תודה מיוחדת לשומרי המניות הקודמים של B. coprophila (ג'ייקוב א. בליס, פאולה בונזינגה, אן ו. קרברוק, אינגריד מ. מרסר, היידי ס. סמית') ולאנשי המחקר (במיוחד רוברט ביירד, מייקל ס. פולק, דונה קובאי, ג'ון מ. אורבן, יוטאקה ימאמוטו) על כוונון עדין של פרוטוקולי הגידול. הוראות ראשוניות לטיפול ב- B. coprophila ניתנו על ידי הלן ו. קרוס, נטליה גברוסביץ'-גרסיה, רבה מ. גודמן, צ'ארלס מץ ואלן ראש. בהכרת תודה ליוקיקו ימאשיטה ואן ו. קרברוק על שלקחו על עצמם את מרכז המניות Bradysia (Sciara). הערכה רבה לאנשים הבאים על הכנת האיורים המועילה שלהם: בריאן ויגמן (איור 1), ג'ון מ. אורבן (פאנל עליון באיור 4), לורה רוס (פאנל תחתון באיור 4), יוטאקה ימאמוטו (פאנל שמאלי באיור 5), ליאו קדוטה (איור 7 ואיור 8). תודה רבה לאווה פיליס ולמעבדה הרב-תחומית של אוניברסיטת בראון על עזרתם בצילום ובצילום. תודה לרוברט ביירד על הערות על כתב היד הזה. המחקר והתחזוקה שלנו של B. coprophila נתמכים על ידי NIH ו- NSF, כולל התמיכה האחרונה של NIH GM121455 ל- S.A.G. פרטים נוספים על B. coprophila זמינים באתרי Bradysia (Sciara) Stock Center (https://sites.brown.edu/sciara/ ו-https://sciara.wi.mit.edu) הנמצאים כעת בבנייה.

&lt;i&gt;Bradysia coprophila&lt;/i&gt; Lab Protocols and Chromosomal Research

למחבר אין ניגודי עניינים להצהיר.

