليل من اليرقات (التي تحمل علامة "قليلة") إلى طعام أقل. إذا كنت تتغذى قليلا جدا ، فإن اليرقات ستتسلق جدران القارورة بحثا عن الطعام. تؤدي اليرقات التي تعاني من نقص التغذية إلى بالغين صغار أقل خصوبة.
طرق التغذية البديلة تمت محاولة مجموعة متنوعة من الطرق لتغذية اليرقات مرة واحدة فقط خلال مرحلة اليرقات بدلا من 3 مرات في الأسبوع. لن تنمو B. coprophila على طعام نمط ذبابة الفاكهة . حاول جون أوربان (اتصال شخصي) خلط طعام B. coprophila مع الأجار ، لكن الكثير من العفن نما. وجد أن إضافة اثنين من مثبطات العفن (tegosept وحمض البروبيونيك) في تركيبة وبشكل منفصل ، وتجربة عدة تركيزات مختلفة ، كانت جميعها سامة ل B. coprophila عند مستويات تمنع العفن. يجب أن يكون الآجار درجة الحموضة 6-7 (محايد) حيث يمرض B. coprophila عند درجة الحموضة الحمضية (كما هو الحال مع حمض البروبيانيك). بدلا من ذلك ، لتجنب التغذية ثلاث مرات أسبوعيا ، حاول استخدام ملعقة أو حقنة بدون إبرة لتوزيع معجون خميرة سميك (خميرة ريد ستار الجافة النشطة الممزوجة بقليل من الماء المقطر لترطيبها) كدمية فوق الآجار في كل قارورة بعد أسبوع واحد من التزاوج (أي في الوقت الذي ستبدأ فيه اليرقات في الظهور).
هناك طريقة أخرى لتجنب التغذية الأسبوعية ثلاث مرات وهي إضافة ثقافة حية من الفطريات إلى كل قارورة. أفاد Bath and Sponsler37 أن سطح أجار مائل مع وسط Sabouraud يجب أن يكون مخططا بزراعة فطرية من أجناس Chaetoconidia (الأفضل) أو Baplosporangia أو Xllescheria. نمت الفطريات قبل عدة أيام إلى أسبوع واحد من إدخال B. coprophila . لم تكن هناك حاجة للتغذية بعد هذا. كما تم استخدام متغير من هذه الطريقة من قبل إلين راش (التواصل الشخصي). في أيدينا ، كانت القوارير مبللة جدا بهذه الطريقة وغرقت اليرقات ، ولكن يمكن تجربتها مرة أخرى لتحسين عدد اليرقات بالنسبة للقوارير مع الفطريات الحية.
حقق آرثر فورير (التواصل الشخصي) بعض النجاح في تربية B. coprophila بنفس الطريقة التي يطير بها طائر الكركي38. مع هذا النهج ، تم تربية الشرانق على الورق المعجن الرطب. بعد ذلك ، تم تزاوج البالغين وتم إيداع البيض على الورق المعجن الرطب الطازج. تم الاحتفاظ باليرقات الناتجة على الورق المعجن في أطباق بتري وتغذيتها بأوراق نبات القراص المسحوق مرتين في الأسبوع. تم وضع الشرانق في قفص لتكرار الدورة.
حاولت Yukiko Yamashita (التواصل الشخصي) دون نجاح تربية B. coprophila على التربة ، محاكيا الظروف التي توجد فيها في الطبيعة في أصص النباتات والدفيئات ذات الرطوبة العالية. ومع ذلك ، يمكن أن يصبح العفن مشكلة عند رفع مستوى الرطوبة. ومع ذلك ، فقد تم استخدام التربة الرطبة بنجاح لتربية يرقات Pseudolycoriella (Bradysia سابقا) hygida في صناديق بلاستيكية ذات تربة رطبة. يتم تغذيتها بأوراق Ilex paraguariensis المتحللة ، وتستكمل في أواخر حياة اليرقات بمستخلص الخميرة بنسبة 1.2٪ ، 1.4٪ نشا الذرة ، 0.8٪ دقيق الشوفان ، 1.2٪ أجار12. وبالمثل ، يمكن استبدال التربة الرطبة بطحلب الخث الرطب مع الفاصوليا المسحوقة لرفع الذباب Sciarid 39,40.
ومع ذلك ، تم استخدام طرق أخرى للحفاظ على المزارع المختبرية لبراديسيا: (أ) البطاطس المعقمة التي تضاف إليها الخميرة وسماد الدمالمجفف 41 ؛ (ii) السماد42،43،44 الذي يمكن إضافة الدم المجفف إليه45 ؛ (iii) حاويات بلاستيكية مع ضمادات قطنية ومناشف ورقية مبللة مع فول الصويا المطحون46.
العث يمكن نقل العث من ذبابة الفاكهة إلى B. coprophila. لتقليل ذلك ، من الأفضل الاحتفاظ ب B. coprophila في حاضنة أو غرفة منفصلة ، وليس بالقرب من مخزون ذبابة الفاكهة . علاوة على ذلك ، قم بأي أعمال صيانة B. coprophila في وقت مبكر من اليوم قبل التعامل مع ذبابة الفاكهة. يمكن أيضا نقل العث إلى B. coprophila من النباتات المنزلية ، لذلك لا تحتفظ بالنباتات في نفس الغرفة مثل B. coprophila. إذا غزت العث القوارير ، فيمكن رؤيتها ككائنات كروية بيضاء صغيرة تزحف على جسم B. coprophila. لا يمكن استخدام المعالجات الكيميائية التي تعمل على تدمير العث في ذبابة الفاكهة ل B. coprophila لأن المواد الكيميائية تقتل B. coprophila (B. coprophila حساسة أيضا للأبخرة العضوية مثل الفينول). العلاج الوحيد لتخليص مخزون B. coprophila من العث هو جمع الأجنة يدويا على صفيحة أجار ، وفحص كل منها لعدم وجود عث ، ثم نقلها إلى قوارير أجار طازجة باستخدام فرشاة طلاء دقيقة. تساعد سدادات الشاش المملوءة بالقطن وقشور رغوة أسيتات السليلوز (كما هو مستخدم في قوارير البولي بروبيلين ذبابة الفاكهة ) على منع دخول العث إلى القوارير.
