ברצוננו להודות סמן Lucanic ו-Hwai ג&#39;ונג צ&#39;אנג לעזרה עם רכישת תמונות בהגדלה נמוכה של פרוסות בהיפוקמפוס כולו מוצג הווידאו הזה. אנחנו רוצים גם להודות שרה פריש עבור סיוע עם הטקסט המלווה את הסרטון.

פרוטוקול transfection BIOLISTIC הכנת כדורי כדורים טובים עד 6 חודשים, אך עלול להתחיל ירידה יעילות transfection לאחר 2-3 חודשים. תבליטים צריך להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס בנוכחות כדורי dessicant. תמיד להניח צלוחיות הנצנץ, שבו הכדורים מאוחסנים, חם לטמפרטורת החדר לפני פתיחת הבקבוקון. לפני תחילת העבודה יש ​​להכין: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Spermidine (0.05M) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CaCl 2 (1M) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> EtOH (100% גבוהה כיתה בקבוק סגור) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Autoclaved H 2 0 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דנ&quot;א להיות transfected </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Polyvinylpyrrolidone (PVP-20 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​המלאי) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 X 15 מ&quot;ל חרוטי (2/bullet סט) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Tubing (חתך לתוך 1 X ~ 30 אינץ&#39; / להגדיר כדור) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Scintillation בקבוקונים (סט 1/bullet) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התייבשות כדורי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 מ&quot;ל מזרק w / צינורות בצד </li></ul> הכן צינורות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש ~ 30 אינץ&#39; של צינורות (בערך 2 ס&quot;מ מעבר הרחבת זכות O-Ring) בתחנת צינורות w / N 2 גז (0.4 הלחץ) למינימום של 20 דקות. </li></ol> מזרז DNA על חרוזי זהב: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ה-DNA כדי להיות transfected בנפח 50 סך μmL בצינור microcentrifuge (50 מיקרוגרם לכל היותר DNA הכולל) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את 6-8 מ&quot;ג של זהב להעביר צינור microcentrifuge </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μL של spermidine 0.05M אל זהב sonicate עבור 20 שניות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את μL 50 של ה-DNA של זהב / spermidine </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס (סביב הגדרת 5) w / מכסה פתוח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף ירידה μL חכם של 100 1M CaCl 2 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate בקצרה (&lt;5 שניות) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר לזרז עבור 10 דקות ב temp חדר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate בקצרה </li></ol> הכן פתרון PVP במהלך sonication: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את לדלל פתרון PVP ב 15 מ&quot;ל חרוטי, 3.5mL לדלל PVP עבור כל קבוצה של כדורים (להוסיף 7.5 μL של המניה PVP 20mg/ml ל -3.5 מ&quot;ל EtOH 100%) </li></ol> שטיפה עם חרוזי זהב EtOH: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה חרוזי זהב במלוא המהירות על 10 שניות ב microcentrifuge </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant, אבל לשמור על כמות קטנה של נוזל על גבי חרוזי זהב </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3X עם 1ml EtOH, sonicate בקצרה בכל פעם, אם יהיה צורך </li></ol> Resuspend זהב / DNA בתמיסה PVP: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה זהב μL 200 של פתרון 3.5 מ&quot;ל PVP / EtOH לדלל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת כדורית הזהב resuspend (בקצרה sonicate במידת הצורך) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את μL 200 זהב / פתרון ל PVP חדש 15 מ&quot;ל חרוטי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך בדרך זו, והוסיף 200 μL של PVP בכל פעם עד שכל הזהב הועבר 15 מ&quot;ל חרוטי, ואת הנפח הסופי הוא 3.2 מ&quot;ל </li></ol> ציפוי צינורות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל