نود أن نشكر كافة Lucanic وتشنغ Hwai جونغ للمساعدة في الحصول على الصور من شرائح منخفضة التكبير الحصين كامل المقدمة في هذا الفيديو. نود أيضا أن أشكر سارة باريش للمساعدة مع النص المرافق للفيديو.

بروتوكول للترنسفكأيشن BIOLISTIC صنع الرصاص الرصاص جيدة لمدة تصل إلى 6 أشهر ، ولكن قد تبدأ في الانخفاض في الكفاءة ترنسفكأيشن بعد 2-3 أشهر. يجب أن يتم تخزين الرصاص عند درجة 4 في وجود الكريات dessicant. دعونا دائما قوارير التلألؤ ، والتي يتم تخزين الرصاص ، إلى درجة حرارة الغرفة دافئة قبل فتح القارورة. لقد بدأت قبل الحصول على استعداد : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سبيرمدين (0.05M) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CaCl 2 (1M) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> EtOH (100 ٪ عالية الدرجة فتحها زجاجة) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيمها H 2 0 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحمض النووي ليكون transfected </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بوفيدون (PVP - 20 ملغ / مل الأسهم) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 X 15 مل المخروطية (2/bullet مجموعة) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب (مقطعة إلى ~ 1 X 30 بوصة مجموعة الرصاص /) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التلألؤ قوارير (1/bullet مجموعة) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجفيف حبيبات </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 مل حقنة ث / أنابيب في نهاية </li></ul> إعداد أنابيب : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ~ الجافة 30 بوصة من الأنابيب (حوالي 2 بوصة يمتد إلى أبعد من الحق يا الدائري) في محطة أنابيب ث / N 2 الغاز (0.4 ضغط) لمدة لا تقل عن 20 دقيقة. </li></ol> الحمض النووي على عجل حبات الذهب : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير الحمض النووي لتكون في حجم 50 transfected مجموع μmL في أنبوب microcentrifuge (بحد أقصى 50 ميكروغرام مجموع الحمض النووي) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن من 6-8 ملغ من الذهب ونقل إلى أنبوب microcentrifuge </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من سبيرمدين 0.05M إلى الذهب ويصوتن لمدة 20 ثانية </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ميكرولتر 50 من الحمض النووي للذهب / سبيرمدين </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة (حوالي الإعداد 5) ث / سقف مفتوح </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة قطرة من الحكمة 100 ميكرولتر من 1M CaCl 2 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يصوتن لفترة وجيزة (&lt;5 ثانية) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح لترسيب لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يصوتن لفترة وجيزة </li></ol> إعداد PVP حل خلال صوتنة : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل PVP تمييع الحل في مخروطية 15 مل ، 3.5mL تمييع PVP لكل مجموعة من الرصاص (إضافة 7.5 ميكرولتر من الأسهم PVP 20mg/ml إلى 3.5 مل EtOH 100 ٪) </li></ol> الشطف حبات الذهب مع EtOH : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور باستمرار حبات الذهب بأقصى سرعة لمدة 10 ثانية في microcentrifuge </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف ، ولكن الحفاظ على كمية صغيرة من السائل على حبات الذهب أعلى </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل 3X مع EtOH 1ml ، يصوتن لفترة وجيزة في كل مرة ، إذا لزم الأمر </li></ol> Resuspend الذهب / الحمض النووي في حل PVP : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الكرية الذهب في 200 ميليلتر من محلول 3.5 مل PVP / EtOH تمييع </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة من الذهب لresuspend بيليه (يصوتن لفترة وجيزة إذا لزم الأمر) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل ميكرولتر 200 من الذهب / PVP حل لالمخروطية الجديدة 15 مليلتر </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستمرار في هذا الطريق ، مضيفا 200 ميكرولتر من PVP في وقت واحد حتى تم نقل كل الذهب إلى 15 مليلتر المخروطية ، والحجم النهائي هو 3.2 مل </li></ol> طلاء الأنابيب : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إيقاف N 2 في محطة الأنابيب وإزالة الأنابيب المجففة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نعلق أنابيب المجفف إلى الحقنة 10 مل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هزة