فائدة بروتوكولات التربية ستمكن البروتوكولات الموصوفة هنا مجتمع العلماء المتنامي من تربية B. coprophila ككائن نموذجي جديد / قديم ناشئ لدراسة سماته البيولوجية الفريدة. يتم تشجيع مجموعات المختبرات الجديدة على الانضمام إلى المجتمع المتنامي للحفاظ على السمات البيولوجية الفريدة ل Bradysia (Sciara) والتحقيق فيها.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar (bacteriological)</td>
			<td>U.S. Biological</td>
			<td>A0930</td>
			<td>https://www.usbio.net;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 FlyStuff Foot Pedal</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 FlyStuff Blowgun</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>54-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 FlyStuff UltimaterFlypad</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-172</td>
			<td>https://www.geneseesci.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ether fume hood</td>
			<td>Labconco&#160;</td>
			<td>3955220</td>
			<td>Sits on top of lab bench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160; &#160;</td>
			<td>&#160; &#160;</td>
			<td>&#160; &#160;</td>
			<td>Filter replacement&#160; cat # 6961300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food: Brewer&#8217;s Yeast Powder</td>
			<td>Solgar</td>
			<td>&#160; &#160;</td>
			<td>Obtain from Amazon or health food store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160; &#160;</td>
			<td>&#160; &#160;</td>
			<td>&#160; &#160;</td>
			<td>https://www.solgar.com;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food: Nettle Powder&#160; (pesticide free)</td>
			<td>Starwest Botanicals</td>
			<td>209460-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food: Shitake Mushrooms (pesticide free)</td>
			<td>Starwest Botanicals</td>
			<td>202127-5</td>
			<td>https://www.starwest-botanicals.com;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food: Spinach Powder ( pesticide free)</td>
			<td>Starwest Botanicals</td>
			<td>209583-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food: Straw (pesticide free )</td>
			<td>Starwest Botanicals</td>
			<td>209465-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jar: clear glass, polypropylene lid</td>
			<td>Fisher Scientific:</td>
			<td>FB02911765</td>
			<td>73 mm dia, 89 mm ht (240 ml) 
			https://www.fishersci.com;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Probe, wooden handle</td>
			<td>US Geo Supply Inc</td>
			<td>SKU: 4190</td>
			<td>5.75&#8221; long probe, 
			stainless steel needle 
			https://usgeosupply.com; (970)-434-3708</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vials: glass, preferred:</td>
			<td>Wilmad LabGlass</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wilmad-glass custom vials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>28-33 mm inner dia, 33 mm outer dia, 9.5 cm ht 
			Wilmad: https://www.SP-WilmadLabglass.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vials: glass (cheaper and ok)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-339-26H</td>
			<td>29 mm outer dia, 9.5 cm h 
			&#160;https://www.fishersci.com;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vials: glass (a bit narrow)&#160;</td>
			<td>Genesee Scientific&#160;</td>
			<td>32-201</td>
			<td>24.5 mm outer dia,9.5 cm h 
			thttps://www.geneseesci.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vials: polypropylene&#160;</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-114</td>
			<td>28.5 mm outer dia,9.5 cm ht</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial Plugs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>roll of non-absorbent cotton</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-456881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cheesecloth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-055053</td>
			<td>https://www.fishersci.com;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laboratory maintenance of the lower dipteran fly bradysia (sciara) coprophila: a new/old emerging model organism

