Besonderer Dank gilt den früheren B . coprophila-Bestandshaltern (Jacob E. Bliss, Paula Bonazinga, Anne W. Kerrebrock, Ingrid M. Mercer, Heidi S. Smith) und dem Forschungspersonal (insbesondere Robert Baird, Michael S. Foulk, Donna Kubai, John M. Urban, Yutaka Yamamoto) für die Feinabstimmung der Haltungsprotokolle. Erste Anweisungen zur Pflege von B. coprophila wurden von Helen V. Crouse, Natalia Gabrusewycz-Garcia, Reba M. Goodman, Charles W. Metz und Ellen Rasch gegeben. Mit Dank an Yukiko Yamashita und Anne W. Kerrebrock für die Übernahme des Lagerzentrums Bradysia (Sciara). Vielen Dank an die folgenden Personen für ihre hilfreiche Vorbereitung der Abbildungen: Brian Wiegmann (Abbildung 1), John M. Urban (Abbildung 4 oben), Laura Ross (Abbildung 4 unteres Bild), Yutaka Yamamoto (Abbildung 5 linkes Bild), Leo Kadota (Abbildung 7 und Abbildung 8). Vielen Dank an Ava Filiss und das Brown University Multidisciplinary Laboratory für ihre Hilfe beim Fotografieren und Filmen. Vielen Dank an Robert Baird für die Kommentare zu diesem Manuskript. Unsere Forschung und Pflege von B. coprophila wurde von NIH und NSF unterstützt, einschließlich der jüngsten Unterstützung durch NIH GM121455 to S.A.G. Weitere Informationen zu B. coprophila finden Sie auf den Websites des Bradysia (Sciara) Stock Centers (https://sites.brown.edu/sciara/ und https://sciara.wi.mit.edu), die sich derzeit im Aufbau befinden.

Bradysia coprophila Lab Protocols and Chromosomal Research

Der Autor hat keine Interessenkonflikte anzugeben.

Die hier vorgestellten Protokolle für die Haltung von B. coprophila werden für Wissenschaftler nützlich sein, die diesen Organismus in ihren Laboratorien für Experimente aufziehen möchten, um seine einzigartigen biologischen Eigenschaften zu erforschen. Die ursprüngliche Beschreibung der Fütterungsmethode mit Hefe und Pilzpulver, die auf eine Agarbasis gestreut wurden, um B. coprophila29 zu erhalten, wurde im Labor in Metz verwendet, um 14 verschiedene Arten von Trauermücken zu züchten5. In der Folge wurde beobachtet, dass die Zugabe von Brennnessel- und/oder Spinatpulver die Vitalität von B. coprophila weiter steigerte (Gabrusewycz-Garcia, persönliche Mitteilung). Diese Methoden haben sich als erfolgreich für die Erhaltung verwandter Arten innerhalb der Familie der Sciaridae erwiesen, einschließlich Bradysia impatiens und Lycoriella ingenua , die sich derzeit in Kultur befinden (Robert Baird, persönliche Mitteilung).
Andere Methoden (wie die unten beschriebenen alternativen Fütterungsmethoden) wurden versucht, um B. coprophila zu züchten, aber die hier beschriebenen Protokolle wurden optimiert, um das günstigste Verhältnis von Larven pro Oberfläche von Agar zu haben, um die fruchtbarsten fettigen adulten Tiere zu erhalten und das Wachstum von Schimmelpilzen zu minimieren. Zur Skalierung kann die Massenpaarung in Glasfläschchen durchgeführt werden, wie in Protokoll 2 oben beschrieben. Alternativ können einige (2-4) erwachsene Weibchen zusammen mit doppelt so vielen erwachsenen Männchen in einen Kolben gegeben werden, wie er zur Aufzucht von Drosophila verwendet wird (Einwegflasche 6 oz. = 177,4 ml Drosophila Polypropylenflasche mit quadratischem Boden). In beiden Fällen muss sich der Forscher sicher sein, dass der Kolben nur alle weiblichen oder alle männlichen Erzeugermütter enthält.
Füttern Sie nur die Larven, da die Puppen und Alttiere nicht fressen. Füttern Sie das Fläschchen nicht, wenn sich die Larven in Puppen verwandelt haben (ein Zeichen dafür ist, wenn die ersten früh schlüpfenden erwachsenen Fliegen erscheinen). Sobald die erwachsenen Tiere sich geschlossen haben, stellen Sie die Fläschchen in einen kühleren Inkubator (z. B. 16 °C), falls verfügbar, da die Erwachsenen so länger leben können. Füttern Sie dreimal pro Woche (z. B. Montag, Mittwoch, Freitag) und erhöhen Sie die Futtermenge pro Fläschchen, wenn die Larven älter werden. Füttern Sie großzügig, und Sie werden mit fetten, fruchtbaren Erwachsenen belohnt. Wenn Sie jedoch zu viel füttern, tritt weißer Schimmel auf, und das ist ein Zeichen dafür, dass Sie die Menge an Futter, die Sie in ein Fläschchen geben, reduzieren sollten. Wenn Sie zu viel füttern, bildet sich außerdem ein dickes Futterpolster auf dem Agar und erschwert es den Erwachsenen, zu schlüpfen (Sie können das Pad mit einer Pinzette entfernen, aber achten Sie darauf, keine Larven mit dem Pad herauszunehmen - es ist am besten, dies überhaupt nicht tun zu müssen). Fläschchen mit wenigen Larven (gekennzeichnet mit "wenigen") benötigen weniger Futter. Wenn Sie zu wenig füttern, klettern die Larven auf der Suche nach Nahrung an den Wänden des Fläschchens. Unterernährte Larven führen zu kleinen adulten Tieren, die weniger fruchtbar sind.
Alternative Fütterungsmethoden Es wurde eine Vielzahl von Methoden ausprobiert, um die Larven nur einmal während des Larvenstadiums zu füttern, anstatt 3 Mal pro Woche. B. coprophila wächst nicht auf Drosophila-artiger Nahrung. John Urban (persönliche Mitteilung) versuchte, B . coprophila-Nahrung mit dem Agar zu mischen, aber es wuchs zu viel Schimmel. Er fand heraus, dass die Zugabe von zwei Schimmelpilzhemmern (Tegosept und Propionsäure) in Kombination und getrennt von verschiedenen Konzentrationen für B. coprophila in Konzentrationen toxisch war, die Schimmelpilze hemmen. Der Agar sollte einen pH-Wert von 6-7 (neutral) haben , da B. coprophila bei einem sauren pH-Wert krank wird (wie bei Propiansäure). Um eine dreimal wöchentliche Fütterung zu vermeiden, versuchte er, mit einem Spatel oder einer Spritze ohne Nadel eine dicke Hefepaste (Red Star aktive Trockenhefe gemischt mit etwas destilliertem Wasser, um sie zu befeuchten) eine Woche nach der Paarung (d. h. etwa zu dem Zeitpunkt, an dem die Larven zu schlüpfen beginnen) als Klecks auf den Agar in jedem Fläschchen zu geben.
Eine andere Methode, um eine dreimal wöchentliche Fütterung zu vermeiden, besteht darin, jedem Fläschchen eine lebende Pilzkultur hinzuzufügen. Bath und Sponsler37 berichteten, dass eine schräge Agaroberfläche mit Sabouraud-Medium mit einer Pilzkultur der Gattungen Chaetoconidia (best) oder auch Baplosporangia oder Xllescheria gestreift werden sollte. Der Pilz wurde mehrere Tage bis eine Woche vor der Einführung von B. coprophila gezüchtet. Danach war keine Fütterung mehr erforderlich. Eine Variante dieser Methode wurde auch von Ellen Rasch (persönliche Mitteilung) eingesetzt. In unseren Händen waren die Fläschchen mit dieser Methode zu nass und die Larven ertranken, aber es konnte noch einmal versucht werden, die Anzahl der Larven im Verhältnis zu den Fläschchen mit lebenden Pilzen zu optimieren.
Arthur Forer (persönliche Mitteilung) hatte einige Erfolge bei der Aufzucht von B. coprophila auf die gleiche Weise wie die Kranichfliege38. Bei diesem Ansatz wurden die Puppen auf feuchtem Pappmaché aufgezogen. Anschließend wurden die erwachsenen Tiere verpaart und die Eier auf frischem, feuchtem Pappmaché abgelegt. Die daraus resultierenden Larven wurden auf Pappmaché in Petrischalen gehalten und zweimal wöchentlich mit pulverisierten Brennnesselblättern gefüttert. Die Puppen wurden in einen Käfig gesteckt, um den Zyklus zu wiederholen.
Yukiko Yamashita (persönliche Mitteilung) hat erfolglos versucht, B. coprophila auf dem Boden zu züchten, indem sie die Bedingungen nachahmt, unter denen sie in der Natur in Topfpflanzen und Gewächshäusern mit hoher Luftfeuchtigkeit vorkommen. Schimmel kann jedoch zu einem Problem werden, wenn die Luftfeuchtigkeit erhöht wird. Nichtsdestotrotz wurde feuchte Erde mit Erfolg verwendet, um Pseudolycoriella (ehemals Bradysia) hygida Larven in Plastikboxen mit feuchter Erde aufzuziehen; Sie werden mit zersetzten Ilex paraguariensis-Blättern gefüttert, die im späten Larvenleben mit 1,2 % Hefeextrakt, 1,4 % Maisstärke, 0,8 % Hafermehl und 1,2 % Agar12 ergänzt werden. Ebenso kann die feuchte Erde durch feuchtes Torfmoos mit zerkleinerten Kidneybohnen ersetzt werden, um Trauermücken zu züchten 39,40.
Wieder andere Methoden wurden angewandt, um Laborkulturen von Bradysia zu erhalten: (i) autoklavierte Kartoffeln, denen Hefe und getrockneter Blutdünger zugesetzt werden41; ii) Gülle 42,43,44, dem getrocknetes Blut zugesetzt werden kann45; iii) Plastikbehälter mit Wattepads und angefeuchtete Papiertücher mit gemahlenen Sojabohnen46.
Milben Milben können von Drosophila auf B. coprophila übertragen werden. Um dies zu minimieren, ist es am besten, B. coprophila in einem separaten Brutkasten oder Raum zu halten, nicht in der Nähe von Drosophila-Beständen. Führen Sie außerdem früh am Tag Wartungsarbeiten für B. coprophila durch, bevor Sie mit Drosophila umgehen. Milben können auch von Zimmerpflanzen auf B. coprophila übertragen werden, halten Sie die Pflanzen also nicht im selben Raum wie B. coprophila. Wenn Milben in die Fläschchen eindringen, kann man sie als kleine weiße kugelförmige Organismen sehen, die auf dem Körper von B. coprophila kriechen. Chemische Behandlungen, die Milben in Drosophila zerstören, können bei B. coprophila nicht angewendet werden, da die Chemikalien B. coprophila abtöten (B. coprophila reagiert auch empfindlich auf organische Dämpfe wie Phenol). Die einzige Behandlung, um die Milbenbestände von B. coprophila zu befreien, besteht darin, die Embryonen manuell auf einer Agarplatte zu sammeln, jeden auf das Fehlen von Milben zu untersuchen und sie dann mit einem feinen Pinsel in frische Agarfläschchen zu übertragen. Mit Baumwolle gefüllte Mullstopfen und Flügel aus Zelluloseacetatschaum (wie sie für Drosophila-Polypropylen-Fläschchen verwendet werden) tragen dazu bei, das Eindringen von Milben in die Fläschchen zu verhindern.
Nützlichkeit der Haltungsprotokolle Die hier beschriebenen Protokolle werden es der wachsenden Gemeinschaft von Wissenschaftlern ermöglichen, B. coprophila als neuen/alten, aufstrebenden Modellorganismus zu züchten, um seine einzigartigen biologischen Eigenschaften zu untersuchen. Neue Laborgruppen werden ermutigt, sich der wachsenden Gemeinschaft anzuschließen, um die einzigartigen biologischen Eigenschaften von Bradysia (Sciara) zu erhalten und zu erforschen.