بقوة 15 مل المخروطية مليئة الذهب / PVP </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع نهاية للأنابيب في الذهب / حل PVP وتمتص ببطء الحرص على تجنب فقاعات </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك ~ 2 بوصة الجاف من طرفي الأنبوب </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع الأنابيب لا تزال تعلق على حقنة ومليئة حل الذهب / PVP والمكان بعناية خلف الأنابيب إلى محطة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علامة نهايات الأنابيب حيث يجلس حل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اسمحوا الذهب يستقر لمدة 5 دقائق مع حقنة المرفقة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمتص متابعة الحل ببطء شديد عن طريق سحب المحقنة بحيث يتم ترك الذهب استقر خلف (تأكد من عدم غسل الظهر) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع المحاقن </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدوير 90 درجة وترك الجلوس 2 ثانية </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استدارة 180 درجة وترك الجلوس آخر 2 ثانية </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدوير أنبوب لمدة 5 ثوانى </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على N 2 بحيث يقرأ صمام بين 0،4-0،5 وتدور الأنابيب المغلفة الذهب بينما التجفيف لمدة 5 دقائق. </li></ol> قطع الأنابيب : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أنابيب من محطة الإعدادية وأنابيب وقطع ينتهي عند علامات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قنينة التلألؤ المسمى تحت المروحية أنابيب للقبض على خفض خراطيش </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب في مكان المروحية وأنابيب وقطع الأنابيب مع حلاقة نظيفة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الكريات الجفاف في قارورة التلألؤ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خراطيش المحل في 4 درجات مئوية </li></ol> اطلاق النار شرائح الأنسجة عند اطلاق النار شرائح المثقفين ، من المهم أن تستخدم تقنية العقيمة نسبيا من أجل تجنب التلوث. نتذكر ، ان اطلاق النار عندما two بنيات مختلفة ، ويمكن تحميل كل من مجموعات من الرصاص في حامل خرطوشة نفسها ، ولكن ينبغي تغيير برميل والخطوط الملاحية المنتظمة بين البنى الشاشة. لقد بدأت قبل الحصول على استعداد : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الرصاص الحمض النووي (لقنينة التلألؤ الحارة إلى درجة حرارة الغرفة قبل فتح) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شرائح الأنسجة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هيليوس غون جين </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الهيليوم مع خرطوم مدفع دبابة الجين المرفقة &lt;/ لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> حامل خرطوشة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بطانة من البلاستيك برميل يا الدائري في المركز </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الناشر (تعديل) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الناشر الشاشة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملقط </li></ul> الإستعداد البندقية الجينات : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملقط به مكان الذهب خراطيش البلاستيكية المغلفة في حامل الخرطوشة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان حامل خرطوشة بندقية في الجينات عن طريق دفع الاول من العام القفل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأمين حامل خرطوشة بقفل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على الخطوط الملاحية المنتظمة للبرميل مع O - الرنين والشاشة الناشر في مكان آمن </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المسمار للبرميل ، في بطانة البندقية الجينات </li></ol> اطلاق النار مع شرائح المثقفين البندقية الجينات : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توضع على الأذن يفشل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المكونات البندقية الجين في توصيل خرطوم صهريج غاز الهليوم </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره الضغط على دبابة الى 180 PSI </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبادل لاطلاق النار في الهواء فارغة من أجل إزالة أي غبار أو الحطام من الشاشة الناشر. تبادل لاطلاق النار في البندقية ، وخفض الزر أولا التعشيق السلامة حتى الصفافير البندقية ، ثم الضغط على الزناد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد اطلاق النار على بياض ، وإزالة شرائح من الحاضنة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مدفع مقدما لبناء first </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبادل لاطلاق النار مع شاشة الناشر حوالي 0،5-1 بوصة من شريحة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقدم خرطوشة بين الآبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد اطلاق النار على مشاركة جيدة ، ضع شرائح العودة إلى الحاضنة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إيقاف إطلاق الغاز والضغط قبل فصل البندقية من الهليوم خرطوم </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فك بطانة للبرميل ، وإزالة خرطوشة وتستخدم قذائف </li></ol> أصحاب تنظيف خرطوشة وبطانات برميل : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خراطيش مكان ، وبطانات للبرميل ، وشاشات الناشر في كوب من الماء والصابون </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دورق مكان في sonicator الحمام ويصوتن لمدة 20 دقيقة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف جيدا بالماء حتى يتم إزالة جميع مخلفات الصابون </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقع في EtOH 70 ٪ لمدة ساعة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منشفة ورقية على مكان جاف لتجف بين عشية وضحاها </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن عندئذ خراطيش نظيفة ، وبطانات للبرميل ، ويمكن استخدامها في شاشات transfections biolistic اللاحقة </li></ol> نصائح لاطلاق النار المتاعب ترنسفكأيشن Biolistic يمكن ترنسفكأيشن Biolistic نتيجة أحيانا في ظروف دون المستوى الأمثل ترنسفكأيشن. يمكن أن يؤدي إلى عدد قليل جدا أو العديد من الخلايا transfected جدا ، عالية جدا أو منخفضة جدا مستويات التعبير ، أو قد يسبب شرائح الأنسجة لتصبح غير صحية عموما. كثيرا ما تؤدي شرائح غير صحية من ضغط الانفجار. وهنا بعض النصائح للحصول على شرائح الأنسجة transfected على النحو الأمثل. إذا كان يبدو أن هناك شرائح غير صحية (أو إذا transfected العديد من الخلايا / شريحة) ، حاول : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زيادة المسافة اطلاق النار </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خفض الضغط على خزان الغاز </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خفض كمية من الذهب </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستغناء عن مركز بيو راد الناشر والاستعاضة عن مركز الشاشة مع الناشر. </li></ul> إذا transfected خلايا قليلة جدا ، في محاولة : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتناقص المسافة اطلاق النار </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزايد الضغوط على خزان الغاز </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زيادة كمية من الذهب </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زيادة عدد من شرائح الأنسجة / جيد </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من يا الدائري في بطانة برميل سليمة. </li></ul> إذا كنت الحصول على شرائح مع كل من خلايا كثيرة جدا وعدد قليل جدا من خلال اطلاق النار transfected نفسه تأكد من : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التي تحتجز البندقية بشكل متناظر أعلى بكثير </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أن الذهب هو بالتساوي طلاء داخل الأنابيب. (إذا كنت تحصل على خط الذهب ، واستخلاص طاف من أنابيب بمعدل أسرع بمجرد أن استقر الذهب وتدوير الذهب لفترة أطول قبل تحول على النيتروجين. إذا ، من ناحية أخرى ، كنت تحصل streaking من الذهب ، وهذا هو الأرجح بسبب التعرض للرطوبة خلال جعل الكثير من الرصاص : تأكد من أنك تستخدم زجاجة مفتوحة من EtOH أن الأنابيب الجافة بدقة قبل طلاء ، وأنك متوجا الأغطية وإعداد رصاصات في الوقت المناسب). </li></ul> إذا يبدو ترنسفكأيشن الكفاءة المثلى (transfected # الخلايا / شريحة) ، ولكن يبدو أن مستوى التعبير عالية جدا أو منخفضة جدا : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط نسبة الحمض النووي إلى الذهب. (على سبيل المثال ، إذا كان منخفضا للغاية الحفاظ على كمية من الذهب ولكن زيادة كمية الحمض النووي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط كمية من الوقت بين اطلاق النار وجمع البيانات </li></ul> في حالة ترنسفكأيشن مزدوجة ، إذا كنت تحصل على القليل جدا من التعبير واحدة من بنيات الخاص ، وضبط نسبة اثنين في يبني بالطريقة المناسبة والتأكد من أن كلا من يبني تحت نفس المروج ، وذلك للتأكد من أن واحدا سوف لا المروج خارج المنافسة من جهة أخرى.