הפרוטוקולים המוצגים כאן לגידול של B. coprophila יהיו שימושיים עבור מדענים המעוניינים לגדל את האורגניזם הזה במעבדות שלהם לניסויים כדי להתעמק בתכונות הביולוגיות הייחודיות שלו. התיאור הראשוני של שיטת ההאכלה באמצעות אבקת שמרים ופטריות שפוזרו על בסיס אגר כדי לשמור על B. coprophila29 שימש במעבדת מץ לגידול 14 מינים שונים של זבובי Sciarid5. לאחר מכן, נצפה כי תוספת של סרפד ו / או אבקת תרד הגבירה עוד יותר את החיוניות של B. coprophila (Gabrusewycz-Garcia, תקשורת אישית). שיטות אלה נחלו הצלחה לתחזוקת מינים קרובים במשפחת Sciaridae, כולל Bradysia impatiens ו - Lycoriella ingenua הנמצאים כיום בתרבות (Robert Baird, Personal Communication).
שיטות אחרות (כגון שיטות ההזנה החלופיות המתוארות להלן) נוסו לגדל B. coprophila, אך הפרוטוקולים המתוארים כאן עברו אופטימיזציה כדי לקבל את היחס הטוב ביותר של זחלים לכל שטח פנים של אגר כדי להשיג את הבוגרים השמנים הפוריים ביותר ולמזער את צמיחת העובש. כדי להגדיל את קנה המידה, הזדווגות המונית יכולה להיעשות בבקבוקוני זכוכית כמתואר בפרוטוקול 2 לעיל. לחלופין, ניתן להניח כמה נקבות בוגרות (2-4) יחד עם פי שניים זכרים בוגרים בבקבוק כמו זה המשמש לגידול דרוזופילה (בקבוק פוליפרופילן חד פעמי 6 אונקיות = 177.4 מ"ל תחתון מרובע דרוזופילה ). בשני המקרים, על החוקר להיות בטוח לחלוטין שהבקבוק מכיל רק את כל הנקבות-המפיקה או את כל האימהות היצרניות-גבריות.
רק להאכיל את הזחלים מאז הגלמים והמבוגרים לא אוכלים. אין להאכיל את הבקבוקון אם הזחלים הפכו לגלמים (סימן לכך הוא כאשר מופיעים הזבובים הבוגרים הראשונים המוקדמים). ברגע שהמבוגרים מתקרבים, הכניסו את הבקבוקונים לאינקובטור קריר יותר (למשל, 16 מעלות צלזיוס) אם זמין, מכיוון שזה יאפשר למבוגרים לחיות זמן רב יותר. האכילו שלוש פעמים בשבוע (למשל, שני, רביעי, שישי), והגדילו את כמות המזון הניתנת לכל בקבוקון ככל שהזחלים מתבגרים. להאכיל בנדיבות, ואתה תהיה מתוגמל עם מבוגרים פוריים שמנים. עם זאת, אם אתה מאכיל יותר מדי, עובש לבן יופיע וזה סימן כדי להפחית את כמות המזון שאתה מפקיד בקבוקון. יתר על כן, אם אתה מאכיל יותר מדי, כרית עבה של מזון תתפתח על גבי האגר ותקשה על הבוגרים לצאת (אתה יכול להסיר את הפד עם מלקחיים, אבל להיזהר לא להוציא זחלים עם כרית - עדיף לא צריך לעשות את זה בכלל). בקבוקונים עם מעט זחלים (מסומנים "מעטים") זקוקים לפחות מזון. אם אתה מאכיל מעט מדי, הזחלים יטפסו על קירות הבקבוקון בחיפוש אחר מזון. זחלים שאינם ניזונים מספיק גורמים למבוגרים קטנים שהם פחות פוריים.
שיטות הזנה חלופיות מגוון שיטות נוסו להאכיל את הזחלים רק פעם אחת בשלב הזחל ולא 3 פעמים בשבוע. B. coprophila לא יגדל על מזון בסגנון Drosophila . ג'ון אורבן (תקשורת אישית) ניסה לערבב מזון B. coprophila עם אגר, אבל יותר מדי עובש גדל. הוא מצא כי הוספת שני מעכבי עובש (tegosept וחומצה פרופיונית) בשילוב ובבנפרד, תוך ניסיון מספר ריכוזים שונים, היו כולם רעילים ל-B. coprophila ברמות המעכבות עובש. האגר צריך להיות pH 6-7 (נייטרלי) כמו B. coprophila מקבל חולה ב pH חומצי (כמו עם חומצה propianic). לחלופין, כדי לייתר שלוש פעמים האכלה בשבוע, הוא ניסה להשתמש במרית או מזרק ללא מחט כדי לפזר משחת שמרים סמיכה (שמרים יבשים פעילים של הכוכב האדום מעורבבים עם מעט מים מזוקקים כדי להרטיב אותם) כבובה על גבי האגר בכל בקבוקון שבוע לאחר ההזדווגות (כלומר, בערך בזמן שהזחלים יתחילו לצאת).
שיטה נוספת להימנע מהאכלה שלוש פעמים בשבוע היא להוסיף תרבית חיה של פטריות לכל בקבוקון. Bath and Sponsler37 דיווחו כי משטח אגר משופע עם המדיום של Sabouraud צריך להיות מפוספס עם תרבית פטרייתית של הסוג Chaetoconidia (הטוב ביותר) או אחרת Baplosporangia או Xllescheria. הפטרייה גודלה מספר ימים עד שבוע לפני הופעת B. coprophila . לא היה צורך בהאכלה לאחר מכן. גרסה של שיטה זו הופעלה גם על ידי אלן רש (תקשורת אישית). בידינו, הבקבוקונים היו רטובים מדי בשיטה זו והזחלים טבעו, אך ניתן היה לנסות שוב לייעל את מספר הזחלים ביחס לבקבוקונים עם פטריות חיות.
ארתור פורר (תקשורת אישית) זכה להצלחה מסוימת בגידול B. coprophila באותו אופן כמו עגור זבובים38. בגישה זו גידלו את הגלמים על עיסת נייר לחה. לאחר מכן, הבוגרים הזדווגו והביצים הופקדו על עיסת נייר טרייה ולחה. הזחלים שנוצרו הוחזקו על עיסת נייר בצלחות פטרי והוזנו באבקת עלי סרפד פעמיים בשבוע. הגלמים הוכנסו לכלוב כדי לחזור על המחזור.
יוקיקו ימאשיטה (תקשורת אישית) ניסתה ללא הצלחה לגדל B. coprophila על הקרקע, מחקה את התנאים שבהם הם נמצאים בטבע בעציצים וחממות עם לחות גבוהה. עם זאת, עובש יכול להפוך לבעיה כאשר רמת הלחות עולה. עם זאת, אדמה לחה שימשה בהצלחה לגידול זחלי היגידה Pseudolycoriella (בעבר Bradysia) בקופסאות פלסטיק עם אדמה לחה; הם ניזונים מעלי Ilex paraguariensis מפורקים, בתוספת חיי הזחל המאוחרים עם 1.2% תמצית שמרים, 1.4% עמילן תירס, 0.8% קמח שיבולת שועל, 1.2% אגר12. באופן דומה, ניתן להחליף את האדמה הלחה בטחב כבול לח בשעועית כליה כתושה כדי לגדל זבובי Sciarid39,40.
שיטות אחרות ננקטו כדי לשמור על תרביות מעבדה של Bradysia: (i) תפוח אדמה אוטוקלאבי שאליו מוסיפים שמרים ודשן דם מיובש41; (2) זבל 42,43,44 שניתן להוסיף לו דם מיובש45; (3) מכלי פלסטיק עם רפידות כותנה ומגבות נייר לחות עם פולי סויה טחונים46.