تم الحفاظ على المخزونات المختبرية لذبابة dipteran السفلى ، Bradysia (Sciara) coprophila ، لأكثر من قرن. يتم عرض بروتوكولات الصيانة المختبرية ل B. coprophila هنا. وستكون هذه البروتوكولات مفيدة للعدد المتزايد بسرعة من المختبرات التي تدرس B. coprophila للاستفادة من سماتها البيولوجية الفريدة، والتي تشمل (1) مغزل أحادي القطب في الانقسام الاختزالي الذكري الأول؛ و (2) مغزل أحادي القطب في الانقسام الاختزالي الذكري الأول؛ و (2) مغزل أحادي القطب في الانقسام الاختزالي الذكري الأول؛ و (2) مغزل أحادي القطب في الانقسام الاختزالي الذكري الأول؛ و (2) مغزل أحادي القطب في الانقسام الاختزالي الذكري الأول؛ و (2) مغزل أحادي القطب في (2) عدم انفصال ثنائي X في الانقسام الاختزالي الذكري II ؛ (3) بصمة الكروموسوم لتمييز الأم عن المتماثلات الأبوية ؛ (4) كروموسومات محدودة الخط الجرثومي (L) ؛ (5) إزالة الكروموسومات (كروموسومات الأب في الانقسام الاختزالي الذكري الأول ؛ واحد إلى اثنين من الكروموسومات X في الأجنة المبكرة ؛ كروموسومات L من سوما في الأجنة المبكرة) ؛ (6) تحديد الجنس من قبل الأم (لا يوجد كروموسوم Y) ؛ و (7) تضخيم الحمض النووي المنظم تنمويا في مواقع نفخة الحمض النووي في كروموسومات بوليتين الغدد اللعابية اليرقية. 
أصبح من الممكن الآن استكشاف هذه الميزات الفريدة العديدة لميكانيكا الكروموسومات باستخدام التطورات الحديثة في تسلسل وتجميع جينوم B. coprophila وتطوير منهجية التحول للهندسة الجينومية. سيستفيد المجتمع العلمي المتنامي الذي يستخدم B. coprophila للبحث من البروتوكولات الموصوفة هنا لتزاوج الذباب (علامات النمط الظاهري للأمهات اللواتي سيكون لديهن أبناء فقط أو بنات فقط ؛ تفاصيل التزاوج الجماعي للتجارب الكيميائية الحيوية) ، وفحص فقس الجنين ، وتغذية اليرقات ، وغيرها من التعليقات على تربيتها.