<ol>
	<li>Klein, T. M., Fromm, M., Weissinger, A., Tomes, D., Schaaf, S., Sletten, M., Sanford, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+foreign+genes+into+intact+maize+cells+with+high-velocity+microprojectiles.">Transfer of foreign genes into intact maize cells with high-velocity microprojectiles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 4305-4309 (1988).</li><li>Wellmann, H., Kaltschmidt, B., Kaltschmidt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+protocol+for+biolistic+transfection+of+brain+slices+and+dissociated+cultured+neurons+with+a+hand-held+gene+gun.">Optimized protocol for biolistic transfection of brain slices and dissociated cultured neurons with a hand-held gene gun.</a> J. Neurosci. Methods. 92, 55-64 (1999).</li><li>McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biolistic+transfection+of+neurons.">Biolistic transfection of neurons.</a> Sci. STKE. 51, 1-13 (2000).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li></ol>

ترنسفكأيشن Biolistic هي الوسائل المادية transfecting من الخلايا عبر قصف الأنسجة الحية مع ارتفاع سرعة جزيئات الحمض النووي الذهب المطلي. في نقل الجينات بوساطة الجزيئات ، في الخلايا نتيجة transfected عامة عندما تأتي الرصاصة للراحة في النواة. في حين أن العديد من الأساليب المختلفة موجودة ترنسفكأيشن ، مثل microinjection lipofection ، فوسفات الكالسيوم electroporation ، وترنسفكأيشن ترنسفكأيشن الفيروسي ، ويمكن أن تقترح ترنسفكأيشن biolistic أقل من العمالة المكثفة ، وبديلة فعالة لtransfecting الخلايا التي لا transfected بسهولة باستخدام هذه الأساليب الأخرى. في الواقع ، وقد وضعت لأول مرة كوسيلة لنقل الجينات في النباتات منذ وجود جدار الخلية التي ترنسفكأيشن الصعبة باستخدام أساليب موجودة من قبل 1. وبالمثل ، فقد اكتسب شعبية biolistics في مجال علم الأعصاب منذ ما بعد الإنقسامية الخلايا العصبية والمعروف أن من الصعب transfect 2،3. على وجه الخصوص ، ومن المسلم به على نطاق واسع على أنها أسلوب المبدأ لاستخدامها في التجارب التي تهدف إلى تقييم التشكل غرامة قدرها واحد في الخلايا العصبية في الدماغ شرائح سليمة. وصفت وسائل هنا تقديم شرح مفصل وشامل لكيفية تنفيذ ترنسفكأيشن biolistic من شرائح الدماغ مثقف باستخدام الجينات باليد السلاح (البندقية الجينات هيليوس النظام ؛ بيو راد). أصبح ترنسفكأيشن Biolistic الأسلوب المفضل لtransfecting الخلايا العصبية في ثقافة شريحة لأنه يسمح ترنسفكأيشن عدد متناثر من الخلايا في جميع أنحاء شريحة الدماغ. في هذه الطريقة ، يمكن فحص الخلايا العصبية الفردية في عزلة. لأن مناسبة بشكل خاص لهذه التقنية transfecting الخلايا العصبية في الدماغ شريحة ، وغالبا ما تستخدم في بالاشتراك مع 2 الفوتون المجهري ، لأن التصور 2 - الفوتون تمكن من استثارة الخلايا fluorescently المسمى عميقة داخل الأنسجة تشتت الضوء 4. بالفعل تم القبض على تكبير الصور عالية من الخلايا العصبية الهرمية قدم واحدة طوال هذا الفيديو باستخدام مجهر الليزر المخصصة بنيت 2 - الفوتون المسح. في الختام ترنسفكأيشن biolistic هو وسيلة فعالة لtransfecting الخلايا الفردية في سياق كثافة عالية من الخلايا المحيطة بها ، وعلى هذا النحو وقد ثبت مفيدة للغاية لوصفها fluorescently الخلايا العصبية الفردية في الثقافة شريحة العصبية.