N 2 בתחנת צינורות ולהסיר צינורות יבשים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף צינורות יבשים מזרק 10 מ&quot;ל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוקף לנער את 15 מ&quot;ל חרוטי מלא זהב / PVP </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את קצה הצינורית זהב / פתרון PVP ולמצוץ לאט להיות זהיר, כדי למנוע בועות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר ~ 2 אינץ&#39; יבש משני הקצוות של הצינור </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם צינור המחובר עדיין מזרק מלא פתרון זהב / PVP, בזהירות המקום בחזרה צינורות לתוך התחנה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן את קצות צינורות שבו פתרון יושב </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו הזהב להסתפק 5 דקות עם מזרק המצורף </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמצצי-up הפתרון לאט מאוד על ידי משיכת את המזרק כך התיישבו זהב הוא נשאר מאחור (לוודא שלא לשטוף גב) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתק את המזרק </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב 90 ° ולתת לשבת 2 שניות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיבוב 180 מעלות ולתת לשבת עוד 2 שניות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיבוב הצינור למשך 5 שניות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את N 2 שסתום כך נכתב בין 0.4-0.5 ו - ספין בצינור מצופה זהב תוך ייבוש דקות 5. </li></ol> חיתוך צינורות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צינורות מתחנת-הכנה בצינור וכיבה את ומסתיים הסימנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים בקבוקון scintillation מתויג תחת המסוק צינורות לתפוס מחסניות לחתוך </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום צינורות במסוק צינורות וחתך את צינורות עם סכין נקי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כדורי התייבשות בבקבוקון scintillation </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן מחסניות ב 4 ° C </li></ol> קליעה Slices רקמות בעת הירי פרוסות בתרבית, חשוב להעסיק טכניקה סטרילי יחסית, כדי למנוע זיהום. זכור, כי בעת הירי בשני דגמים שונים, שתי קבוצות של כדורים ניתן לטעון לתוך המחזק את המחסנית זהה, אך חבית אניה המסך צריך להיות שונה בין המבנים. לפני תחילת העבודה יש ​​להכין: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ה-DNA כדורים (שלא בקבוקון scintillation חמים לטמפרטורת החדר לפני הפתיחה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמות פרוסות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הליוס Gene Gun </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיכל הליום עם צינור אקדח גן מצורף &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> טונר בעל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אניה חבית פלסטיק עם O-Ring במקום </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מפזר (שינה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מפזר מסך </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצבטים </li></ul> Prepping את האקדח הגן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלקחיים שימוש במקום מחסניות פלסטיק מצופה זהב לתוך המחזק את המחסנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום בעל מחסנית לתוך אקדחו הגן על ידי הראשון להדוף לנעול </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Secure בעל מחסנית עם מנעול </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג אניה חבית עם טבעת-O ואת המסך מפזר בבטחה במקום </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בורג חבית אניה לתוך האקדח גן </li></ol> קליעה פרוסות תרבותי עם אקדח הגן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשים על אטמי אוזניים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את האקדח לתוך הגן מחובר טנק צינור גז הליום </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הלחץ על הטנק PSI 180 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תירה ריק לאוויר על מנת להסיר כל אבק או פסולת מן המסך