קרדית קרדית יכולה להיות מועברת מ Drosophila כדי B. coprophila. כדי למזער זאת, עדיף לשמור את B. coprophila בחממה נפרדת או בחדר, לא קרוב למניות Drosophila . יתר על כן, בצע כל עבודת תחזוקה של B. coprophila מוקדם ביום לפני הטיפול בדרוזופילה. קרדית יכולה גם להיות מועברת ל - B. coprophila מצמחי בית, לכן אין לשמור צמחים באותו חדר כמו B. coprophila. אם קרדית פולשת לבקבוקונים, ניתן לראות אותם כאורגניזמים כדוריים לבנים קטנים הזוחלים על גופו של B. coprophila. טיפולים כימיים הפועלים להשמדת קרדית בדרוזופילה אינם יכולים לשמש עבור B. coprophila מכיוון שהכימיקלים הורגים B. coprophila (B. coprophila רגיש גם לנדפים אורגניים כגון פנול). הטיפול היחיד להיפטר ממלאי קרדית B. coprophila הוא לאסוף ידנית את העוברים על צלחת אגר, לבדוק כל אחד מהם להיעדר קרדית, ולאחר מכן להעביר אותם לבקבוקוני אגר טריים באמצעות מברשת צבע עדינה. פקקי גזה מלאים כותנה ופלוגי קצף אצטט תאית (כפי שמשמשים בקבוקוני פוליפרופילן דרוזופילה ) שניהם מסייעים למנוע את כניסתן של קרדיות לבקבוקונים.
התועלת של פרוטוקולי הגידול הפרוטוקולים המתוארים כאן יאפשרו לקהילה ההולכת וגדלה של מדענים לגדל את B. coprophila כאורגניזם מודל מתפתח חדש/ישן כדי לחקור את תכונותיו הביולוגיות הייחודיות. קבוצות מעבדה חדשות מוזמנות להצטרף לקהילה ההולכת וגדלה כדי לשמר ולחקור את המאפיינים הביולוגיים הייחודיים של Bradysia (Sciara).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar (bacteriological)</td>
			<td>U.S. Biological</td>
			<td>A0930</td>
			<td>https://www.usbio.net;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 FlyStuff Foot Pedal</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 FlyStuff Blowgun</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>54-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 FlyStuff UltimaterFlypad</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-172</td>
			<td>https://www.geneseesci.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ether fume hood</td>
			<td>Labconco&#160;</td>
			<td>3955220</td>
			<td>Sits on top of lab bench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160; &#160;</td>
			<td>&#160; &#160;</td>
			<td>&#160; &#160;</td>
			<td>Filter replacement&#160; cat # 6961300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food: Brewer&#8217;s Yeast Powder</td>
			<td>Solgar</td>
			<td>&#160; &#160;</td>
			<td>Obtain from Amazon or health food store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160; &#160;</td>
			<td>&#160; &#160;</td>
			<td>&#160; &#160;</td>
			<td>https://www.solgar.com;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food: Nettle Powder&#160; (pesticide free)</td>
			<td>Starwest Botanicals</td>
			<td>209460-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food: Shitake Mushrooms (pesticide free)</td>
			<td>Starwest Botanicals</td>
			<td>202127-5</td>
			<td>https://www.starwest-botanicals.com;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food: Spinach Powder ( pesticide free)</td>
			<td>Starwest Botanicals</td>
			<td>209583-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food: Straw (pesticide free )</td>
			<td>Starwest Botanicals</td>
			<td>209465-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jar: clear glass, polypropylene lid</td>
			<td>Fisher Scientific:</td>
			<td>FB02911765</td>
			<td>73 mm dia, 89 mm ht (240 ml) 
			https://www.fishersci.com;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Probe, wooden handle</td>
			<td>US Geo Supply Inc</td>
			<td>SKU: 4190</td>
			<td>5.75&#8221; long probe, 
			stainless steel needle 
			https://usgeosupply.com; (970)-434-3708</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vials: glass, preferred:</td>
			<td>Wilmad LabGlass</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wilmad-glass custom vials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>28-33 mm inner dia, 33 mm outer dia, 9.5 cm ht 
			Wilmad: https://www.SP-WilmadLabglass.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vials: glass (cheaper and ok)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-339-26H</td>
			<td>29 mm outer dia, 9.5 cm h 
			&#160;https://www.fishersci.com;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vials: glass (a bit narrow)&#160;</td>
			<td>Genesee Scientific&#160;</td>
			<td>32-201</td>
			<td>24.5 mm outer dia,9.5 cm h 
			thttps://www.geneseesci.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vials: polypropylene&#160;</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-114</td>
			<td>28.5 mm outer dia,9.5 cm ht</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial Plugs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>roll of non-absorbent cotton</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-456881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cheesecloth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-055053</td>
			<td>https://www.fishersci.com;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laboratory maintenance of the lower dipteran fly bradysia (sciara) coprophila: a new/old emerging model organism