على الرغم من أننا قد سرد كافة المنتجات بشكل منفصل ، وهو أكثر اقتصادا لشراء &quot;هيليوس الجينات بندقية النظام&quot; ، والذي يتضمن مع جميع المنتجات من بيو راد المذكورة أعلاه (القط # 165-2431).

preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture

ترنسفكأيشن Biolistic هي الوسائل المادية من transfecting خلايا الأنسجة بقذف مع جزيئات الحمض النووي عالية السرعة المغلفة. ونحن نقدم تفصيلية لبروتوكول ترنسفكأيشن biolistic من شرائح الحصين الفئران ، من الإعداد الأولي من الرصاص الحمض النووي المغلفة لاطلاق النار النهائي الثقافات شريحة عضوي النمط باستخدام مدفع الجينات. الجينات ترنسفكأيشن البندقية وسيلة فعالة وسهلة لtransfecting الخلايا العصبية ومفيد وخاصة بالنسبة للوضع العلامات fluorescently مجموعة فرعية صغيرة من الخلايا في نسيج شريحة. في هذا الفيديو ، ونحن المخطط الأول الخطوات المطلوبة لجزيئات الذهب معطف مع الحمض النووي. كيف نظهر المقبل إلى خط داخل أنابيب بلاستيكية مع الرصاص الذهب / الحمض النووي ، وكيفية خفض هذه الأنابيب للحصول على خراطيش بلاستيكية للتحميل في البندقية الجينات. وأخيرا ، فإننا أداء ترنسفكأيشن biolistic الثقافات الفئران شريحة الحصين ، مما يدل على التعامل مع بيو راد هيليوس بندقية الجينات ، وتقديم المشورة اطلاق النار المتاعب للحصول على شرائح الأنسجة السليمة وtransfected على النحو الأمثل.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture at JoVE.com

Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture

نحن تصف طريقة لإعداد الرصاص الحمض النووي الذهب المطلي وشرح استخدام هذه الرصاصات لtransfect biolistically الخلايا العصبية في قرن آمون شرائح المثقفين.

إعداد نقطي غون جين وترنسفكأيشن Biolistic من الخلايا العصبية في الثقافة شريحة

Biolistic transfection is a physical means of transfecting cells by bombarding tissue with high velocity DNA coated particles. We provide a detailed ...

preparation-gene-gun-bullets-biolistic-transfection-neurons-slice

Research

JoVE Journal

Biology

52.3K Views.  University of California, Davis. نحن تصف طريقة لإعداد الرصاص الحمض النووي الذهب المطلي وشرح استخدام هذه الرصاصات لtransfect biolistically الخلايا العصبية في قرن آمون شرائح المثقفين.

Video: Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture

Horizontal Slice Preparation of the Retina

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. However, many of retinal neurons, such as amacrine cells, expand their dendrites horizontally, so that the morphology of the cells is supposed to be severely damaged in the vertical slices. In the whole-mount preparation, especially for patch-clamp recordings, retinal neurons in the middle layer are not easily accessible due to the extensive coverage of glial cell (Mueller cell) s endfeets. Here, we describe the novel slicing method to preserve the dendritic morphology of retinal neurons intact. The slice was made horizontally at the inner layer of the retina using a vibratome slicer after the retina was embedded in the low-temperature melting agarose gel. In this horizontal slice preparation of the retina, we studied the function of retinal neurons compared with their morphology, by using patch-clamp recording, calcium imaging technique, immunocytochemistry, and single-cell RT-PCR.