מפזר. כדי לירות באקדח, תחילה לדכא את לחצן בטיחות משתלבים עד צפצופים אקדח, ואז ללחוץ על ההדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הירי ריק, להסיר את פרוסות מן החממה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מראש אקדח תחילה לבנות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תירה עם המסך מפזר על 0.5-1 ס&quot;מ מן הפרוסה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מראש את מחסנית בין בארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הירי גם האחרון, במקום פרוסות בחזרה לתוך החממה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את לחץ הגז ולשחרר לפני ניתוק את האקדח מן הצינור הליום </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הברג החוצה את אניה לחבית, ולהסיר את מחסנית הפגזים בשימוש </li></ol> ניקוי מחסנית בעלי ספינות חבית: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום מחסניות, ספינות לחבית, מסכי מפזר בכוס עם מים וסבון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כוס ב sonicator אמבטיה sonicate עבור 20 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביסודיות לשטוף עם מים עד שכל שאריות סבון יוסרו </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים EtOH 70% למשך שעה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים על מגבת נייר יבשה לילה יבש </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחסניות נקי, ספינות לחבית, מסכי מכן ניתן לעשות שימוש חוזר transfections biolistic הבאים </li></ol> הירי צרות טיפים transfection Biolistic Transfection Biolistic יכולה לפעמים לגרום transfection תנאים טובים. זה יכול להוביל מעט מדי או יותר מדי תאים רבים transfected, גבוה מדי או נמוך מדי רמות הביטוי, או עלול לגרום פרוסות הרקמה להיות בריא בדרך כלל. לעיתים קרובות התוצאה פרוסות בריא מהפיצוץ את הלחץ. הנה כמה טיפים כדי לקבל פרוסות הרקמה transfected בצורה אופטימלית. אם פרוסות להיראות בריא (או אם תאים רבים מדי transfected / פרוסה), נסה: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הירי הגדלת מרחק </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפחתת הלחץ על מיכל הדלק </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפחתת כמות זהב </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך החוצה את מרכז מפזר Bio-Rad והחלפת מרכז עם מסך מפזר. </li></ul> אם תאים מעטים מדי הם transfected, נסה: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקטנת מרחק הירי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ הולך וגובר על מיכל הדלק </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדלת כמות של זהב </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדלת מספר פרוסות הרקמה / טוב </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוודא O-Ring ב-לחבית אניה לא נפגע. </li></ul> אם אתה לקבל פרוסות עם שני תאים רבים מדי, מעט מדי transfected במהלך הירי באותו לוודא: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כי אתה מחזיק את האקדח באופן סימטרי מעל היטב </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהב כי היא שווה הציפוי הפנימי של צינורות. (אם אתה מקבל שורה של זהב, למשוך את supernatant מן הצינור בקצב מהיר פעם זהב יש התיישבו וסובב את הזהב כבר לפני הפעלת חנקן. אם, מצד שני, אתה מקבל פסים של זהב , זה צפוי עקב חשיפה לחות רבה מדי במהלך ביצוע כדור: ודא שאתה משתמש בקבוק סגור של EtOH, כי צינורות הוא יבש לחלוטין לפני הציפוי, וכי אתה מכסת מכסים הכנת כדורי מבעוד מועד). </li></ul> אם יעילות transfection נראה אופטימלי (# תאים transfected / פרוסה), אך רמת הביטוי נראה גבוה מדי או נמוך מדי: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים את ה-DNA יחס זהב. (למשל, אם הוא נמוך מדי לשמור על כמות של זהב אלא להגדיל את כמות ה-DNA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים את כמות הזמן בין ירי ואיסוף נתונים </li></ul> במקרה של transfection כפול, אם אתה מקבל ביטוי מעט מדי של אחד המבנים שלך, לשנות את היחס בין שני המבנים באופן המתאים וודא בונה הן תחת מקדם אותו, כדי לוודא שאף אחד היזם לא יהיה מחוץ להתחרות השני.