Ein vollständiges Verständnis der biologischen Prinzipien erfordert das Studium vieler verschiedener Organismen, die den Baum des Lebens umspannen. Obwohl bis zum Ende des 19. Jahrhunderts ein breites Spektrum von Organismen beschrieben wurde, beschränkten sich experimentelle Studien Mitte des 20. Jahrhunderts auf eine Handvoll von weniger als einem Dutzend Modellorganismen. Mit dem Beginn des genomischen Zeitalters und dem Ziel, Genome aller Arten im Baum des Lebens1 zu sequenzieren, sind wir nun in der Lage, die für Laborexperimente verwendeten Organismentypen zu erweitern und die Vorteile ihrer Vielfalt zu nutzen. Eine solche Erweiterung von neu entstehenden Modellorganismen für Experimente setzt voraus, um diese im Labor aufrechterhalten zu können. Hier werden Protokolle für die Aufzucht eines solchen neu entstehenden neuen/alten Modellorganismus beschrieben.
Der Großteil des tierischen Lebens auf der Erde ist auf vier Superstrahlungen von Insekten2 zurückzuführen. Unter den Insekten gibt es etwa 158.000 Arten von Diptera (echte Fliegen)3, davon etwa 3000 Arten in der Familie der Sciaridae (schwarze Trauermücken)4. Die Fruchtfliege Drosophila ist die am gründlichsten untersuchte der Diptera-Fliegen. Die untere zweiflüglerische Fliege (Nematocera), Bradysia (früher Sciara genannt) coprophila, spaltete sich vor 200 Millionen Jahren von Drosophila ab, einer "höheren zweiflüglerischen" Fliege (Brachycera). Daher befindet sich B. coprophila in einer günstigen taxonomischen Position für vergleichende Studien mit D. melanogaster (Abbildung 1). Darüber hinaus weist B. coprophila viele einzigartige biologische Merkmale auf, die für sich genommen eine Untersuchung wert sind 5,6,7. Viele dieser Merkmale verstoßen gegen die Regel der DNA-Konstanz, nach der alle Zellen eines Organismus den gleichen DNA-Gehalt haben. Bei B. coprophila (i) wird das väterliche Genom auf einer monopolaren Spindel in der männlichen Meiose I eliminiert; (ii) es gibt keine Disjunktion der X-Dyade in der männlichen Meiose II; (iii) keimbahnbegrenzte (L) Chromosomen werden aus dem Soma eliminiert; und (iv) je nach Geschlecht des Individuums werden ein oder zwei X-Chromosomen im frühen Embryo eliminiert. Die Chromosomenprägung zur Unterscheidung von mütterlichen und väterlichen Homologen wurde zuerst bei B. coprophila entdeckt und spielt bei vielen dieser Chromosomeneliminierungsereignisse eine Rolle. Neben der Chromosomeneliminierung erfolgt eine weitere Umgehung der DNA-Konstanz durch entwicklungsregulierte, Locus-spezifische DNA-Amplifikation an den DNA-Puff-Loci in den Polyten-Chromosomen der Speicheldrüsen der Larven. Studien zu diesen einzigartigen Merkmalen erfordern eine Laborwartung von B. coprophila; Einzelheiten zu ihrer Haltung werden hier vorgestellt, um solche Studien zu erleichtern.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig01v3.jpg"> Abbildung 1: Phylogenie von Bradysia (Sciara) coprophila. Beliebte Modellorganismen sind in blauer Schrift und ihre taxonomische Reihenfolge in roter Schrift angegeben. Bradysia und andere Trauermücken sowie Stechmücken sowie Stechmücken sind Fliegen der unteren Zwölftel (früher, Unterordnung Nematocera), während Drosophila-Arten Fliegen mit höheren Trauermücken (Unterordnung: Brachysera) sind. Die Informationen auf der linken Seite der Abbildung stammen von Misof et al.33; die Informationen auf der rechten Seite stammen von Bertone et al.34 und Wiegmann et al.2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Zuvor hatte die Gattung Sciara die größte Anzahl (700) Arten aller Eukaryoten, was Steffan dazu veranlasste, siein 8 zu unterteilen. Daraufhin schlug Shin vor, die Familie der Sciaridae in die Unterfamilie Sciarinae (mit sechs Gattungen, darunter Sciara, Trichosia und Leptosciarella), die Unterfamilie Megalosphyinae (einschließlich der Gattung Bradysia) und drei weitere Gruppen (einschließlich Pseudolycoriella)9 zu unterteilen. Die Phylogenie der Sciaridae wurde in den letzten Jahren von mehreren Gruppen weiter untersucht 9,10,11. In den letzten Jahrzehnten haben sich die Namen vieler Organismen aus der Familie der Sciaridae geändert12. Obwohl sich der größte Teil der Literatur über mehr als ein Jahrhundert auf den von uns untersuchten Organismus als Sciara coprophila bezieht, lautet sein aktueller taxonomischer Name jetzt Bradysia coprophila (syn. Bradysia tilicola und andere Synonyme)10. Sie kommen weltweit vor und sind allgemein als Trauermücken bekannt, da sie Pilze und andere Pilze fressen. Sie wurden erstmals 1804 von Meigen13 in Europa und später von Johannsen 14,15 in Nordamerika beschrieben. B. coprophila wurde im Cold Spring Harbor Laboratory gesammelt und Laborbestände wurden von Charles Metz in den frühen 1900er Jahren angelegt, als er Doktorand an der Columbia University bei Thomas Hunt Morgan war. Die aktuellen Bestände spiegeln also ein Jahrhundert der Inzucht wider. In ähnlicher Weise wurde die Biologie von B. coprophila durch jahrzehntelange zytogenetische Studien von Helen Crouse (die ihre Doktorarbeit bei Barbara McClintock machte) weiter aufgeklärt.
In den 1930er Jahren konkurrierte Bradysia (Sciara) mit Drosophila melanogaster als Modellsystem für genetische Studien. Trotz seiner vielen einzigartigen biologischen Eigenschaften wurde B. coprophila von D. melanogaster als beliebter Modellorganismus in den Schatten gestellt, da strahleninduzierte phänotypische Mutationen für genetische Studien erforderlich waren und bei letzterem leichter zu erreichen waren, obwohl B. coprophila nur geringfügig resistenter gegen Gammastrahlung ist als D. melanogaster16. In der modernen Ära der Genomik ist dies kein Problem mehr. Da die Genomsequenz 17,18,19 (Urban, Gerbi und Spradling, Daten nicht gezeigt) und die Transformationsmethoden 20,21 (Yamamoto und Gerbi, Daten nicht gezeigt) für B. coprophila kürzlich verfügbar geworden sind, ist die Zeit nun reif, es als neues/altes aufstrebendes Modellsystem zu nutzen, wie es von der wachsenden Gemeinschaft von Wissenschaftlern gesehen wird, die es für ihre Forschung übernommen haben. In diesem Artikel werden die Verfahren für die Wartung im Labor beschrieben.