מלאי מעבדה של זבוב הדיפטרן התחתון, Bradysia (Sciara) coprophila, נשמר במשך יותר ממאה שנה. פרוטוקולים לתחזוקת מעבדה של B. coprophila מוצגים כאן. פרוטוקולים אלה יהיו שימושיים עבור המספר הגדל במהירות של מעבדות החוקרות B. coprophila לנצל את התכונות הביולוגיות הייחודיות שלו, הכוללות (1) ציר מונופולרי במיוזה הגברית I; (2) אי-ניתוק של הדיאדה X במיוזה הגברית II; (3) הטבעה כרומוזומלית כדי להבדיל בין הומולוגים אימהיים לאבהיים; (4) כרומוזומים מוגבלי קו נבט (L); (5) חיסול כרומוזומים (כרומוזומים אבהיים במיוזה הגברית I; כרומוזומי X אחד או שניים בעוברים מוקדמים; כרומוזומי L מהסומה בעוברים מוקדמים); (6) קביעת מין על ידי האם (אין כרומוזום Y); ו-(7) הגברת DNA מווסתת התפתחותית במוקדי נשיפה של DNA בכרומוזומי פוליטן של בלוטת הרוק הזחלית. 
כיום ניתן לחקור תכונות ייחודיות רבות אלה של מכניקת הכרומוזומים באמצעות ההתקדמות האחרונה בריצוף והרכבה של גנום B. coprophila ופיתוח מתודולוגיית טרנספורמציה להנדסה גנומית. הקהילה המדעית ההולכת וגדלה המשתמשת ב-B. coprophila למחקר תפיק תועלת מהפרוטוקולים המתוארים כאן להזדווגות הזבובים (סמנים פנוטיפיים לאימהות שיהיו להן רק בנים או רק בנות; פרטים על הזדווגות המונית לניסויים ביוכימיים), בדיקת בקיעת עוברים, האכלת זחלים והערות אחרות על גידולו.