A complete understanding of biological principles requires the study of many diverse organisms spanning the Tree of Life. Although a broad range of organisms were described through the end of the 19th century, by the middle of the 20th century experimental studies became restricted to a handful of less than a dozen model organisms. With the advent of the genomic era and the goal to sequence genomes from all species in the Tree of Life1, we are now in a position to expand the types of organisms being used for laboratory experiments and to reap the advantage of their diversity. Such expansion of emerging model organisms for experiments has a prerequisite of being able to maintain them in the laboratory. Here, protocols are described for rearing one such emerging new/old model organism.
The majority of animal life on Earth is accounted for by four super-radiations of Insects2. Within the Insects, there are about 158,000 species of Diptera (true flies)3, with about 3000 species in the family Sciaridae (black fungus gnats)4. The fruitfly Drosophila is the most thoroughly studied of the Dipteran flies. The lower Dipteran fly (Nematocera), Bradysia (previously called Sciara) coprophila, diverged 200 million years ago from Drosophila, which is a &#34;higher Dipteran&#34; fly (Brachycera). Therefore, B. coprophila is in a favorable taxonomic position for comparative studies with D. melanogaster (Figure 1). Moreover, B. coprophila has many unique biological features that are worthy of study in their own right5,6,7. Many of these features disobey the rule of DNA constancy in which all cells of an organism have the same DNA content. In B. coprophila, (i) the paternal genome is eliminated on a monopolar spindle in male meiosis I; (ii) there is non-disjunction of the X dyad in male meiosis II; (iii) germ line-limited (L) chromosomes are eliminated from the soma; and (iv) one or two X chromosomes are eliminated in the early embryo depending on the sex of the individual. Chromosome imprinting to distinguish maternal from paternal homologs was first discovered in B. coprophila and is at play for many of these chromosome elimination events. In addition to chromosome elimination, another bypass of DNA constancy occurs via developmentally regulated, locus-specific DNA amplification at the DNA puff loci in larval salivary gland polytene chromosomes. Studies of these unique features require laboratory maintenance of B.coprophila; details of its husbandry are presented here to facilitate such studies.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig01v3.jpg" /> 
Figure 1: Phylogeny of Bradysia (Sciara) coprophila. Popular model organisms are indicated in blue font and their taxonomic order in red font. Bradysia and other Sciarid fungus gnats as well as mosquitoes are lower dipteran flies (formerly, suborder Nematocera), whereas Drosophila species are higher dipteran flies (suborder: Brachysera). Information on the left side of the figure is from Misof et al.33; information on the right side is from Bertone et al.34 and Wiegmann et al.2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
Previously, the genus Sciara had the largest number (700) of species for any eukaryote, prompting Steffan to subdivide them8. Subsequently, Shin proposed that the Sciaridae family be subdivided into the subfamily Sciarinae (with six genera including Sciara, Trichosia, and Leptosciarella), the subfamiliy Megalosphyinae (including the genus Bradysia) and three other groups (including Pseudolycoriella)9. The phylogeny of the Sciaridae has been studied further by several groups in recent years9,10,11. Over the past several decades, the names of many organisms in the Sciaridae family have changed12. Although most of the literature spanning more than a century refers to the organism that we study as Sciara coprophila, its current taxonomic name is now Bradysia coprophila (syn. Bradysia tilicola and other synonyms)10. They are found worldwide and are commonly known as fungus gnats since they eat mushrooms and other fungi. They were first described in 1804 by Meigen13 in Europe and subsequently by Johannsen14,15 in North America. B. coprophila was collected at Cold Spring Harbor Laboratory and laboratory stocks were established by Charles Metz in the early 1900s when he was a graduate student at Columbia University with Thomas Hunt Morgan. Thus, the current stocks reflect a century of inbreeding. Similarly, the biology of B. coprophila was further elucidated by decades of cytogenetic studies by Helen Crouse (who did her Ph.D. work with Barbara McClintock).
In the 1930s, Bradysia (Sciara) competed with Drosophila melanogaster as a model system for genetic studies. Despite its many unique biological features, B. coprophila was eclipsed by D. melanogaster as a popular model organism since radiation-induced phenotypic mutations were needed for genetic studies and were easier to achieve in the latter, even though B. coprophila is only slightly more resistant to gamma irradiation than D. melanogaster16. In the modern era of genomics, this is no longer a concern. Since the genome sequence17,18,19 (Urban, Gerbi, and Spradling, data not shown) and methods for transformation20,21 (Yamamoto and Gerbi, data not shown) for B. coprophila have recently become available, the time is now ripe to utilize it as a new/old emerging model system, as seen by the growing community of scientists that have adopted it for their research. This article describes procedures for its laboratory maintenance.
B. coprophila lacks a Y chromosome, and the sex of the offspring is determined by the mother. Females that have the X&#39; (&#34;X-prime&#34;) chromosome with a long paracentric inversion will have only daughters, whereas females that are homozygous for the standard (non-inverted) X chromosome will have only sons5 (Figure 2). Sequence information is available for the X&#39; chromosome19, but the molecular mechanism remains to be elucidated on how the X&#39; chromosome determines that offspring will be females. Males never have the X&#39; chromosome, and after fertilization, females are X&#39;X (heterozygous for the X&#39;) or XX. Adult X&#39;X females can be distinguished from XX females by phenotypic markers on the wing (Figure 3). X&#39;X females (who will have only daughters) can be recognized by the dominant Wavy (W) wing marker on the X&#39; (as in the HoLo2 stock)22. Alternatively, XX females (who will have only sons) can be recognized by the recessive petite (p) wing marker on the X as in the 91S stock23. In this case, X&#39;Xp females will have full-length (not petite) wings and will have only daughters. The stock 6980 carries a recessive marker on the X chromosome for swollen (sw) veins24, as well as the dominant marker Wavy on the X&#39;, allowing two markers for selection for crosses. The degree of expression of Wavy can vary and seems weaker in overcrowded vials where food is limiting or if the temperature becomes too warm. The Wavy wing phenotype is exceptionally strong if larvae are kept in the cold room (4&#176;-8 &#176;C) instead of the usual 21 &#176;C. Although the recessive petite wing marker is not variable and is very easy to identify, 91S stocks are used less frequently since they are less healthy than the HoLo2 stock. The B. coprophila mating schemes are presented here (Figure 2), and described in detail for the HoLo2, 7298, and W14 stocks (Supplemental File 1), the 91S stock (Supplemental File 1), the 6980 stock (Supplemental File 1), and the translocation stocks (Supplemental File 1). The translocation stocks are no longer extant; they were reciprocal translocations of heterochromomeres (H1, H2, and H3) on the short arm of the X that contains the ribosomal RNA genes25,26,27.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig02.jpg" /> 