B. coprophila fehlt ein Y-Chromosom, und das Geschlecht der Nachkommen wird von der Mutter bestimmt. Weibchen, die das X'-Chromosom ("X-prime") mit einer langen parazentrischen Inversion haben, haben nur Töchter, während Weibchen, die homozygot für das Standard-X-Chromosom (nicht invertiert) sind, nur Söhnehaben 5 (Abbildung 2). Für das X'-Chromosom19 sind Sequenzinformationen verfügbar, aber der molekulare Mechanismus muss noch geklärt werden, wie das X'-Chromosom bestimmt, dass die Nachkommen weiblich sein werden. Männchen haben nie das X'-Chromosom, und nach der Befruchtung sind Weibchen X'X (heterozygot für das X') oder XX. Erwachsene X'X-Weibchen können von XX-Weibchen anhand phänotypischer Marker auf dem Flügel unterschieden werden (Abbildung 3). X'X-Weibchen (die nur Töchter haben werden) sind an der dominanten Wavy (W) Flügelmarkierung auf dem X' zu erkennen (wie beim HoLo2-Stamm)22. Alternativ können XX-Weibchen (die nur Söhne haben werden) an der rezessiven zierlichen (p) Flügelmarkierung auf dem X wie beim 91S-Bestand23 erkannt werden. In diesem Fall haben X'Xp-Weibchen durchgehende (nicht zierliche) Flügel und haben nur Töchter. Der Stamm 6980 trägt einen rezessiven Marker auf dem X-Chromosom für geschwollene (sw) Venen24 sowie den dominanten Marker Wavy auf dem X', was zwei Marker für die Selektion für Kreuzungen ermöglicht. Der Grad der Expression von Wavy kann variieren und scheint in überfüllten Fläschchen, in denen die Nahrung begrenzt ist oder wenn die Temperatur zu warm wird, schwächer zu sein. Der Phänotyp des Wellenflügels ist außergewöhnlich stark, wenn die Larven im Kühlraum (4°-8 °C) statt wie üblich bei 21 °C gehalten werden. Obwohl der rezessive Petite-Wing-Marker nicht variabel und sehr leicht zu identifizieren ist, werden 91S-Bestände seltener verwendet, da sie weniger gesund sind als der HoLo2-Bestand. Die Paarungsschemata von B. coprophila werden hier vorgestellt (Abbildung 2) und detailliert für die HoLo2-, 7298- und W14-Stämme (Supplemental File 1), die 91S-Stämme (Supplemental File 1), die 6980-Stämme (Supplemental File 1) und die Translokationsstämme (Supplemental File 1) beschrieben. Die Umlagerungsbestände sind nicht mehr vorhanden; es handelte sich um reziproke Translokationen von Heterochromomeren (H1, H2 und H3) auf dem kurzen Arm des X, der die ribosomalen RNA-Gene 25,26,27 enthält.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig02.jpg"> Abbildung 2: Paarungsschema für B. coprophila. Dieser Organismus hat kein Y-Chromosom (das männliche Soma hat ein einzelnes X); Mütter bestimmen das Geschlecht ihres Nachwuchses. XX Mütter haben nur Söhne und X'X Weibchen haben nur Töchter. Das X'-Chromosom hat im Vergleich zum X-Chromosom eine lange parazentrische Inversion. Die väterliche oder mütterliche Abstammungslinie des X- (oder X'-) Chromosoms ist in dieser Abbildung blau bzw. rot gekennzeichnet. Die Spermien sind haploid für die Autosomen, haben aber aufgrund der Nichtdisjunktion in der Meiose II zwei Kopien des X-Chromosoms. Die somatische Abstammungslinie der frühen Embryonen eliminiert eine oder zwei Kopien des väterlichen Abstammungs-X, wenn sie weiblich bzw. männlich sind. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig03.jpg"> Abbildung 3: Flügelphänotypen von B. coprophila. Erwachsene weibliche Fliegen werden mit verschiedenen Flügelphänotypen gezeigt: (A) gerader Flügel (XX), (B) gewellter Flügel (X'WX), (C) extremer Wellenflügel-Phänotyp (X'WX), der nach der Lagerung von Larven im kalten Käfig ein verschrumpeltes Aussehen hat, (D) zierlicher Flügel (XpXp), der verkümmert ist, (E) gerader Flügel mit Wildtyp (XX) und nicht geschwollenen Adern, (F) gerader Flügel mit geschwollenen Adern (XswXsw), bei dem kleine Blasen (schwarze Pfeile) am oberen Rand des Flügels und/oder in der Nähe der Spitze beider Flügel erscheinen, (G) extremes Beispiel für einen geschwollenen Flügel, bei dem eine Blase (weißer Pfeil) auf einem oder beiden Flügeln auftritt. Männchen fehlt das X'-Chromosom und werden daher niemals gewellte Flügel haben, aber sie haben zierliche oder geschwollene Flügel im 91S-Bestand bzw. 6980-Bestand. Maßstabsleiste = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Das Ziel bei der Bestandspflege ist es, Kreuzungen durchzuführen, bei denen die Hälfte der Kreuzungen von weiblichen Müttern und die Hälfte der Kreuzungen von männlich produzierenden Müttern stammen, um in der nächsten Generation die gleiche Anzahl von weiblichen und männlichen erwachsenen Müttern für nachfolgende Kreuzungen zu haben. Dies erfordert jedoch auch eine Planung, da der Lebenszyklus bei Männchen kürzer ist als bei Weibchen und erwachsene Männchen bis zu einer Woche vor den erwachsenen Weibchen schlüpfen. Die Natur trägt dieser Asynchronität zwischen den Geschlechtern Rechnung, indem sie die männlichen Embryonen 1-2 Tage nach den weiblichen Larven aus einer Kreuzung am selben Tag als Larven schlüpfen lässt. Um jedoch sicherzustellen, dass männliche und weibliche adulte Tiere gleichzeitig für Laborkreuzungen zur Verfügung stehen, kann die Entwicklung der Weibchen etwas beschleunigt werden, indem Fläschchen mit weiblichen Larven bei Raumtemperatur statt bei 21 °C belassen werden oder Fläschchen mit männlichen Larven bei etwas kühleren Temperaturen (z. B. 16 °C) gelagert werden. Ein anderer Weg, der narrensicherer ist, besteht darin, Kreuzungen mit weiblichen Erzeugermüttern am Montag und Kreuzungen mit männlichen Erzeugermüttern am Freitag derselben Woche durchzuführen. Der einfachste Weg, den wir anwenden, besteht darin, Kreuzungen mit weiblichen und männlichen Erzeugermüttern am selben Tag in jeder Woche durchzuführen und an diesem Tag in jeder aufeinanderfolgenden Woche Kreuzungen durchzuführen. Bei diesem Ansatz können adulte Weibchen aus einer Kreuzung in Woche 1 mit erwachsenen Männchen gepaart werden, die aus einer Kreuzung in Woche 2 hervorgegangen sind.
Der Lebenszyklus für weibliche B. coprophila beträgt 5 Wochen, wenn sie bei 21 °C aufgezogen werden (Tabelle 1). Die Länge ihres Lebenszyklus ist bei kühleren Temperaturen oder bei Unterernährung etwas länger. Der Lebenszyklus von männlichen B. coprophila beträgt ~4-4,5 Wochen, da sie sich 0,5-1 Woche vor den Weibchen verpuppen. Das Ende jedes Larvenstadiums ist durch die Ablösung der Kutikula gekennzeichnet, die durch einen Anstieg des Spiegels des Steroidhormons Ecdyson ausgelöst wird. Im Gegensatz zu D. melanogaster, der drei Larvenstadien hat, hat B. coprophila vier Larvenstadien.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Entwicklungsstadium</td>