A complete understanding of biological principles requires the study of many diverse organisms spanning the Tree of Life. Although a broad range of organisms were described through the end of the 19th century, by the middle of the 20th century experimental studies became restricted to a handful of less than a dozen model organisms. With the advent of the genomic era and the goal to sequence genomes from all species in the Tree of Life1, we are now in a position to expand the types of organisms being used for laboratory experiments and to reap the advantage of their diversity. Such expansion of emerging model organisms for experiments has a prerequisite of being able to maintain them in the laboratory. Here, protocols are described for rearing one such emerging new/old model organism.
The majority of animal life on Earth is accounted for by four super-radiations of Insects2. Within the Insects, there are about 158,000 species of Diptera (true flies)3, with about 3000 species in the family Sciaridae (black fungus gnats)4. The fruitfly Drosophila is the most thoroughly studied of the Dipteran flies. The lower Dipteran fly (Nematocera), Bradysia (previously called Sciara) coprophila, diverged 200 million years ago from Drosophila, which is a &#34;higher Dipteran&#34; fly (Brachycera). Therefore, B. coprophila is in a favorable taxonomic position for comparative studies with D. melanogaster (Figure 1). Moreover, B. coprophila has many unique biological features that are worthy of study in their own right5,6,7. Many of these features disobey the rule of DNA constancy in which all cells of an organism have the same DNA content. In B. coprophila, (i) the paternal genome is eliminated on a monopolar spindle in male meiosis I; (ii) there is non-disjunction of the X dyad in male meiosis II; (iii) germ line-limited (L) chromosomes are eliminated from the soma; and (iv) one or two X chromosomes are eliminated in the early embryo depending on the sex of the individual. Chromosome imprinting to distinguish maternal from paternal homologs was first discovered in B. coprophila and is at play for many of these chromosome elimination events. In addition to chromosome elimination, another bypass of DNA constancy occurs via developmentally regulated, locus-specific DNA amplification at the DNA puff loci in larval salivary gland polytene chromosomes. Studies of these unique features require laboratory maintenance of B.coprophila; details of its husbandry are presented here to facilitate such studies.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig01v3.jpg" /> 
Figure 1: Phylogeny of Bradysia (Sciara) coprophila. Popular model organisms are indicated in blue font and their taxonomic order in red font. Bradysia and other Sciarid fungus gnats as well as mosquitoes are lower dipteran flies (formerly, suborder Nematocera), whereas Drosophila species are higher dipteran flies (suborder: Brachysera). Information on the left side of the figure is from Misof et al.33; information on the right side is from Bertone et al.34 and Wiegmann et al.2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
Previously, the genus Sciara had the largest number (700) of species for any eukaryote, prompting Steffan to subdivide them8. Subsequently, Shin proposed that the Sciaridae family be subdivided into the subfamily Sciarinae (with six genera including Sciara, Trichosia, and Leptosciarella), the subfamiliy Megalosphyinae (including the genus Bradysia) and three other groups (including Pseudolycoriella)9. The phylogeny of the Sciaridae has been studied further by several groups in recent years9,10,11. Over the past several decades, the names of many organisms in the Sciaridae family have changed12. Although most of the literature spanning more than a century refers to the organism that we study as Sciara coprophila, its current taxonomic name is now Bradysia coprophila (syn. Bradysia tilicola and other synonyms)10. They are found worldwide and are commonly known as fungus gnats since they eat mushrooms and other fungi. They were first described in 1804 by Meigen13 in Europe and subsequently by Johannsen14,15 in North America. B. coprophila was collected at Cold Spring Harbor Laboratory and laboratory stocks were established by Charles Metz in the early 1900s when he was a graduate student at Columbia University with Thomas Hunt Morgan. Thus, the current stocks reflect a century of inbreeding. Similarly, the biology of B. coprophila was further elucidated by decades of cytogenetic studies by Helen Crouse (who did her Ph.D. work with Barbara McClintock).
In the 1930s, Bradysia (Sciara) competed with Drosophila melanogaster as a model system for genetic studies. Despite its many unique biological features, B. coprophila was eclipsed by D. melanogaster as a popular model organism since radiation-induced phenotypic mutations were needed for genetic studies and were easier to achieve in the latter, even though B. coprophila is only slightly more resistant to gamma irradiation than D. melanogaster16. In the modern era of genomics, this is no longer a concern. Since the genome sequence17,18,19 (Urban, Gerbi, and Spradling, data not shown) and methods for transformation20,21 (Yamamoto and Gerbi, data not shown) for B. coprophila have recently become available, the time is now ripe to utilize it as a new/old emerging model system, as seen by the growing community of scientists that have adopted it for their research. This article describes procedures for its laboratory maintenance.
B. coprophila lacks a Y chromosome, and the sex of the offspring is determined by the mother. Females that have the X&#39; (&#34;X-prime&#34;) chromosome with a long paracentric inversion will have only daughters, whereas females that are homozygous for the standard (non-inverted) X chromosome will have only sons5 (Figure 2). Sequence information is available for the X&#39; chromosome19, but the molecular mechanism remains to be elucidated on how the X&#39; chromosome determines that offspring will be females. Males never have the X&#39; chromosome, and after fertilization, females are X&#39;X (heterozygous for the X&#39;) or XX. Adult X&#39;X females can be distinguished from XX females by phenotypic markers on the wing (Figure 3). X&#39;X females (who will have only daughters) can be recognized by the dominant Wavy (W) wing marker on the X&#39; (as in the HoLo2 stock)22. Alternatively, XX females (who will have only sons) can be recognized by the recessive petite (p) wing marker on the X as in the 91S stock23. In this case, X&#39;Xp females will have full-length (not petite) wings and will have only daughters. The stock 6980 carries a recessive marker on the X chromosome for swollen (sw) veins24, as well as the dominant marker Wavy on the X&#39;, allowing two markers for selection for crosses. The degree of expression of Wavy can vary and seems weaker in overcrowded vials where food is limiting or if the temperature becomes too warm. The Wavy wing phenotype is exceptionally strong if larvae are kept in the cold room (4&#176;-8 &#176;C) instead of the usual 21 &#176;C. Although the recessive petite wing marker is not variable and is very easy to identify, 91S stocks are used less frequently since they are less healthy than the HoLo2 stock. The B. coprophila mating schemes are presented here (Figure 2), and described in detail for the HoLo2, 7298, and W14 stocks (Supplemental File 1), the 91S stock (Supplemental File 1), the 6980 stock (Supplemental File 1), and the translocation stocks (Supplemental File 1). The translocation stocks are no longer extant; they were reciprocal translocations of heterochromomeres (H1, H2, and H3) on the short arm of the X that contains the ribosomal RNA genes25,26,27.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig02.jpg" /> 