Figure 2: Mating scheme for B. coprophila. This organism has no Y chromosome (the male soma has a single X); mothers determine the sex of their offspring. XX mothers have only sons and X&#39;X females have only daughters. The X&#39; chromosome has a long paracentric inversion when compared to the X chromosome. The paternal or maternal lineage of the X (or X&#39;) chromosome is denoted by blue or red, respectively, in this figure. Sperm are haploid for the autosomes but have two copies of the X chromosome due to non-disjunction in meiosis II. The somatic lineage of early embryos eliminates one or two copies of the paternally derived X if they will be female or male, respectively. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig02large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig03.jpg" /> 
Figure 3: Wing phenotypes of B. coprophila. Adult female flies are shown with various wing phenotypes: (A) straight-wing (XX), (B) Wavy wing (X&#39;WX), (C) extreme Wavy wing (X&#39;WX) phenotype that has a shriveled appearance after storing larvae in the cold room, (D) petite wing (XpXp) that is vestigial-like, (E) straight wing with wildtype (XX) and not swollen veins, (F) straight wing with swollen veins (XswXsw) where small bubbles (black arrows) appear on the upper edge of the wing and/or near the tip of both wings, (G) extreme example of swollen where a blister (white arrow) occurs on one or both wings. Males lack the X&#39; chromosome and therefore will never have Wavy wings, but they have petite or swollen wings in the 91S stock or 6980 stock, respectively. Scale bar = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig03large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
The goal in stock maintenance is to perform crosses where half the crosses are from female-producing mothers and half the crosses from male-producing mothers to have equal numbers of female and male adults in the next generation for subsequent crosses. However, this also involves planning since the life cycle for males is shorter than for females and adult males emerge up to a week before adult females. Nature accommodates for this asynchrony between the sexes by having the male embryos emerge as larvae 1-2 days after the female larvae from a cross on the same date. However, to ensure that male and female adults are available at the same time for laboratory crosses, female development can be somewhat speeded up by leaving vials with female larvae at room temperature rather than at 21 &#176;C or placing vials with male larvae at slightly cooler temperatures (e.g., 16 &#176;C). Another route that is more foolproof is to do crosses with female-producer mothers on Monday and crosses with male-producer mothers on Friday of the same week. The easiest route, which is what we employ, is to perform crosses with female-producer and male-producer mothers on the same day each week and perform crosses on that day in each consecutive week. In that approach, adult females from a cross on week 1 can be mated with adult males that emerged from a cross on week 2.
The life cycle for female B. coprophila is 5 weeks when raised at 21 &#176;C (Table 1). The length of their life cycle is somewhat longer at cooler temperatures or if they are underfed. The life cycle of male B. coprophila is ~4-4.5 weeks since they pupate 0.5-1 week before females. The end of each larval instar is marked by the shedding of the cuticle, which is triggered by a burst in the level of the steroid hormone ecdysone. Unlike D. melanogaster, which has three larval instars, B. coprophila has four larval instars.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Developmental Stage</td>
			<td>Days post mating (dpm)</td>
			<td>Length of stage (days)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg laid</td>
			<td>1-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo</td>
			<td>1-2 to 7-8</td>
			<td>~7 days</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Larva&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Larval instars 1, 2, and 3</td>
			<td>7-8 to 16-19</td>
			<td>~10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4th larval instar pre-eyespot</td>
			<td>16-19 to 21-24</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4th larval instar eye-spot stage</td>
			<td>21-24 to 25-28</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pupa&#160;</td>
			<td>25-28 to 30-33</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adult</td>
			<td colspan="2">lives 1-2 days at 21 &#176;C if mated or lives 2-3 weeks at 16 &#176;C if not mated.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1: Life cycle of female B. coprophila at 21 &#176;C.
B. coprophila can be kept anywhere in the range of 15 &#176;C-25 &#176;C, with development progressing more slowly at cooler temperatures. This insect prefers a humid environment (being found in the soil of houseplants or mushroom beds), so we keep a beaker with deionized water in the incubator. B. coprophila can be kept at room temperature in a metal bread box with a loosely fitting lid and containing a beaker of water, but they go into heat shock at 37 &#176;C28, which is a danger in hot climates. Michael Ashburner and others have tried with little success to store D. melanogaster in the cold to reduce the time needed for stockkeeping. In contrast, a major advantage of B. coprophila is that vials with mid-stage larvae can be stored for up to 3 months on an open shelf in the cold room (4-8 &#176;C) with minimal care of only feeding once a month. They develop extremely slowly in the cold up to the pupal stage and will emerge as fertile adults when the vials are brought back to 21 &#176;C. Presumably, this mimics their overwintering in the wild. This cold-induced developmental stalling might be comparable to that seen after gamma irradiation of mid-stage B. coprophila larvae16, but developmental stalling is not seen in late-stage larvae that have passed the point of no return for their normal developmental progression.