			<td>Tage nach der Verpaarung (dpm)</td>
			<td>Länge der Etappe (Tage)</td>
		</tr><tr><td>Ei gelegt</td>
			<td>1-2</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Embryo</td>
			<td>1-2 bis 7-8</td>
			<td>~7 Tage</td>
		</tr><tr><td>Larve</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Larven in den Stadien 1, 2 und 3</td>
			<td>7-8 bis 16-19 Uhr</td>
			<td>~10</td>
		</tr><tr><td>4. Larve im Stadium vor dem Augenfleck</td>
			<td>16-19 bis 21-24</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>4. Larvenstadium im Augenfleckstadium</td>
			<td>21-24 bis 25-28</td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td>Puppe</td>
			<td>25-28 bis 30-33</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Erwachsene</td>
			<td colspan="2">lebt 1-2 Tage bei 21 °C, wenn sie verpaart ist, oder lebt 2-3 Wochen bei 16 °C, wenn sie nicht verpaart ist.</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Lebenszyklus von weiblicher B. coprophila bei 21 °C.
B. coprophila kann überall im Bereich von 15 °C bis 25 °C gehalten werden, wobei die Entwicklung bei kühleren Temperaturen langsamer voranschreitet. Dieses Insekt bevorzugt eine feuchte Umgebung (die im Boden von Zimmerpflanzen oder Pilzbeeten zu finden ist), daher bewahren wir einen Becher mit deionisiertem Wasser im Brutkasten auf. B. coprophila kann bei Raumtemperatur in einem Brotkasten aus Metall mit locker sitzendem Deckel und einem Becher Wasser aufbewahrt werden, aber sie gehen bei 37 °C28 in einen Hitzeschock über, was in heißen Klimazonen eine Gefahr darstellt. Michael Ashburner und andere haben mit wenig Erfolg versucht, D. melanogaster in der Kälte zu lagern, um die für die Lagerhaltung benötigte Zeit zu verkürzen. Im Gegensatz dazu besteht ein großer Vorteil von B. coprophila darin, dass Fläschchen mit Larven im mittleren Stadium bis zu 3 Monate auf einem offenen Regal im Kühlraum (4-8 °C) gelagert werden können, wobei nur einmal im Monat gefüttert werden muss. Sie entwickeln sich in der Kälte bis zum Puppenstadium extrem langsam und gehen als fruchtbare Erwachsene aus, wenn die Fläschchen wieder auf 21 °C gebracht werden. Vermutlich ahmt dies ihre Überwinterung in freier Wildbahn nach. Dieser kälteinduzierte Entwicklungsstillstand könnte mit dem nach Gammabestrahlung von B . coprophila-Larven im mittleren Stadium vergleichbarsein 16, aber bei Larven im Spätstadium, die den Punkt überschritten haben, an dem es kein Zurück mehr für ihren normalen Entwicklungsfortschritt gibt, ist kein Entwicklungsstillstand zu beobachten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar (bacteriological)</td>
			<td>U.S. Biological</td>
			<td>A0930</td>
			<td>https://www.usbio.net;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 FlyStuff Foot Pedal</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 FlyStuff Blowgun</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>54-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 FlyStuff UltimaterFlypad</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-172</td>
			<td>https://www.geneseesci.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ether fume hood</td>
			<td>Labconco&#160;</td>
			<td>3955220</td>
			<td>Sits on top of lab bench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160; &#160;</td>
			<td>&#160; &#160;</td>
			<td>&#160; &#160;</td>
			<td>Filter replacement&#160; cat # 6961300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food: Brewer&#8217;s Yeast Powder</td>
			<td>Solgar</td>
			<td>&#160; &#160;</td>
			<td>Obtain from Amazon or health food store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160; &#160;</td>
			<td>&#160; &#160;</td>
			<td>&#160; &#160;</td>
			<td>https://www.solgar.com;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food: Nettle Powder&#160; (pesticide free)</td>
			<td>Starwest Botanicals</td>
			<td>209460-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food: Shitake Mushrooms (pesticide free)</td>
			<td>Starwest Botanicals</td>
			<td>202127-5</td>
			<td>https://www.starwest-botanicals.com;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food: Spinach Powder ( pesticide free)</td>
			<td>Starwest Botanicals</td>
			<td>209583-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food: Straw (pesticide free )</td>
			<td>Starwest Botanicals</td>
			<td>209465-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jar: clear glass, polypropylene lid</td>
			<td>Fisher Scientific:</td>
			<td>FB02911765</td>
			<td>73 mm dia, 89 mm ht (240 ml) 
			https://www.fishersci.com;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Probe, wooden handle</td>
			<td>US Geo Supply Inc</td>
			<td>SKU: 4190</td>
			<td>5.75&#8221; long probe, 
			stainless steel needle 
			https://usgeosupply.com; (970)-434-3708</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vials: glass, preferred:</td>
			<td>Wilmad LabGlass</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wilmad-glass custom vials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>28-33 mm inner dia, 33 mm outer dia, 9.5 cm ht 
			Wilmad: https://www.SP-WilmadLabglass.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vials: glass (cheaper and ok)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-339-26H</td>
			<td>29 mm outer dia, 9.5 cm h 
			&#160;https://www.fishersci.com;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vials: glass (a bit narrow)&#160;</td>
			<td>Genesee Scientific&#160;</td>
			<td>32-201</td>
			<td>24.5 mm outer dia,9.5 cm h 
			thttps://www.geneseesci.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vials: polypropylene&#160;</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-114</td>
			<td>28.5 mm outer dia,9.5 cm ht</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial Plugs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>roll of non-absorbent cotton</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-456881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cheesecloth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-055053</td>
			<td>https://www.fishersci.com;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laboratory maintenance of the lower dipteran fly bradysia (sciara) coprophila: a new/old emerging model organism