Figure 2: Mating scheme for B. coprophila. This organism has no Y chromosome (the male soma has a single X); mothers determine the sex of their offspring. XX mothers have only sons and X&#39;X females have only daughters. The X&#39; chromosome has a long paracentric inversion when compared to the X chromosome. The paternal or maternal lineage of the X (or X&#39;) chromosome is denoted by blue or red, respectively, in this figure. Sperm are haploid for the autosomes but have two copies of the X chromosome due to non-disjunction in meiosis II. The somatic lineage of early embryos eliminates one or two copies of the paternally derived X if they will be female or male, respectively. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig02large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig03.jpg" /> 
Figure 3: Wing phenotypes of B. coprophila. Adult female flies are shown with various wing phenotypes: (A) straight-wing (XX), (B) Wavy wing (X&#39;WX), (C) extreme Wavy wing (X&#39;WX) phenotype that has a shriveled appearance after storing larvae in the cold room, (D) petite wing (XpXp) that is vestigial-like, (E) straight wing with wildtype (XX) and not swollen veins, (F) straight wing with swollen veins (XswXsw) where small bubbles (black arrows) appear on the upper edge of the wing and/or near the tip of both wings, (G) extreme example of swollen where a blister (white arrow) occurs on one or both wings. Males lack the X&#39; chromosome and therefore will never have Wavy wings, but they have petite or swollen wings in the 91S stock or 6980 stock, respectively. Scale bar = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig03large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
The goal in stock maintenance is to perform crosses where half the crosses are from female-producing mothers and half the crosses from male-producing mothers to have equal numbers of female and male adults in the next generation for subsequent crosses. However, this also involves planning since the life cycle for males is shorter than for females and adult males emerge up to a week before adult females. Nature accommodates for this asynchrony between the sexes by having the male embryos emerge as larvae 1-2 days after the female larvae from a cross on the same date. However, to ensure that male and female adults are available at the same time for laboratory crosses, female development can be somewhat speeded up by leaving vials with female larvae at room temperature rather than at 21 &#176;C or placing vials with male larvae at slightly cooler temperatures (e.g., 16 &#176;C). Another route that is more foolproof is to do crosses with female-producer mothers on Monday and crosses with male-producer mothers on Friday of the same week. The easiest route, which is what we employ, is to perform crosses with female-producer and male-producer mothers on the same day each week and perform crosses on that day in each consecutive week. In that approach, adult females from a cross on week 1 can be mated with adult males that emerged from a cross on week 2.
The life cycle for female B. coprophila is 5 weeks when raised at 21 &#176;C (Table 1). The length of their life cycle is somewhat longer at cooler temperatures or if they are underfed. The life cycle of male B. coprophila is ~4-4.5 weeks since they pupate 0.5-1 week before females. The end of each larval instar is marked by the shedding of the cuticle, which is triggered by a burst in the level of the steroid hormone ecdysone. Unlike D. melanogaster, which has three larval instars, B. coprophila has four larval instars.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Developmental Stage</td>
			<td>Days post mating (dpm)</td>
			<td>Length of stage (days)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg laid</td>
			<td>1-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo</td>
			<td>1-2 to 7-8</td>
			<td>~7 days</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Larva&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Larval instars 1, 2, and 3</td>
			<td>7-8 to 16-19</td>
			<td>~10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4th larval instar pre-eyespot</td>
			<td>16-19 to 21-24</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4th larval instar eye-spot stage</td>
			<td>21-24 to 25-28</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pupa&#160;</td>
			<td>25-28 to 30-33</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adult</td>
			<td colspan="2">lives 1-2 days at 21 &#176;C if mated or lives 2-3 weeks at 16 &#176;C if not mated.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1: Life cycle of female B. coprophila at 21 &#176;C.
B. coprophila can be kept anywhere in the range of 15 &#176;C-25 &#176;C, with development progressing more slowly at cooler temperatures. This insect prefers a humid environment (being found in the soil of houseplants or mushroom beds), so we keep a beaker with deionized water in the incubator. B. coprophila can be kept at room temperature in a metal bread box with a loosely fitting lid and containing a beaker of water, but they go into heat shock at 37 &#176;C28, which is a danger in hot climates. Michael Ashburner and others have tried with little success to store D. melanogaster in the cold to reduce the time needed for stockkeeping. In contrast, a major advantage of B. coprophila is that vials with mid-stage larvae can be stored for up to 3 months on an open shelf in the cold room (4-8 &#176;C) with minimal care of only feeding once a month. They develop extremely slowly in the cold up to the pupal stage and will emerge as fertile adults when the vials are brought back to 21 &#176;C. Presumably, this mimics their overwintering in the wild. This cold-induced developmental stalling might be comparable to that seen after gamma irradiation of mid-stage B. coprophila larvae16, but developmental stalling is not seen in late-stage larvae that have passed the point of no return for their normal developmental progression.