<ol>
	<li>Klein, T. M., Fromm, M., Weissinger, A., Tomes, D., Schaaf, S., Sletten, M., Sanford, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+foreign+genes+into+intact+maize+cells+with+high-velocity+microprojectiles.">Transfer of foreign genes into intact maize cells with high-velocity microprojectiles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 4305-4309 (1988).</li><li>Wellmann, H., Kaltschmidt, B., Kaltschmidt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+protocol+for+biolistic+transfection+of+brain+slices+and+dissociated+cultured+neurons+with+a+hand-held+gene+gun.">Optimized protocol for biolistic transfection of brain slices and dissociated cultured neurons with a hand-held gene gun.</a> J. Neurosci. Methods. 92, 55-64 (1999).</li><li>McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biolistic+transfection+of+neurons.">Biolistic transfection of neurons.</a> Sci. STKE. 51, 1-13 (2000).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li></ol>

Transfection Biolistic הוא אמצעי פיזי של transfecting תאים באמצעות הפגזה של רקמה חיה גבוהה עם ה-DNA מהירות החלקיקים מצופה זהב. ב העברת גנים בתיווך חלקיקים, תאים transfected כללי התוצאה כאשר הכדור מגיע לנוח בגרעין. בעוד רבים transfection שיטות שונות קיימות, כגון, microinjection lipofection, electroporation סידן פוספט, transfection ו transfection ויראלי, transfection biolistic יכולים להציע עבודה פחות אינטנסיבית, חלופה יעילה transfecting תאים שאינם transfected בקלות באמצעות שיטות אלה אחרים. למעשה, זה פותח לראשונה כטכניקה להעברת גנים בצמחים מאז נוכחות של התא הקיר עשוי transfection קשה בשיטות קודמות 1. באופן דומה, biolistics צברה פופולריות בתחום הנוירוביולוגיה מאז הפוסט mitotic הנוירונים קשה לשמצה transfect 2,3. בפרט, זוכה להכרה רחבה כטכניקה העיקרון לשמש בניסויים שמטרתם להעריך מורפולוגיה קנס של נוירונים בודדים פרוסות המוח ללא פגע. השיטות שתוארו כאן לספק הסבר מפורט ומקיף של כיצד לבצע transfection biolistic של פרוסות המוח בתרבית באמצעות כף יד גן ירייה (הליוס Gun ג&#39;ין המערכת; Bio-Rad). Transfection Biolistic הפכה השיטה המועדפת transfecting נוירונים בתרבית פרוסה משום שהוא מאפשר transfection של מספר מועט של תאים פרוסה ברחבי המוח. בדרך זו, נוירונים בודדים יכולים להיבחן במנותק. מאז הטכניקה הזו הוא גם מתאים במיוחד עבור transfecting הנוירונים במוח פרוסה, הוא משמש לעיתים קרובות בשילוב עם מיקרוסקופיה 2-פוטון, מאז להדמיה 2-פוטון מאפשר עירור של תאים שכותרתו fluorescently עמוק בתוך רקמת פיזור אור 4. אכן תמונות בהגדלה גדולה של נוירונים פירמידליים יחיד שהוצגו ברחבי וידאו זה נלכדו באמצעות אישית בנוי 2-פוטון מיקרוסקופ סריקת לייזר. ב transfection biolistic המסקנה היא אמצעי יעיל transfecting תאים בודדים בתוך ההקשר של צפיפות גבוהה של תאים המקיפים, וככזה הוכיחה מאוד שימושי עבור fluorescently תיוג נוירונים בודדים בתרבות פרוסה עצביים.

אמנם יש לנו את כל המוצרים המפורטים בנפרד, הוא חסכוני יותר לרכוש &quot;הליוס Gene-Gun מערכת&quot;, הכולל את כל מוצרי Bio-Rad המפורטים לעיל (חתול # 165-2431).

preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture

Transfection Biolistic הוא אמצעי פיזי של transfecting תאים על ידי מפציצים גבוהה רקמה עם דנ&quot;א חלקיקים מהירות מצופה. אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור transfection biolistic של פרוסות בהיפוקמפוס חולדה, החל בהכנה הראשונית של ה-DNA כדורים מצופים לירי הסופי של תרבויות פרוסה organotypic באמצעות אקדח גנים. אקדח transfection Gene הוא אמצעי יעיל וקל של transfecting נוירונים שימושית במיוחד fluorescently תיוג חלק קטן של תאים ורקמות פרוסה. בסרטון הזה, אנחנו הראשונים מתאר את הצעדים הנדרשים כדי חלקיקי זהב מעיל עם ה-DNA. אנחנו הבא להדגים כיצד לקו הפנימי של צינורות פלסטיק עם כדורי זהב / DNA, כיצד לחתוך את צינורות כדי להשיג את מחסניות פלסטיק עבור טעינת אקדח לתוך הגן. לבסוף, אנו מבצעים transfection biolistic של תרבויות עכברוש בהיפוקמפוס פרוסה, הוכחת טיפול של ביו רד הליוס אקדח גן, ומציעים ייעוץ ירי צרות לקבל פרוסות רקמה בריאה transfected בצורה אופטימלית.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture at JoVE.com

Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture

אנו מתארים שיטה להכנת דנ&quot;א כדורים מצופים זהב להדגים את השימוש בכדורים כאלה biolistically transfect נוירונים בהיפוקמפוס פרוסות תרבותי.

הכנת כדורי אקדח ין transfection Biolistic של נוירונים תרבות Slice

Biolistic transfection is a physical means of transfecting cells by bombarding tissue with high velocity DNA coated particles. We provide a detailed ...

preparation-gene-gun-bullets-biolistic-transfection-neurons-slice

Research

JoVE Journal

Biology

52.3K Views.  University of California, Davis. אנו מתארים שיטה להכנת דנ"א כדורים מצופים זהב להדגים את השימוש בכדורים כאלה biolistically transfect נוירונים בהיפוקמפוס פרוסות תרבותי.