Laborbestände der Unterdipterischen Fliege, Bradysia (Sciara) coprophila, werden seit über einem Jahrhundert aufbewahrt. Protokolle für die Laborerhaltung von B. coprophila werden hier vorgestellt. Diese Protokolle werden für die schnell wachsende Zahl von Laboratorien, die B. coprophila untersuchen, nützlich sein, um seine einzigartigen biologischen Eigenschaften zu nutzen, zu denen gehören: (1) eine monopolare Spindel bei der männlichen Meiose I; (2) Nicht-Disjunktion der X-Dyade in der männlichen Meiose II; (3) Chromosomenprägung zur Unterscheidung von mütterlichen und väterlichen Homologen; (4) keimbahnbegrenzte (L) Chromosomen; (5) Chromosomeneliminierung (väterliche Chromosomen bei der männlichen Meiose I; ein bis zwei X-Chromosomen bei frühen Embryonen; L-Chromosomen aus dem Soma in frühen Embryonen); (6) Geschlechtsbestimmung durch die Mutter (es gibt kein Y-Chromosom); und (7) entwicklungsregulierte DNA-Amplifikation an den DNA-Puff-Loci in den Polytenchromosomen der Speicheldrüsen der Larven. 
Es ist nun möglich, diese vielen einzigartigen Merkmale der Chromosomenmechanik zu erforschen, indem die jüngsten Fortschritte bei der Sequenzierung und Assemblierung des B. coprophila-Genoms und die Entwicklung von Transformationsmethoden für das Genom-Engineering genutzt werden. Die wachsende wissenschaftliche Gemeinschaft, die B. coprophila für die Forschung verwendet, wird von den hier beschriebenen Protokollen für die Paarung der Fliegen (phänotypische Marker für Mütter, die nur Söhne oder nur Töchter haben werden; Details zur Massenpaarung für biochemische Experimente), die Überprüfung des Schlüpfens des Embryos, die Fütterung von Larven und andere Kommentare zur Aufzucht profitieren.