Author Spotlight: Exploring &lt;i&gt;Bradysia coprophila&#039;s&lt;/i&gt; Unique Biology &amp;#8211; A Guide to Laboratory Maintenance

الصيانة المختبرية لذبابة الدبتيران السفلى براديسيا (Sciara) coprophila: كائن نموذجي جديد / قديم ناشئ

أدت البروتوكولات الموصوفة هنا إلى نجاح مثبت في تربية B. coprophila. عندما يتم اختيار البالغين الدهنيين المغلقين مؤخرا للتزاوج (الشكل 4) ، يمكن أن يكون أكثر من 90٪ من الصلبان خصبا وينتج ذرية. يختلف نجاح الخصوبة باختلاف المخزونات (الجدول 2). كان المخزون 7298 (كروموسوم X مع علامة متموجة) هو الأكثر صحة بين الأسهم ولكنه مر بفترة من الانخفاض ، على ما يبدو بسبب تنشيط عناصر الحمض النووي المتنقلة التي أدت إلى إعادة ترتيب الجينوم32. يمثل مخزون HoLo2 سلالة صحية مشتقة من 7298 ، حيث يبدو أن إعادة ترتيب الجينوم قد استقرت ، وقد حلت محل مخزون الوالدين 7298 في مركز المخزون. مخزون HoLo2 هو الذي تم استخدامه لتسلسل جينوم B. coprophila وهو الأكثر استخداما على نطاق واسع من قبل مجموعات المختبرات المختلفة. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام طفرات كريسبر لذباب HoLo2 لإنشاء مخزون W14 مع النمط الظاهري للعين البيضاء لاستخدامه في التحول باستخدام علامات العين الفلورية (Yamamoto و Gerbi ، البيانات غير معروضة). سلالة W14 قوية بشكل استثنائي. مخزون 6980 (الجناح المتموج وعلامات الوريد المنتفخة) أقل قوة إلى حد ما وسهم 91S (علامة الجناح الصغيرة) أقل قوة.
ينتج عن التهجين الناجح أجنة (الشكل 5). تخضع الأجنة للقضاء على كروموسومات X الأبوية المطبوعة في تقسيم الانقسام من7 إلى 9. بالإضافة إلى ذلك ، يتم التخلص من كروموسومات L المحدودة للخط الجرثومي من السلالة الجسدية في الأجنة فيقسم الانقسام من 5 إلى 6. تظهر الأجنة على شكل يرقات، والتي لا ينبغي الخلط بينها وبين العفن الذي قد يكون موجودا أيضا (الشكل 6). تظهر بقع العين (anlage لعيون البالغين) في النصف الثاني منالنجم اليرقي الرابع (الشكل 7). يوفر حجم بقع العين علامة مظهرية ملائمة لبداية وتطور تضخيم نفخة الحمض النووي ، وهو واحد من مثالين معروفين فقط لتضخيم الحمض النووي (الجين) داخل الكروموسومات المنظم بشكل طبيعي والخاص بالموقع. بعد ذلك ، تتطور الشرانق ، ويمكن أن تكون كمية الصبغة التي تملأ عيونهم بمثابة علامة تنموية للانقسام الميوزي الأول والثاني في تكوين المنوية (الشكل 8) بسلوكياتها الكروموسومية الفريدة في هذه الانقسامات.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig04.jpg"> الشكل 4: تزاوج ذباب B. coprophila البالغ. تظهر اللوحة العلوية الأنواع الثلاثة من الذباب البالغ في مخزون HoLo2: الأمهات المنتجات للإناث ذوات الأجنحة المتموجة (الإناث البالغات X'WX) ، والأمهات المنتجات للذكور بأجنحة مستقيمة (XX من الإناث البالغات) ، والذكور ذات الأجنحة المستقيمة (X0 من الذكور البالغين). لاحظ ovipositor مدبب في الطرف الخلفي من الذباب الإناث والمشبك على شكل خطاف في الطرف الخلفي من الذباب الذكر. تظهر اللوحة السفلية تزاوج ذكر وأنثى ، حيث أمسك المشبك الذكر ببيضة الأنثى. سيتم تخزين المنوية في المنوية للإناث وسوف تخصب البويضات عند تصريفها إلى الخارج. طول البالغين 2.0 ملم (ذكور) ، 2.5 ملم (إناث). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig05v2.jpg"> الشكل 5: ب. أجنة كوبروفيلا. اللوحة العلوية اليسرى هي منظر للأجنة باستخدام الضوء القياسي في مجهر تشريح. تظهر النوى في السيتوبلازم المخلوي كنقاط سوداء. تستخدم اللوحة الموجودة على اليمين الفحص المجهري الفلوري لتصور نوى الأجنة الملطخة بيوديد البروبيديوم. يبلغ متوسط طول الأجنة 200 ميكرون ومتوسط عرضها 150 ميكرون. تتجمع نوى الخلايا الجرثومية في القطب الخلفي للجنين كما يظهر في الدورات 6 (يميل الجنين للأمام) ، و 7-9 ، وبعد ذلك تتخللها نوى جسدية. يحدث التخلص من كروموسوم L في السلالة الجسدية في تقسيم الانقسام 5 أو 6 ؛ يحدث التخلص من كروموسوم X في السلالة الجسدية في تقسيم الانقسام7 أو 8 أو 9. يحدث النسيج الخلوي خلال الطور البيني للدورة 11. يوضح الجدول الموجود على اليسار متوسط المدة الزمنية لكل دورة تقسيم عند 22 درجة مئوية. تم تكييف الطاولة الموجودة على اليسار واللوحة الموجودة على اليمين بإذن من de Saint Phalle و Sullivan35. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig06.jpg"> الشكل 6: تظهر أجنة B. coprophila في صورة يرقات. تظهر مجموعة من الأجنة (سهم سميك أزرق) بالقرب من ovipositor للإناث البالغة التي ماتت بعد وضع البيض. بعد أسبوع من وضع البيض ، تصبح الأجنة يرقات شابة ، يشار إلى العديد منها بالأسهم السوداء. اليرقات الناشئة حديثا لها فك أسود في الطرف الأمامي وجسم شفاف. تتحرك فوق سطح أجار ويجب عدم الخلط بينها وبين العفن الذي لا يتحرك. يظهر الجزء الداخلي بعض العفن ، مع خيوط بيضاء (سهم أحمر) وبوغ أسود في طرفه (سهم أخضر) ، وهو أصغر قليلا جدا من اليرقات الناشئة حديثا. شريط المقياس = 1 مم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig06large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig07.jpg"> الشكل 7: مراحل بقعة العين ليرقات B. coprophila . تتشكل بقع العين في الجزء الأمامي من اليرقة ، خلف الفك مباشرة ، وتتكون من حبيبات صبغية يزداد عددها. بقع العين هي anlage للعين البالغة. تظهر اللوحة العلوية اليرقات التي تم تصورها باستخدام مجهر تشريح. اللوحة السفلية عبارة عن منظر مكبرة لبقع العين باستخدام مجهر تباين الطور لتصور يرقة على شريحة مجهرية مع قطرة من الماء المقطر وغطاء يطفو برفق في الأعلى. يتم تسمية مراحل بقعة العين وفقا ل Gabrusewycz-Garcia30 حيث يتم حساب عدد الحبيبات في أطول صف (على سبيل المثال ، 12) ويتم ملاحظة عدد الصفوف الإضافية باستثناء أطول صف (على سبيل المثال ، 6 لمرحلة بقعة العين 12x6). يبدأ بدء تضخيم الحمض النووي الخاص بالموقع في كروموسومات بوليتين الغدد اللعابية في مرحلة بقعة العين 10 × 5 ويكتمل عند 14 × 7 عندما يكون هناك انفجار في النسخ في موضع وتوسع نفث الحمض النووي31. في مرحلة الحافة اللاحقة / الفك المتساقط ، تبدأ حبيبات بقعة العين في الاندماج ، وتتحرك بشكل جانبي بعيدا عن خط الوسط. طول الجسم اليرقات يقصر. علاوة على ذلك ، تتكثف نفث الحمض النووي في هذه المرحلة. يستغرق الأمر حوالي يوم واحد عند 21 درجة مئوية لاجتياز كل مرحلة من مراحل بقعة العين. شريط المقياس = 1 مم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig07large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig08.jpg"> الشكل 8: تطور الشرانق B. coprophila . أثناء التشرد ، تتحلل جميع أنسجة اليرقات باستثناء الجهاز العصبي ويتم استبدالها بأنسجة بالغة تنشأ عن طريق انقسامات الخلايا في الأقراص الوهمية. يتغير لون الجسم من الأبيض إلى الأسمر إلى البني إلى الأسود. الصباغ يملأ تدريجيا في العين العذراء. يحدث الانقسام الاختزالي الأول والثاني في ذكور الشرانق ذات العيون التي تمتلئ بالصباغ36. شريط المقياس = 1 مم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig08large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>اسم السهم</td>
			<td>علامات</td>
			<td>معدل الخصوبة</td>
			<td>التعليقات</td>
		</tr><tr><td>7298</td>
			<td>الجناح المتموج (W)</td>
			<td>~ 75٪</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>هولو 2</td>
			<td>الجناح المتموج (W)</td>
			<td>~ 90٪</td>
			<td>مشتقة من 7298</td>
		</tr><tr><td>دبليو 14</td>
			<td>الجناح المتموج (W) ؛ عيون بيضاء</td>
			<td>~ 95٪</td>
			<td>مشتقة من HoLo2</td>
		</tr><tr><td>6980</td>
			<td>الجناح المتموج (W) ؛ تورم الأوردة (SW)</td>
			<td>~ 65٪</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>91 ثانية</td>
			<td>جناح متموج ضعيف (W) ؛ أجنحة صغيرة (P)</td>
			<td>~ 50٪</td>
			<td>تم تقديم علامة متموجة في صليب لإنقاذ 91S</td>
		</tr></tbody></table>الجدول 2: مخزونات براديسيا (Sciara) coprophila. يسرد الجدول 1 من Gerbi6 هذه العلامات وغيرها التي لم تعد موجودة. تم تلخيص خمسة عمليات نقل (T1 ، T23 ، T29 ، T32 ، T70) في نهاية السنترومير من X27 في الشكل 8 من Gerbi6 ولكنها لم تعد موجودة.
الملف التكميلي 1: الصلبان HoLo2 (و 7298 و W14) ، 91S عبر والإنقاذ ، 6980 تقاطع ، عبور النقل. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/Supplemental%20Materials.zip" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.</a>