Author Spotlight: Exploring &lt;i&gt;Bradysia coprophila&#039;s&lt;/i&gt; Unique Biology &amp;#8211; A Guide to Laboratory Maintenance

תחזוקת מעבדה של זבוב הדיפטרן התחתון Bradysia (Sciara) coprophila: אורגניזם מודל מתפתח חדש/ישן

הפרוטוקולים המתוארים כאן הובילו להצלחה מוכחת בגידול B. coprophila. כאשר בוגרים שמנים שנסגרו לאחרונה נבחרים להזדווגות (איור 4), יותר מ-90% מהצלבים יכולים להיות פוריים ולהניב צאצאים. הצלחת הפוריות משתנה בין מניות שונות (טבלה 2). סטוק 7298 (כרומוזום X עם סמן גלי) היה הבריא ביותר מבין המניות אך עבר תקופה של ירידה, ככל הנראה בשל הפעלת אלמנטים ניידים של DNA שיצרו סידור מחדש של הגנום32. מניית HoLo2 מייצגת זן בריא שמקורו ב-7298, שם ככל הנראה התייצבו סידורי הגנום, והוא החליף את מלאי האב 7298 במרכז המניות. מלאי HoLo2 הוא זה ששימש לריצוף הגנום של B. coprophila והוא זה שנמצא בשימוש הנרחב ביותר על ידי קבוצות מעבדה שונות. לאחרונה, מוטגנזה CRISPR של זבובי HoLo2 שימשה ליצירת מלאי W14 עם פנוטיפ עין לבנה שישמש לשינוי עם סמני עיניים פלואורסצנטיים (ימאמוטו וג'רבי, הנתונים לא מוצגים). זן W14 חזק במיוחד. מניית ה-6980 (כנף גלית וסמני ורידים נפוחים) מעט פחות חזקה ומניית ה-91S (סמן כנף קטנה) חזקה עוד פחות.
הצלבות מוצלחות יוצרות עוברים (איור 5). עוברים עוברים חיסול של כרומוזומי X האבהיים המוטבעים בחלוקתהמחשוף 7 עד 9. בנוסף, כרומוזומי L מוגבלים בקו הנבט מסולקים מהשושלת הסומטית בעוברים בחלוקת המחשוף ה-5 עד ה-6. העוברים מופיעים כזחלים, שאין לבלבל אותם עם עובש שגם הוא עשוי להיות נוכח (איור 6). כתמי עיניים (אנלאז' לעיניים הבוגרות) מופיעים במחצית השנייה של כוכב הזחלהרביעי (איור 7). גודל כתמי העיניים מספק סמן פנוטיפי נוח להתחלה ולהתקדמות של הגברת נשיפה של DNA, שהיא אחת משתי דוגמאות ידועות בלבד להגברה טבעית של DNA תוך-כרומוזומלי ספציפי לאתר (גן) מווסת התפתחותית. לאחר מכן, הגלמים מתפתחים, וכמות הפיגמנט הממלאת את עיניהם יכולה לשמש סמן התפתחותי למיוזה I ו-II בזרע (איור 8) עם התנהגויות הכרומוזומים הייחודיות שלו בחטיבות אלה.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig04.jpg"> איור 4: הזדווגות של זבובי B. coprophila בוגרים. הפאנל העליון מציג את שלושת סוגי הזבובים הבוגרים במלאי HoLo2: אמהות מייצרות נקבות עם כנפיים גליות (X'WX נקבות בוגרות), אמהות מייצרות זכרים עם כנפיים ישרות (XX נקבות בוגרות), וזכרים עם כנפיים ישרות (X0 זכרים בוגרים). שימו לב לאוביפוזיטור המחודד בקצה האחורי של נקבת הזבובים ולקלספר בצורת קרס בקצה האחורי של הזבובים הזכרים. הפאנל התחתון מראה הזדווגות של זכר ונקבה, כאשר הקלספר הזכר תפס את האוביפוזיטור של הנקבה. הזרע יישמר בזרע של הנקבה ויפרה את הביציות עם שחרורן החוצה. אורך הבוגרים הוא 2.0 מ"מ (זכרים), 2.5 מ"מ (נקבות). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig05v2.jpg"> איור 5: עוברי B. coprophila . הפאנל השמאלי העליון הוא מבט על עוברים באמצעות אור סטנדרטי במיקרוסקופ מנתח; הגרעינים בציטופלסמה הסינסיטיאלית מופיעים כנקודות שחורות. הפאנל מימין משתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להמחיש את גרעיני הפרופידיום המוכתמים ביודיד של עוברים. אורכם הממוצע של העוברים הוא 200 מיקרון ורוחבם הממוצע 150 מיקרון. גרעיני תאי הנבט מתקבצים בקוטב האחורי של העובר כפי שנראה במחזורים 6 (עובר מוטה קדימה), ו-7-9, שלאחריהם הם משולבים בגרעינים סומטיים. חיסול כרומוזום L בשושלת הסומטית מתרחש בחלוקת מחשוף 5 או 6; חיסול כרומוזום X בשושלת הסומטית מתרחש בחלוקת המחשוףה-7,ה-8 אוה-9 . צלולריזציה מתרחשת במהלך שלב הביניים של מחזור 11. הטבלה משמאל מציגה את משך הזמן הממוצע עבור כל מחזור חלוקה ב- 22 °C (75 °F). השולחן משמאל והפאנל מימין מותאמים באישור דה סנט פאל וסאליבן35. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig06.jpg"> איור 6: עוברי B. coprophila מופיעים כזחלים. מקבץ עוברים (חץ כחול עבה) נראה ליד האוביפוזיטור של הנקבה הבוגרת שמתה לאחר הטלת ביצים. שבוע לאחר הטלת הביצים, העוברים הופכים לזחלים צעירים, שחלקם מסומנים על ידי החיצים השחורים. לזחלים החדשים יש לסת שחורה בקצה הקדמי וגוף שקוף. הם נעים על גבי משטח האגר ואין לבלבל אותם עם עובש שאינו זז. השיבוץ מראה מעט עובש, עם חוט להט לבן (חץ אדום) ונבג שחור בקצהו (חץ ירוק), והוא קטן מעט מאוד מהזחלים שזה עתה הופיעו. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig06large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig07.jpg"> איור 7: שלבי כתמי עיניים של זחלי B. coprophila . כתמי עיניים נוצרים בחלק הקדמי של הזחל, ממש מאחורי הלסת, והם מורכבים מגרגירי פיגמנט שמספרם גדל. כתמי העיניים הם האנלאז' לעין הבוגרת. הפאנל העליון מראה זחלים שהודמיינו במיקרוסקופ מנתח; הלוח התחתון הוא תצוגה מוגדלת של כתמי העיניים באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה כדי לדמיין זחל על מגלשת מיקרוסקופ עם טיפת מים מזוקקים וכיסוי צף קלות על גבי. המינוח של שלבי כתמי העין הוא על פי Gabrusewycz-Garcia30 שבו מספר הגרגירים נספר בשורה הארוכה ביותר (למשל, 12) ומספר השורות הנוספות למעט השורה הארוכה ביותר מצוין (למשל, 6 עבור שלב כתמי העין 12x6). התחלת הגברה של DNA ספציפי לאתר בכרומוזומי הפוליטן של בלוטת הרוק מתחילה בשלב 10x5 ומסתיימת בשעה 14x7 כאשר יש פרץ של שעתוק במיקום והתפשטות של נשיפות ה- DNA31. בשלב הבא של עין הקצה / לסת שנפלה, גרגרי כתמי העין מתחילים להתמזג, והם נעים לרוחב מקו האמצע; אורך גוף הזחל מתקצר. יתר על כן, נשיפות הדנ"א מתעבות בשלב זה. זה לוקח בערך יום אחד ב 21 ° C כדי לחצות כל שלב כתמי העין. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig07large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig08.jpg"> איור 8: התפתחות גלמי B. coprophila . במהלך הגור, כל רקמות הזחל עוברות היסטוליזה למעט מערכת העצבים ומוחלפות ברקמות בוגרות הנובעות מחטיבות תאים של הדיסקים הדמיוניים. צבע הגוף משתנה מלבן לשזוף לחום לשחור. פיגמנט בהדרגה ממלא את עין הגולם; מיוזה I ו- II מופיעות בגלמים זכרים עם עיניים בגודל 1/4 עד 1/2 מלאות בפיגמנט36. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig08large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>שם המניה</td>
			<td>סמנים</td>
			<td>שיעור הפריון</td>
			<td>הערות</td>
		</tr><tr><td>7298</td>
			<td>כנף גלית (W)</td>
			<td>~75%</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>HoLo2</td>
			<td>כנף גלית (W)</td>
			<td>~90%</td>
			<td>נגזר מ-7298</td>
		</tr><tr><td>W14</td>
			<td>כנף גלית (W); עיניים לבנות</td>
			<td>~95%</td>
			<td>נגזר מ- HoLo2</td>
		</tr><tr><td>6980</td>
			<td>כנף גלית (W); ורידים נפוחים (SW)</td>
			<td>~65%</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>91 שניות</td>
			<td>כנף גלית חלשה (W); כנפיים קטנות (P)</td>
			<td>~50%</td>
			<td>הסמן הגלי הוצג בצלב כדי להציל 91S</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 2: מניות של Bradysia (Sciara) coprophila. טבלה 1 של ג'רבי6 מפרטת סמנים אלה ואחרים שאינם קיימים עוד. חמש טרנסלוקציות (T1, T23, T29, T32, T70) בקצה הצנטרומר של X27 מסוכמות באיור 8 של ג'רבי6 , אך אינן קיימות עוד.
קובץ משלים 1: הצלבות HoLo2 (ו-7298 ו-W14), צלב והצלה 91S, צלב 6980, צלבי טרנסלוקציה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/Supplemental%20Materials.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Exploring Bradysia coprophila's Unique Biology: A Guide to Laboratory Maintenance at JoVE.com

מאמר זה מתאר את תחזוקת המעבדה (כולל הזדווגות והאכלה) של זבוב הדיפטרן התחתון Bradysia (Sciara) coprophila.

Laboratory stocks of the lower dipteran fly, Bradysia (Sciara) coprophila, have been maintained for over a century. Protocols for laboratory upkeep of B. ...