Video: Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture

Horizontal Slice Preparation of the Retina

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. However, many of retinal neurons, such as amacrine cells, expand their dendrites horizontally, so that the morphology of the cells is supposed to be severely damaged in the vertical slices. In the whole-mount preparation, especially for patch-clamp recordings, retinal neurons in the middle layer are not easily accessible due to the extensive coverage of glial cell (Mueller cell) s endfeets. Here, we describe the novel slicing method to preserve the dendritic morphology of retinal neurons intact. The slice was made horizontally at the inner layer of the retina using a vibratome slicer after the retina was embedded in the low-temperature melting agarose gel. In this horizontal slice preparation of the retina, we studied the function of retinal neurons compared with their morphology, by using patch-clamp recording, calcium imaging technique, immunocytochemistry, and single-cell RT-PCR.

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. Here, we describe the novel slicing method to preserve the dendritic morphology of retinal neurons intact.

פורסים הכנה אופקי של הרשתית

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. However, many of ...

Gene-gun Transfection of Hippocampal Neurons

ג&#39;ין ירייה transfection של נוירונים בהיפוקמפוס

Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, organotypic slice cultures allow one to perform a number of manipulations that are not presently feasible in-vivo. To date, organtotypic embryonic brain slice cultures have been used to follow individual cells using time-lapse microscopy, manipulate the expression of genes in the ganglionic emanances (a region that is hard to target by in-utero electroporation), as well as for pharmacological studies. In this video protocol we demonstrate how to make organotypic slice cultures from rat embryonic day 18 embryos. The protocol involves dissecting the embryos, embedding them on ice in low melt agarose, slicing the embedded brains on the vibratome, and finally plating the slices onto filters in culture dishes. This protocol is also applicable in its present form to making organotypic slice cultures from different embryonic ages for both rats and mice. 

פורסים תרבות Organotypic של E18 מוח החולדה

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, ...

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to infection. Because these are the most potent antigen presenting cells, DCs are being increasingly used as a vaccine vector to study the induction of antigen-specific immune responses. In this video, we demonstrate the procedure for harvesting tibias and femurs from a donor mouse, processing the bone marrow and differentiating DCs in vitro. The properties of DCs change following stimulation: immature dendritic cells are potent phagocytes, whereas mature DCs are capable of antigen presentation and interaction with CD4+ and CD8+ T cells. This change in functional activity corresponds with the upregulation of cell surface markers and cytokine production. Many agents can be used to mature DCs, including cytokines and toll-like receptor ligands. In this video, we demonstrate flow cytometric comparisons of expression of two co-stimulatory molecules, CD86 and CD40, and the cytokine, IL-12, following overnight stimulation with CpG or mock treatment. After differentiation, DCs can be further manipulated for use as a vaccine vector or to generate antigen-specific immune responses by in vitro pulsing using peptides or proteins, or transduced using recombinant viral vectors. 

This video demonstrates the procedure for differentiating myeloid dendritic cells from mouse bone marrow. Isolation of mouse tibia and femur, and processing of bone marrow are demonstrated. Pictures demonstrating cell morphology before and after differentiation, and figures depicting cell phenotype and IL-12 production following maturation using CpG are shown.

התרבות של תאים דנדריטים מיאלואידית מ מבשרי מח עצם

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

Preparation and Maintenance of Dorsal Root Ganglia Neurons in Compartmented Cultures

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for neuronal survival and function. Neurotrophins are specifically required to maintain the survival and differentiation of innervating sensory neurons but the question of how these target-derived neurotrophins communicate to the cell body of innervating neurons has been an area of active research for over 30 years. The most commonly accepted model of how neurotrophin signals reach the cell body proposes that signaling endosomes carry this signal retrogradely along the axon. In order to study retrograde transport, a culture system was originally devised by Robert Campenot, in which cell bodies are isolated from their axons. The technique of preparing these compartmented chambers for culturing sensory neurons recapitulates the selective stimulation of neuron terminals that occurs in vivo following release of target-derived neurotrophins. Retrograde signaling events that require long-range microtubule dependent retrograde transport have important implications for the treatment of neurodegenerative disorders.

Here we describe the technique of preparing and maintaining compartmented chambers for culturing sensory neurons of the dorsal root ganglia.