Die hier beschriebenen Protokolle haben zu nachgewiesenen Erfolgen bei der Aufzucht von B. coprophila geführt. Wenn kürzlich geschlossene fette adulte Tiere für die Paarung ausgewählt werden (Abbildung 4), können über 90% der Kreuzungen fruchtbar sein und Nachkommen hervorbringen. Der Fruchtbarkeitserfolg ist je nach Stamm unterschiedlich (Tabelle 2). Stamm 7298 (X'-Chromosom mit Wellenmarker) war der gesündeste der Stämme, durchlief aber eine Phase des Rückgangs, offenbar aufgrund der Aktivierung mobiler DNA-Elemente, die Genomumlagerungen verursachten32. Der HoLo2-Stamm stellt einen gesunden Stamm dar, der von 7298 abgeleitet ist, bei dem sich die Genomumlagerungen anscheinend stabilisiert haben, und er hat den Elternstamm 7298 in der Stammmitte ersetzt. Der HoLo2-Stamm ist derjenige, der zur Sequenzierung des B . coprophila-Genoms verwendet wurde und von verschiedenen Laborgruppen am häufigsten verwendet wird. Kürzlich wurde die CRISPR-Mutagenese von HoLo2-Fliegen verwendet, um den W14-Stamm mit einem Phänotyp des weißen Auges zu erzeugen, der für die Transformation mit fluoreszierenden Augenmarkern verwendet werden soll (Yamamoto und Gerbi, Daten nicht gezeigt). Der Stamm W14 ist außergewöhnlich robust. Der 6980er Schaft (gewellter Flügel und geschwollene Venenmarkierer) ist etwas weniger robust und der 91S Schaft (petite wing marker) ist noch weniger robust.
Erfolgreiche Kreuzungen führen zu Embryonen (Abbildung 5). Bei den Embryonen werden die geprägten väterlichen X-Chromosomen bei der 7. bis 9. Spaltung eliminiert. Darüber hinaus werden keimbahnbegrenzte L-Chromosomen in Embryonen bei der 5. bis 6. Spaltung aus der somatischen Linie eliminiert. Die Embryonen schlüpfen als Larven, die nicht mit Schimmelpilzen verwechselt werden sollten, die ebenfalls vorhanden sein können (Abbildung 6). Augenflecken (Anlage zu den erwachsenen Augen) treten in der zweiten Hälfte des 4. Larvenstadiums auf (Abbildung 7). Die Größe der Augenflecken stellt einen geeigneten phänotypischen Marker für den Beginn und das Fortschreiten der DNA-Puff-Amplifikation dar, die eines von nur zwei bekannten Beispielen für eine natürlich vorkommende, entwicklungsregulierte ortsspezifische intrachromosomale DNA-Amplifikation (Gen) ist. Anschließend entwickeln sich Puppen, und die Menge an Pigment, die ihre Augen füllt, kann als Entwicklungsmarker für Meiose I und II in der Spermatogenese dienen (Abbildung 8) mit ihrem einzigartigen Chromosomenverhalten in diesen Teilungen.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig04.jpg"> Abbildung 4: Paarung adulter B. coprophila-Fliegen . Das obere Bild zeigt die drei Arten von adulten Fliegen im HoLo2-Bestand: weibliche produzierende Mütter mit gewellten Flügeln (X'WX erwachsene Weibchen), männlich produzierende Mütter mit geraden Flügeln (XX erwachsene Weibchen) und Männchen mit geraden Flügeln (X0 erwachsene Männchen). Man beachte den spitzen Ovipositor am hinteren Ende der weiblichen Fliegen und den hakenförmigen Klasper am hinteren Ende der männlichen Fliegen. Das untere Bild zeigt ein Männchen und ein Weibchen bei der Paarung, wobei das Männchen den Ovipositor des Weibchens gegriffen hat. Die Spermien werden in der Spermathek des Weibchens gespeichert und befruchten die Eizellen, wenn sie nach außen abgegeben werden. Die Länge der adulten Tiere beträgt 2,0 mm (Männchen), 2,5 mm (Weibchen). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig05v2.jpg"> Abbildung 5: B. coprophila-Embryonen. Das obere linke Feld zeigt eine Ansicht von Embryonen mit Standardlicht in einem Präpariermikroskop; Die Zellkerne im synzytialen Zytoplasma erscheinen als schwarze Punkte. Das Panel auf der rechten Seite nutzt die Fluoreszenzmikroskopie, um die mit Propidiumiodid gefärbten Zellkerne von Embryonen sichtbar zu machen. Die Embryonen haben eine durchschnittliche Länge von 200 Mikrometern und eine durchschnittliche Breite von 150 Mikrometern. Die Zellkerne für die Keimzellen gruppieren sich am hinteren Pol des Embryos, wie bei den Zyklen 6 (Embryo nach vorne gekippt) und 7-9, danach sind sie mit somatischen Kernen durchsetzt. Die Eliminierung des L-Chromosoms in der somatischen Linie erfolgt in der Spaltungsabteilung 5 oder 6; Die Eliminierung des X-Chromosoms in der somatischen Linie erfolgt in der 7., 8. oder 9. Spaltung. Die Zellularisierung tritt in der Interphase von Zyklus 11 auf. Die Tabelle links zeigt die durchschnittliche Zeitdauer für jeden Teilungszyklus bei 22 °C. Der Tisch links und die Tafel rechts sind mit Genehmigung von de Saint Phalle und Sullivan35 adaptiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig06.jpg"> Abbildung 6: B . coprophila-Embryonen schlüpfen als Larven. Eine Gruppe von Embryonen (blauer, dicker Pfeil) ist in der Nähe des Ovipositors des erwachsenen Weibchens zu sehen, das nach der Eiablage gestorben ist. Eine Woche nach der Eiablage werden aus den Embryonen junge Larven, von denen mehrere durch die schwarzen Pfeile gekennzeichnet sind. Die neu geschlüpften Larven haben einen schwarzen Kiefer am vorderen Ende und einen durchscheinenden Körper. Sie bewegen sich auf der Agaroberfläche und sollten nicht mit Schimmel verwechselt werden, der sich nicht bewegt. Der Einschub zeigt etwas Schimmel mit einem weißen Faden (roter Pfeil) und einer schwarzen Spore an der Spitze (grüner Pfeil) und ist etwas kleiner als die neu geschlüpften Larven. Maßstabsleiste = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig07.jpg"> Abbildung 7: Augenfleckenstadien von B. coprophila-Larven . Augenflecken bilden sich am vorderen Rand der Larve, direkt hinter dem Kiefer, und bestehen aus Pigmentkörnern, deren Anzahl zunimmt. Die Augenflecken sind die Anlage zum erwachsenen Auge. Das obere Bild zeigt Larven, die mit einem Präpariermikroskop sichtbar gemacht wurden; Das untere Feld ist eine vergrößerte Ansicht der Augenflecken, bei der ein Phasenkontrastmikroskop verwendet wird, um eine Larve auf einem Objektträger mit einem Tropfen destilliertem Wasser und einem Deckglas, das leicht darauf schwimmt, zu visualisieren. Die Nomenklatur der Augenfleckenstadien entspricht Gabrusewycz-Garcia30 , wobei die Anzahl der Granulate in der längsten Reihe (z. B. 12) und die Anzahl der zusätzlichen Reihen ohne die längste Reihe notiert wird (z. B. 6 für das Augenfleckstadium 12x6). Die Initiierung der ortsspezifischen DNA-Amplifikation in den Polytenchromosomen der Speicheldrüse beginnt im Augenfleckstadium 10x5 und wird bei 14x7 abgeschlossen, wenn es zu einem Ausbruch der Transkription am Locus und einer Expansion der DNA-Puffskommt 31. Im anschließenden Stadium des Randauges/des abgefallenen Kiefers beginnen die Augenfleckenkörnchen zu verschmelzen und bewegen sich seitlich von der Mittellinie weg; Die Länge des Larvenkörpers verkürzt sich. Außerdem kondensieren die DNA-Puffs in diesem Stadium. Bei 21 °C dauert es etwa einen Tag, um jedes Augenfleckstadium zu durchlaufen. Maßstabsleiste = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig07large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig08.jpg"> Abbildung 8: Entwicklung von B. coprophila pupae. Während der Verpuppung histolysieren alle Larvengewebe mit Ausnahme des Nervensystems und werden durch adulte Gewebe ersetzt, die durch Zellteilungen der Imaginalscheiben entstehen. Die Körperfarbe wechselt von Weiß über Hellbraun zu Braun zu Schwarz. Das Pigment füllt allmählich das Puppenauge aus; Meiose I und II treten bei männlichen Puppen auf, deren Augen zu 1/4 bis 1/2 mit Pigmentgefüllt sind 36. Maßstabsleiste = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig08large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Name der Aktie</td>
			<td>Markierungen</td>
			<td>Fertilitätsrate</td>
			<td>Kommentare</td>
		</tr><tr><td>7298</td>
			<td>Gewellter (W) Flügel</td>
			<td>~75%</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>HoLo2</td>
			<td>Gewellter (W) Flügel</td>
			<td>~90%</td>
			<td>abgeleitet von 7298</td>
		</tr><tr><td>W14</td>
			<td>Gewellter (W) Flügel; Weiße Augen</td>
			<td>~95%</td>
			<td>abgeleitet von HoLo2</td>
		</tr><tr><td>6980</td>
			<td>Gewellter (W) Flügel; geschwollene (SW) Venen</td>
			<td>~65%</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>91ER JAHRE</td>
			<td>schwacher gewellter (W) Flügel; Zierliche (P) Flügel</td>
			<td>~50%</td>
			<td>der Wavy Marker wurde in einem Kreuz eingeführt, um 91S zu retten</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 2: Bestände von Bradysia (Sciara) coprophila. Tabelle 1 von Gerbi6 listet diese und andere Marker auf, die nicht mehr existieren. Fünf Translokationen (T1, T23, T29, T32, T70) am zentromeren Ende des X27 sind in Abbildung 8 von Gerbi6 zusammengefasst, existieren aber nicht mehr.
Ergänzende Datei 1: HoLo2 (und 7298 und W14) Kreuzungen, 91S Kreuz und Rettung, 6980 Kreuz, Translokationskreuze. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/Supplemental%20Materials.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