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. Here, we describe the novel slicing method to preserve the dendritic morphology of retinal neurons intact.

إعداد شريحة الأفقي للشبكية

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. However, many of ...

Gene-gun Transfection of Hippocampal Neurons

مدفع الجينات ترنسفكأيشن من الخلايا العصبية قرن آمون

Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, organotypic slice cultures allow one to perform a number of manipulations that are not presently feasible in-vivo. To date, organtotypic embryonic brain slice cultures have been used to follow individual cells using time-lapse microscopy, manipulate the expression of genes in the ganglionic emanances (a region that is hard to target by in-utero electroporation), as well as for pharmacological studies. In this video protocol we demonstrate how to make organotypic slice cultures from rat embryonic day 18 embryos. The protocol involves dissecting the embryos, embedding them on ice in low melt agarose, slicing the embedded brains on the vibratome, and finally plating the slices onto filters in culture dishes. This protocol is also applicable in its present form to making organotypic slice cultures from different embryonic ages for both rats and mice. 

عضوي النمط من الثقافة شريحة أدمغة الفئران E18

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, ...

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to infection. Because these are the most potent antigen presenting cells, DCs are being increasingly used as a vaccine vector to study the induction of antigen-specific immune responses. In this video, we demonstrate the procedure for harvesting tibias and femurs from a donor mouse, processing the bone marrow and differentiating DCs in vitro. The properties of DCs change following stimulation: immature dendritic cells are potent phagocytes, whereas mature DCs are capable of antigen presentation and interaction with CD4+ and CD8+ T cells. This change in functional activity corresponds with the upregulation of cell surface markers and cytokine production. Many agents can be used to mature DCs, including cytokines and toll-like receptor ligands. In this video, we demonstrate flow cytometric comparisons of expression of two co-stimulatory molecules, CD86 and CD40, and the cytokine, IL-12, following overnight stimulation with CpG or mock treatment. After differentiation, DCs can be further manipulated for use as a vaccine vector or to generate antigen-specific immune responses by in vitro pulsing using peptides or proteins, or transduced using recombinant viral vectors. 

This video demonstrates the procedure for differentiating myeloid dendritic cells from mouse bone marrow. Isolation of mouse tibia and femur, and processing of bone marrow are demonstrated. Pictures demonstrating cell morphology before and after differentiation, and figures depicting cell phenotype and IL-12 production following maturation using CpG are shown.

ثقافة الخلايا الجذعية من الدم النخاعي السلائف نخاع العظم

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

Preparation and Maintenance of Dorsal Root Ganglia Neurons in Compartmented Cultures

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for neuronal survival and function. Neurotrophins are specifically required to maintain the survival and differentiation of innervating sensory neurons but the question of how these target-derived neurotrophins communicate to the cell body of innervating neurons has been an area of active research for over 30 years. The most commonly accepted model of how neurotrophin signals reach the cell body proposes that signaling endosomes carry this signal retrogradely along the axon. In order to study retrograde transport, a culture system was originally devised by Robert Campenot, in which cell bodies are isolated from their axons. The technique of preparing these compartmented chambers for culturing sensory neurons recapitulates the selective stimulation of neuron terminals that occurs in vivo following release of target-derived neurotrophins. Retrograde signaling events that require long-range microtubule dependent retrograde transport have important implications for the treatment of neurodegenerative disorders.

Here we describe the technique of preparing and maintaining compartmented chambers for culturing sensory neurons of the dorsal root ganglia.