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Exploring Bradysia coprophila's Unique Biology: A Guide to Laboratory Maintenance at JoVE.com

توضح هذه الورقة الصيانة المختبرية (بما في ذلك التزاوج والتغذية) لذبابة الدبتيران السفلى Bradysia (Sciara) coprophila.

Laboratory stocks of the lower dipteran fly, Bradysia (Sciara) coprophila, have been maintained for over a century. Protocols for laboratory upkeep of B. ...

نحافظ على ذبابة dipteran السفلية ، Bradysia ، والمعروفة أيضا باسم Sciara coprophila لدراسة بعض خصائصها البيولوجية الفريدة التي تشمل المغزل أحادي القطب وعدم انفصال x-dyad في الانقسام الاختزالي ، وبصمة الكروموسوم ، والكروموسومات الخاصة بالخط الجرثومي ، والقضاء على الكروموسوم ، وتحديد جنس الأم ، وتضخيم الحمض النووي في نفث الحمض النووي للكروموسوم الملوث. في مختبرنا ، طور يوتاكا ياماموتو منهجية للتحول الجيني لبراديسيا كوبروفيلا. علاوة على ذلك ، تم توفير نسخة هذا الكائن الحي ، وتم تسلسل جينومه وتجميعه بواسطة جون أوربان.تتيح هذه الاختراقات استكشاف البيولوجيا الفريدة ل Bradysia coprophila. نحن نشجعك على الانضمام إلى مجتمع العلماء المتنامي لمعالجة الخصائص الفريدة ل Bradysia coprophila. ستوضح نتائجك الآليات الجزيئية ذات الأهمية الأساسية لبيولوجيا الخلية والتطور.ستكون بروتوكولات التربية المعروضة هنا بمثابة برنامج تعليمي للحفاظ على Bradysia coprophila في مختبرك الخاص.

laboratory-maintenance-lower-dipteran-fly-bradysia-sciara-coprophila

Research

JoVE Journal

Biology

Laboratory Maintenance of the Lower Dipteran Fly Bradysia (Sciara) coprophila: A New/Old Emerging Model Organism

582 Views.  Brown University. نحافظ على ذبابة dipteran السفلية ، Bradysia ، والمعروفة أيضا باسم Sciara coprophila لدراسة بعض خصائصها البيولوجية الفريدة التي تشمل المغزل أحادي القطب وعدم انفصال x-dyad في الانقسام الاختزالي ، وبصمة الكروموسوم ، والكروموسومات الخاصة بالخط الجرثومي ، والقضاء على الكروموسوم ، وتحديد جنس ال?...

Video: Author Spotlight: Exploring Bradysia coprophila's Unique Biology &#8211; A Guide to Laboratory Maintenance

Laboratory stocks of the lower dipteran fly, Bradysia (Sciara) coprophila, have been maintained for over a century. Protocols for laboratory upkeep of B. coprophila are presented here. These protocols will be useful for the rapidly increasing number of laboratories studying B. coprophila to take advantage of its unique biological features, which include (1) a monopolar spindle in male meiosis I; (2) non-disjunction of the X dyad in male meiosis II; (3) chromosome imprinting to distinguish maternal from paternal homologs; (4) germ line-limited (L) chromosomes; (5) chromosome elimination (paternal chromosomes in male meiosis I; one to two X chromosomes in early embryos; L chromosomes from the soma in early embryos); (6) sex determination by the mother (there is no Y chromosome); and (7) developmentally regulated DNA amplification at the DNA puff loci in larval salivary gland polytene chromosomes. 
It is now possible to explore these many unique features of chromosome mechanics by using the recent advances in sequencing and assembly of the B. coprophila genome and the development of transformation methodology for genomic engineering. The growing scientific community that uses B. coprophila for research will benefit from the protocols described here for mating the flies (phenotypic markers for mothers that will have only sons or only daughters; details of mass mating for biochemical experiments), checking embryo hatch, feeding larvae, and other comments on its rearing.

This paper outlines the laboratory maintenance (including mating and feeding) of the lower dipteran fly Bradysia (Sciara) coprophila.

Maintenance and Rearing of Bradysia (Sciara) coprophila Larvae in a Laboratory Setup

To set up the mating crosses, place the Bradysia coprophila adult male flies on a white fly pad. Use fine tipped forceps to gently pick up the fattest adult by its middle or hind leg. Then place the anesthetized adult female flies on a white fly pad.Using fine tipped forceps, pick up an adult female by its hind leg. One day after mating, push the wings of the anesthetized adult females into 2.2%agar in a Petri plate. Once all the female flies are impaled on the agar, gently squeeze the thorax with forceps.The female will lay a cluster of fertilized eggs within 30 to 60 minutes. Use a dissecting microscope to score the newly emerged larvae. Observe the inch worm-like motion of the newly emerged larvae as they crawl on the surface of the 2.2%agar.After removing the vial plug, examine the vial for the age and number of larvae. Pick up some straw between the second and third fingers or between the thumb and second fingers, and rotate the fingers against each other to deposit the appropriate amount of straw into the vial. On the same day that the larvae emerged, or up to two days later, sprinkle in a tiny bit of food that has been poured into a small bowl for easier access, and replace the gauze plug.For one week old larvae, add more food to just cover the surface of the agar and replace the gauze plug. For the two week old larvae, sprinkle in a generous amount of food to cover the agar surface and replace the gauze plug. Once the larvae attain the late fourth instar stage and begin to pupate, add a generous amount of food on the agar surface.Stop feeding once adults begin to emerge. Do not feed vials with adult flies and do not remove the gauze plug. If there is white mold in the vial, use 70%ethanol on a laboratory wipe to clean a long metal probe.Insert the clean probe into the vial to tap down the mold on the surface of the agar. Then clean the probe with a laboratory wipe dampened with 70%ethanol before storing or using it on another vial. Add only a small amount of food without disturbing the top of the agar, and replace the plug.