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Author Spotlight: Exploring Bradysia coprophila's Unique Biology &#8211; A Guide to Laboratory Maintenance

In dieser Arbeit wird die Laborerhaltung (einschließlich Paarung und Fütterung) der unteren zweiflüglerischen Fliege Bradysia (Sciara) coprophila beschrieben.

Laborerhaltung der Unterdipteranen Fliege Bradysia (Sciara) coprophila: Ein neuer/alter aufstrebender Modellorganismus

Laboratory stocks of the lower dipteran fly, Bradysia (Sciara) coprophila, have been maintained for over a century. Protocols for laboratory upkeep of B. ...

Wir pflegen die untere zweiflüglige Fliege, Bradysia, auch bekannt als Sciara coprophila, um einige ihrer einzigartigen biologischen Eigenschaften zu untersuchen, darunter eine monopolare Spindel und eine x-Dyaden-Nichtdisjunktion bei der Meiose, Chromosomenprägung, keimbahnspezifische Chromosomen, Chromosomeneliminierung, mütterliche Geschlechtsbestimmung und DNA-Amplifikation in umweltschädlichen Chromosomen-DNA-Puffs. In unserem Labor hat Yutaka Yamamoto eine Methodik für die genomische Transformation von Bradysia coprophila entwickelt. Darüber hinaus wurde das Transkriptom dieses Organismus zur Verfügung gestellt, und sein Genom wurde von John Urban sequenziert und zusammengesetzt.Diese Durchbrüche ermöglichen die Erforschung der einzigartigen Biologie von Bradysia coprophila. Wir ermutigen Sie, sich der wachsenden Gemeinschaft von Wissenschaftlern anzuschließen, die sich mit den einzigartigen Eigenschaften von Bradysia coprophila befassen. Ihre Ergebnisse werden molekulare Mechanismen aufklären, die für die Zell- und Entwicklungsbiologie von grundlegender Bedeutung sind.Die hier vorgestellten Haltungsprotokolle dienen als Tutorial für die Erhaltung von Bradysia coprophila in Ihrem eigenen Labor.

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Research

JoVE Journal

Biology

Laboratory Maintenance of the Lower Dipteran Fly Bradysia (Sciara) coprophila: A New/Old Emerging Model Organism

635 Aufrufe.  Brown University. Wir pflegen die untere zweiflüglige Fliege, Bradysia, auch bekannt als Sciara coprophila, um einige ihrer einzigartigen biologischen Eigenschaften zu untersuchen, darunter eine monopolare Spindel und eine x-Dyaden-Nichtdisjunktion bei der Meiose, Chromosomenprägung, keimbahnspezifische Chromosomen, Chromosomeneliminierung, mütterliche Geschlechtsbestimmung und DNA-Amplifikation in umweltschädlichen Chromosomen-DNA-Puffs. In unserem Labor hat Yutaka Yamamoto eine Methodik für die genomisc...

Serie: Author Spotlight: Exploring Bradysia coprophila's Unique Biology – A Guide to Laboratory Maintenance

Vibrio cholerae: Model Organism to Study Bacterial Pathogenesis - Interview

Vibrio cholerae: Model Organism, um bakterielle Pathogenese Study - Interview

Forschung

Biologie

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Mikroinjektion von Medaka Embryonen für die Verwendung als Modell Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction

This protocol describes regular care and maintenance of a zebrafish laboratory. Zebrafish are now gaining popularity in genetics, pharmacological and behavioural research. As a vertebrate, zebrafish share considerable genetic sequence similarity with humans and are being used as an animal model for various human disease conditions. The advantages of zebrafish in comparison to other common vertebrate models include high fecundity, low maintenance cost, transparent embryos, and rapid development. Due to the spur of interest in zebrafish research, the need to establish and maintain a productive zebrafish housing facility is also increasing. Although literature is available for the maintenance of a zebrafish laboratory, a concise video protocol is lacking. This video illustrates the protocol for regular housing, feeding, breeding and raising of zebrafish larvae. This process will help researchers to understand the natural behaviour and optimal conditions of zebrafish husbandry and hence troubleshoot experimental issues that originate from the fish husbandry conditions. This protocol will be of immense help to researchers planning to establish a zebrafish laboratory, and also to graduate students who are intending to use zebrafish as an animal model.

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish Danio rerio Laboratory: An Introduction

This protocol outlines regular maintenance and care to maintain optimal conditions for zebrafish husbandry. The video illustrates the protocol for system maintenance, regular housing, feeding, breeding, and raising of zebrafish larvae.

Regelmäßige Pflege und Wartung eines Zebrafisch (<em&gt; Danio rerio</em&gt;) Labor: Eine Einführung

This protocol describes regular care and maintenance of a zebrafish laboratory. Zebrafish are now gaining popularity in genetics, pharmacological and ...

Collection, Isolation and Enrichment of Naturally Occurring Magnetotactic Bacteria from the Environment

Magnetotactic bacteria (MTB) are aquatic microorganisms that were first notably described in 19751 from sediment samples collected in salt marshes of Massachusetts (USA). Since then MTB have been discovered in stratified water- and sediment-columns from all over the world2. One feature common to all MTB is that they contain magnetosomes, which are intracellular, membrane-bound magnetic nanocrystals of magnetite (Fe3O4) and/or greigite (Fe3S4) or both3, 4. In the Northern hemisphere, MTB are typically attracted to the south end of a bar magnet, while in the Southern hemisphere they are usually attracted to the north end of a magnet3,5. This property can be exploited when trying to isolate MTB from environmental samples.
One of the most common ways to enrich MTB is to use a clear plastic container to collect sediment and water from a natural source, such as a freshwater pond. In the Northern hemisphere, the south end of a bar magnet is placed against the outside of the container just above the sediment at the sediment-water interface. After some time, the bacteria can be removed from the inside of the container near the magnet with a pipette and then enriched further by using a capillary racetrack6 and a magnet. Once enriched, the bacteria can be placed on a microscope slide using a hanging drop method and observed in a light microscope or deposited onto a copper grid and observed using transmission electron microscopy (TEM).
Using this method, isolated MTB may be studied microscopically to determine characteristics such as swimming behavior, type and number of flagella, cell morphology of the cells, shape of the magnetic crystals, number of magnetosomes, number of magnetosome chains in each cell, composition of the nanomineral crystals, and presence of intracellular vacuoles.