إعداد وصيانة الخلايا العصبية العقد الجذرية الظهرية في الثقافات Compartmented

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

ثنائي الجزيء الإسفار التكملة (BiFC) الفحص عن البروتين البروتين في خلايا البصل التفاعل باستخدام مدفع الجينات هيليوس

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and to gain understanding of the origins of congenital kidney disease. More recently, the possibility of steering na&iuml;ve embryonic stem cells toward nephrogenic fates has been explored in the emerging field of regenerative medicine. Genetic studies in the mouse have identified several pathways required for kidney development, and a global catalog of gene transcription in the organ has recently been generated <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a>, providing numerous candidate regulators of essential developmental functions. Organogenesis of the rodent kidney can be studied in organ culture, and many reports have used this approach to analyze outcomes of either applying candidate proteins or knocking down the expression of candidate genes using siRNA or morpholinos. However, the applicability of organ culture to the study of signaling that regulates stem/progenitor cell differentiation versus renewal in the developing kidney is limited as cultured organs contain a compact extracellular matrix limiting diffusion of macromolecules and virus particles. To study the cell signaling events that influence the stem/progenitor cell niche in the kidney we have developed a primary cell system that establishes the nephrogenic zone or progenitor cell niche of the developing kidney ex vivo in isolation from the epithelial inducer of differentiation. Using limited enzymatic digestion, nephrogenic zone cells can be selectively liberated from developing kidneys at E17.5. Following filtration, these cells can be cultured as an irregular monolayer using optimized conditions. Marker gene analysis demonstrates that these cultures contain a distribution of cell types characteristic of the nephrogenic zone in vivo, and that they maintain appropriate marker gene expression during the culture period. These cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which greatly facilitates the study of candidate stem/progenitor cell regulator effects. Basic cell biological parameters such as proliferation and cell death as well as changes in expression of molecular markers characteristic of nephron stem/progenitor cells in vivo can be successfully used as experimental outcomes. Ongoing work in our laboratory using this novel primary cell technique aims to uncover basic mechanisms governing the regulation of self-renewal versus differentiation in nephron stem/progenitor cells.

In this report we describe a method for the isolation and culture of the progenitor cell niche from the embryonic mouse kidney that can be used to study signaling pathways regulating stem/progenitor cells of the developing kidney. These cultured cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which allows efficient manipulation of candidate pathways.

العزلة والثقافة في خلايا كلوية المنشأ من منطقة من الفأر الجنينية الكلى

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells. This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in oxygen (causes include insufficient blood vessel network, defective blood vessel, and anemia) or to an increased consumption of oxygen relative to the supply (caused by a sudden higher cell proliferation rate). Hypoxia can be physiologic or pathologic such as in solid cancers 1-3, rheumatoid arthritis, atherosclerosis etc&#x2026; Each tissues and cells have a different ability to adapt to this new condition. During hypoxia, hypoxia inducible factor alpha (HIF) is stabilized and regulates various genes such as those involved in angiogenesis or transport of oxygen 4. The stabilization of this protein is a hallmark of hypoxia, therefore detecting HIF is routinely used to screen for hypoxia 5-7. 
In this article, we propose two simple methods to induce hypoxia in mammalian cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of these cells.

Here we propose simple methods to induce hypoxia in cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of the cultures.

التعريفي واختبار نقص الأكسجة في الثقافة خلية

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

عزلة البروتينية ريبوسوم الوليدة منضم<em&gt; في المختبر</em&gt; لتحديد المواقع وقفة بالحركة على طول مرنا

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental biologist. For many organs it is difficult to access developing tissue to allow monitoring during ex vivo culture. The slice culture method allows access to tissue so that morphogenetic movements can be followed and specific cell populations can be targeted for manipulation or lineage tracing.
In this paper we describe a method of slice culture that has been very successful for culture of tooth germs in a range of species. The method provides excellent access to the tooth germs, which develop at a similar rate to that observed in vivo, surrounded by the other jaw tissues. This allows tissue interactions between the tooth and surrounding tissue to be monitored. Although this paper concentrates on tooth germs, the same protocol can be applied to follow development of a number of other organs, such as salivary glands, Meckel&#39;s cartilage, nasal glands, tongue, and ear.

Here we detail a method to culture tooth germs in mandible slices using a tissue chopper. This method allows unique access to the tooth during development, providing excellent opportunity for manipulation and lineage tracing, not available using more traditional culture methods.