أنظمة AAV ونماذج الفئران للتحقيق في التعبير خارج الرحم للعصب1 في الخلايا المنقولة في الأوقات تحت الحادة والمزمنة بعد السكتة الدماغية الإقفارية

نحن نستكشف التعبير خارج الرحم بوساطة AAV لعوامل النسخ العصبية كعلاج محتمل للسكتة الدماغية الإقفارية. ينصب تركيزنا على معرفة ما إذا كان تعبير Neurod1 في الخلايا التي تعبر عن GFAP خلال المراحل تحت الحادة والمزمنة بعد السكتة الدماغية يزيد من الخلايا العصبية المنقولة ويرتبط بتحسينات الوظيفة الحركية. تظهر النتائج الحديثة أن التعبير الجيني في القشرة يختلف حسب المنطقة التي تحتوي على نفس AAV وجد بحثنا أن محفز GFAP أكثر نشاطا في قشرة الفص الجبهي الإنسي منه في القشرة الحركية ، مما يشير إلى أن الخلايا المنقولة تستجيب بشكل مختلف لمحفزات معينة.

وبالتالي ، يجب أن تكون العلاجات التي تنطوي على عوامل النسخ العصبي مصممة خصيصا لمنطقة الدماغ المستهدفة. تشمل التحديات الحالية التباين في حجم آفة السكتة الدماغية بسبب متغيرات مثل معدلات حقن ET-1 وكفاءات النقل بين مناطق الدماغ. يمكن أن تؤثر عيارات AAV والانتحاء عبر مناطق الدماغ وسلالات الفئران على كفاءات التنبيغ ، مما يؤثر على التقييم الخلوي للتعبير خارج الرحم Neurod1 بعد السكتة الدماغية.

التحدي الرئيسي في تحويل الخلايا النجمية إلى خلايا عصبية هو التمييز بين الخلايا العصبية المعاد برمجتها والخلايا الموجودة مسبقا. يهدف مختبرنا إلى تأكيد أن إعادة البرمجة هذه تحدث في الجسم الحي من خلال تطوير أدوات جديدة. في النهاية ، نسعى لفهم كيف يعزز التعبير خارج الرحم لعامل النسخ العصبي الشفاء في المصابة بالدماغ.

للبدء ، قم بإزالة المخدر من الغرفة وضعه على سطح نظيف. بعد تنظيف المنطقة الجراحية للفأر ، ضع أنفه في مخروط الأنف التجسيمي وقم بتثبيت الجمجمة باستخدام قضبان الأذن. باستخدام شفرة مشرط رقم 10 ، قم بعمل شق رأسي مواز للمستوى السهمي من خلف نقطة منتصف العينين إلى العظم الجداري.

ثم اسحب الجلد برفق لكشف الجمجمة. بعد ذلك ، استخدم Q-tip لتعطيل اللفافة على الجمجمة والسماح للجمجمة بالجفاف لكشف البريجما بالكامل. باستخدام مثقاب تجسيمي عالي السرعة ، قم بحفر ثلاثة ثقوب لدغ عند الإحداثيات في القشرة الحركية الحسية اليمنى.

بعد ذلك ، استبدل المثقاب بحقنة قياس 26 مزودة بإبرة يبلغ طولها 0.375 بوصة. قم بتحميل 1.5 ميكرولتر من محلول إندوثيلين ميكرومولار 400 مذاب في PBS معقم في المحقنة. حرر كمية صغيرة من endothelin-1 لملاحظة انخفاض عند طرف الإبرة ، مما يضمن تدفقا جيدا.

اخفض طرف الإبرة بعد الجمجمة في فتحة الأزيز الوسطى دون ثقب الأم الجافية. بمجرد المحاذاة ، اخفض الإبرة بمقدار ملليمتر واحد في الدماغ. باستخدام حقنة هاميلتون ، قم بتوزيع 0.1 ميكرولتر في المرة الواحدة ، وانتظر دقيقة واحدة قبل حقن 0.1 ميكرولتر التالي.

لمنع انسداد الإبرة بين الحقن وبعده، حرر كمية صغيرة من البطانة 1 حتى تظهر قطرة عند طرف الإبرة. باستخدام طرف Q معقم ، امسح البطانة الزائدة 1 قبل الحقن. أخيرا ، قم بخياطة الجلد المغطى بالجمجمة باستخدام خياطة معقمة 4-0 لإغلاق الجرح.

بعد تخدير الماوس المعالج بالبطانة 1 ، انقل الماوس إلى الإطار التجسيمي. باستخدام المقص الجراحي ، قم بقص الغرز على الجرح. باستخدام الملقط ، قم بإزالة الجرب وسحب الجلد لكشف الجمجمة.

بعد ذلك ، استخدم طرف Q معقم لتجفيف سطح الجمجمة وتحديد موقع فتحات الأزيز. قم بإعداد أذرع المتلاعب للجهاز التجسيمي. ضع حامل إبرة يحمل حقنة قياس 26 بإبرة يبلغ طولها 0.375 بوصة.

الآن ، قم بتحميل 3.4 ميكرولتر من محلول AAV في المحقنة. اخفض طرف الإبرة بعد الجمجمة في أول ثقب أمامي. تأكد من أن الإبرة لا تثقب الأم الجافية ، ثم انخفضها بمقدار ملليمتر واحد في الدماغ.

باستخدام حقنة هاميلتون ، قم بحقن ميكرولتر واحد من محلول AAV عن طريق توزيع 0.1 ميكرولتر في المرة الواحدة كما هو موضح سابقا. ثم قم بخياطة الجلد المغطى بالجمجمة لإغلاق الجرح باستخدام خياطة بوليستر 4-0 Polysorb. قم بإزالة الماوس من الإطار التجسيمي وانقله إلى قفص سكن نظيف ومسخن مسبقا في منطقة الاسترداد.