We demonstrate a method to collect magnetotactic bacteria (MTB) that can be applied to natural waters. MTB can be isolated and enriched from sediment samples using a relatively simple setup that takes advantage of the bacteria's natural magnetism. Isolated MTB can then be examined in detail using both light and electron microscopy.

Collection, Isolierung und Anreicherung von natürlich vorkommenden Magnetotaktische Bakterien aus der Umwelt

Magnetotactic bacteria (MTB) are aquatic microorganisms that were first notably described in 19751 from sediment samples collected in salt marshes of ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.

Aufrechterhaltung eines<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Bevölkerung Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...

A Versatile Model of Hard Tick Infestation on Laboratory Rabbits

The use of live animals in tick research is crucial for a variety of experimental purposes including the maintenance of hard tick colonies in the laboratory. In ticks, all developmental stages (except egg) are hematophagous, and acquiring a blood-meal when attached to their vertebrate hosts is essential for the successful completion of their life cycle. Here we demonstrate a simple method that uses easily openable capsules for feeding of hard ticks on rabbits. The advantages of the proposed method include its simplicity, short duration and most importantly versatile adjustment to the needs of specific experimental requirements. The method makes possible the use of multiple chambers (of various sizes) on the same animal, which permits feeding of multiple stages or different experimental groups while reducing the overall animal requirement. The non-irritating and easily accessible materials used minimizes discomfort to the animals, which can be easily recovered from an experiment and offered for adoption or reused if the ethical protocol allows it.

We have developed a simple and versatile system to feed hard ticks on laboratory rabbits. Our non-laborious protocol uses easily accessible materials and can be adjusted depending on the requirements of the various experimental settings. The method allows comfortable monitoring and/or sampling of ticks during the entire feeding period.

Ein vielseitiges Modell schwer Tick Befall an Kaninchen, Labor

The use of live animals in tick research is crucial for a variety of experimental purposes including the maintenance of hard tick colonies in the ...

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer progression. How the chromosomal location and function of a centromere (i.e., centromere identity) are determined and participate in accurate chromosome segregation is a fundamental question. CENP-A is proposed to be the non-DNA indicator (epigenetic mark) of centromere identity, and CENP-A ubiquitylation is required for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability.
Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-CENP-A K124R mutant suggesting that ubiquitylation at a different lysine is induced because of the EYFP tagging in the CENP-A K124R mutant protein. Lysine 306 (K306) ubiquitylation in EYFP-CENP-A K124R was successfully identified, which corresponds to lysine 56 (K56) in CENP-A through mass spectrometry analysis. A caveat is discussed in the use of GFP/EYFP or the tagging of high molecular weight protein as a tool to analyze the function of a protein. Current technical limit is also discussed for the detection of ubiquitylated bands, identification of site-specific ubiquitylation(s), and visualization of ubiquitylation in living cells or a specific single cell during the whole cell cycle.
The method of mass spectrometry analysis presented here can be applied to human CENP-A protein with different tags and other centromere-kinetochore proteins. These combinatory methods consisting of several assays/analyses could be recommended for researchers who are interested in identifying functional roles of ubiquitylation.

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

CENP-A ubiquitylation is an important requirement for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability. Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) protein.

Massenspektrometrieanalyse zur Identifizierung der Ubiquitylierung von EIFP-A mit EYFP-Tags (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

A Step-by-Step Guide to Mosquito Electroantennography

Female mosquitoes are the deadliest animals on earth, claiming the lives of more than 1 million people every year due to pathogens they transmit when acquiring a blood-meal. To locate a host to feed on, mosquitoes rely on a wide range of sensory cues, including visual, mechanical, thermal, and olfactory. The study details a technique, electroantennography (EAG), that allows researchers to assess whether the mosquitoes can detect individual chemicals and blends of chemicals in a concentration-dependent manner. When coupled with gas-chromatography (GC-EAG), this technique allows to expose the antennae to a full headspace/complex mixture and determines which chemicals present in the sample of interest, the mosquito can detect. This is applicable to host body odors as well as plant floral bouquets or other ecologically relevant odors (e.g., oviposition sites odorants). Here, we described a protocol that permits long durations of preparation responsiveness time and is applicable to both female and male mosquitoes from multiple genera, including Aedes, Culex, Anopheles, and Toxorhynchites mosquitoes. As olfaction plays a major part in mosquito-host interactions and mosquito biology in general, EAGs and GC-EAG can reveal compounds of interest for the development of new disease vector control strategies (e.g., baits). Complemented with behavioral assays, the valence (e.g., attractant, repellent) of each chemical can be determined.

The present article details a step-by-step protocol for successful and low noise electroantennograms in several genera of mosquitoes, including both females and males.

Eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Mücken-Elektroantennographie

Female mosquitoes are the deadliest animals on earth, claiming the lives of more than 1 million people every year due to pathogens they transmit when ...

Collection and Long-Term Maintenance of Leaf-Cutting Ants (Atta) in Laboratory Conditions

Ants are one of the most biodiverse groups of animals on the planet and inhabit different environments. The maintenance of ant colonies in controlled environments enables an enriched comprehension of their biology that can contribute to applied research. This practice is usually employed in population control studies of species that cause economic loss, such as Atta ants. To cultivate their mutualistic fungus, these leaf-cutting ants collect leaves and for this are considered agricultural pests widely distributed throughout the American continent. They are highly socially organized and inhabit elaborated underground nests composed of a variety of chambers. Their maintenance in a controlled environment depends on a daily routine of several procedures and frequent care that are described here. It starts with the collection of queens during the reproductive season (i.e., nuptial flight), which are then individually transferred to plastic containers. Due to the high mortality rate of queens, a second collection can be carried out about 6 months after the nuptial flight, when incipient nests with developed fungus wad are excavated, hand-picked, and placed in plastic containers. In the laboratory, leaves are daily provided to established colonies, and ant-produced waste is weekly removed along with remaining dry plant material. As the fungus garden keeps growing, colonies are transferred to different types of containers according to the experimental purpose. Leaf-cutting ant colonies are placed in interconnected containers, representing the organizational system with functional chambers built by those insects in nature. This setup is ideal to monitor factors such as waste amount, fungus garden health, and the behavior of workers and queen. Facilitated data collection and more detailed observations are considered the greatest advantage of keeping ant colonies in controlled conditions.

Collection and Long-Term Maintenance of Leaf-Cutting Ants Atta in Laboratory Conditions

Here, a protocol is described to successfully collect and maintain healthy Atta (Hymenoptera: Formicidae) ant colonies in laboratory conditions. Additionally, different nest types and configurations are detailed together with possible experimental procedures.

Sammlung und Langzeitpflege von Blattschneiderameisen (Atta) unter Laborbedingungen

Ants are one of the most biodiverse groups of animals on the planet and inhabit different environments. The maintenance of ant colonies in controlled ...