אנו מתחזקים את זבוב הדיפטרן התחתון, Bradysia, הידוע גם בשם Sciara coprophila כדי לחקור כמה מתכונותיו הביולוגיות הייחודיות הכוללות ציר מונופולרי ואי ניתוק x-dyad במיוזה, הטבעה כרומוזומים, כרומוזומים ספציפיים לתאי נבט, חיסול כרומוזומים, קביעת מין האם והגברת DNA בנשיפות DNA מזהמות של כרומוזומים. במעבדה שלנו, יוטאקה ימאמוטו פיתח מתודולוגיה לשינוי גנומי של Bradysia coprophila. יתר על כן, התעתיק של אורגניזם זה נעשה זמין, והגנום שלו רוצף והורכב על ידי ג'ון אורבן.פריצות דרך אלה מאפשרות לחקור את הביולוגיה הייחודית של Bradysia coprophila. אנו מעודדים אותך להצטרף לקהילה ההולכת וגדלה של מדענים כדי לטפל בתכונות הייחודיות של Bradysia coprophila. התוצאות שלך יבהירו מנגנונים מולקולריים בעלי חשיבות בסיסית לביולוגיה התאית וההתפתחותית.פרוטוקולי הגידול המוצגים כאן ישמשו כהדרכה לשמירה על קופרופילה Bradysia במעבדה שלך.

laboratory-maintenance-lower-dipteran-fly-bradysia-sciara-coprophila

Research

JoVE Journal

Biology

Laboratory Maintenance of the Lower Dipteran Fly Bradysia (Sciara) coprophila: A New/Old Emerging Model Organism

582 Views.  Brown University. אנו מתחזקים את זבוב הדיפטרן התחתון, Bradysia, הידוע גם בשם Sciara coprophila כדי לחקור כמה מתכונותיו הביולוגיות הייחודיות הכוללות ציר מונופולרי ואי ניתוק x-dyad במיוזה, הטבעה כרומוזומים, כרומוזומים ספציפיים לתאי נבט, חיסול כרומוזומים, קביעת מין האם והגברת DNA בנשיפות DNA מזהמות של כרומוזומ?...

Video: Author Spotlight: Exploring Bradysia coprophila's Unique Biology &#8211; A Guide to Laboratory Maintenance

Laboratory stocks of the lower dipteran fly, Bradysia (Sciara) coprophila, have been maintained for over a century. Protocols for laboratory upkeep of B. coprophila are presented here. These protocols will be useful for the rapidly increasing number of laboratories studying B. coprophila to take advantage of its unique biological features, which include (1) a monopolar spindle in male meiosis I; (2) non-disjunction of the X dyad in male meiosis II; (3) chromosome imprinting to distinguish maternal from paternal homologs; (4) germ line-limited (L) chromosomes; (5) chromosome elimination (paternal chromosomes in male meiosis I; one to two X chromosomes in early embryos; L chromosomes from the soma in early embryos); (6) sex determination by the mother (there is no Y chromosome); and (7) developmentally regulated DNA amplification at the DNA puff loci in larval salivary gland polytene chromosomes. 
It is now possible to explore these many unique features of chromosome mechanics by using the recent advances in sequencing and assembly of the B. coprophila genome and the development of transformation methodology for genomic engineering. The growing scientific community that uses B. coprophila for research will benefit from the protocols described here for mating the flies (phenotypic markers for mothers that will have only sons or only daughters; details of mass mating for biochemical experiments), checking embryo hatch, feeding larvae, and other comments on its rearing.

This paper outlines the laboratory maintenance (including mating and feeding) of the lower dipteran fly Bradysia (Sciara) coprophila.

Maintenance and Rearing of Bradysia (Sciara) coprophila Larvae in a Laboratory Setup

To set up the mating crosses, place the Bradysia coprophila adult male flies on a white fly pad. Use fine tipped forceps to gently pick up the fattest adult by its middle or hind leg. Then place the anesthetized adult female flies on a white fly pad.Using fine tipped forceps, pick up an adult female by its hind leg. One day after mating, push the wings of the anesthetized adult females into 2.2%agar in a Petri plate. Once all the female flies are impaled on the agar, gently squeeze the thorax with forceps.The female will lay a cluster of fertilized eggs within 30 to 60 minutes. Use a dissecting microscope to score the newly emerged larvae. Observe the inch worm-like motion of the newly emerged larvae as they crawl on the surface of the 2.2%agar.After removing the vial plug, examine the vial for the age and number of larvae. Pick up some straw between the second and third fingers or between the thumb and second fingers, and rotate the fingers against each other to deposit the appropriate amount of straw into the vial. On the same day that the larvae emerged, or up to two days later, sprinkle in a tiny bit of food that has been poured into a small bowl for easier access, and replace the gauze plug.For one week old larvae, add more food to just cover the surface of the agar and replace the gauze plug. For the two week old larvae, sprinkle in a generous amount of food to cover the agar surface and replace the gauze plug. Once the larvae attain the late fourth instar stage and begin to pupate, add a generous amount of food on the agar surface.Stop feeding once adults begin to emerge. Do not feed vials with adult flies and do not remove the gauze plug. If there is white mold in the vial, use 70%ethanol on a laboratory wipe to clean a long metal probe.Insert the clean probe into the vial to tap down the mold on the surface of the agar. Then clean the probe with a laboratory wipe dampened with 70%ethanol before storing or using it on another vial. Add only a small amount of food without disturbing the top of the agar, and replace the plug.