הכנה ותחזוקה של הגב הגרעינים נוירונים רוט בתרבויות מחולקים

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

Bimolecular השלמה פלואורסצנטי (BiFC) Assay עבור אינטראקציה בין חלבונים בתאים בצל באמצעות אקדח הליוס ג&#39;ין

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and to gain understanding of the origins of congenital kidney disease. More recently, the possibility of steering na&iuml;ve embryonic stem cells toward nephrogenic fates has been explored in the emerging field of regenerative medicine. Genetic studies in the mouse have identified several pathways required for kidney development, and a global catalog of gene transcription in the organ has recently been generated <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a>, providing numerous candidate regulators of essential developmental functions. Organogenesis of the rodent kidney can be studied in organ culture, and many reports have used this approach to analyze outcomes of either applying candidate proteins or knocking down the expression of candidate genes using siRNA or morpholinos. However, the applicability of organ culture to the study of signaling that regulates stem/progenitor cell differentiation versus renewal in the developing kidney is limited as cultured organs contain a compact extracellular matrix limiting diffusion of macromolecules and virus particles. To study the cell signaling events that influence the stem/progenitor cell niche in the kidney we have developed a primary cell system that establishes the nephrogenic zone or progenitor cell niche of the developing kidney ex vivo in isolation from the epithelial inducer of differentiation. Using limited enzymatic digestion, nephrogenic zone cells can be selectively liberated from developing kidneys at E17.5. Following filtration, these cells can be cultured as an irregular monolayer using optimized conditions. Marker gene analysis demonstrates that these cultures contain a distribution of cell types characteristic of the nephrogenic zone in vivo, and that they maintain appropriate marker gene expression during the culture period. These cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which greatly facilitates the study of candidate stem/progenitor cell regulator effects. Basic cell biological parameters such as proliferation and cell death as well as changes in expression of molecular markers characteristic of nephron stem/progenitor cells in vivo can be successfully used as experimental outcomes. Ongoing work in our laboratory using this novel primary cell technique aims to uncover basic mechanisms governing the regulation of self-renewal versus differentiation in nephron stem/progenitor cells.

In this report we describe a method for the isolation and culture of the progenitor cell niche from the embryonic mouse kidney that can be used to study signaling pathways regulating stem/progenitor cells of the developing kidney. These cultured cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which allows efficient manipulation of candidate pathways.

בידוד והתרבות של תאים מאזור nephrogenic של הכליה עכבר עובריים

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells. This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in oxygen (causes include insufficient blood vessel network, defective blood vessel, and anemia) or to an increased consumption of oxygen relative to the supply (caused by a sudden higher cell proliferation rate). Hypoxia can be physiologic or pathologic such as in solid cancers 1-3, rheumatoid arthritis, atherosclerosis etc&#x2026; Each tissues and cells have a different ability to adapt to this new condition. During hypoxia, hypoxia inducible factor alpha (HIF) is stabilized and regulates various genes such as those involved in angiogenesis or transport of oxygen 4. The stabilization of this protein is a hallmark of hypoxia, therefore detecting HIF is routinely used to screen for hypoxia 5-7. 
In this article, we propose two simple methods to induce hypoxia in mammalian cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of these cells.

Here we propose simple methods to induce hypoxia in cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of the cultures.

אינדוקציה ובדיקה של היפוקסיה בתרבות התא

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

הבידוד של הריבוזום פוליפפטידים המתהווה כרוכים<em&gt; במבחנה</em&gt; כדי לזהות אתרים השהה של תרגום לאורך ה-mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental biologist. For many organs it is difficult to access developing tissue to allow monitoring during ex vivo culture. The slice culture method allows access to tissue so that morphogenetic movements can be followed and specific cell populations can be targeted for manipulation or lineage tracing.
In this paper we describe a method of slice culture that has been very successful for culture of tooth germs in a range of species. The method provides excellent access to the tooth germs, which develop at a similar rate to that observed in vivo, surrounded by the other jaw tissues. This allows tissue interactions between the tooth and surrounding tissue to be monitored. Although this paper concentrates on tooth germs, the same protocol can be applied to follow development of a number of other organs, such as salivary glands, Meckel&#39;s cartilage, nasal glands, tongue, and ear.

Here we detail a method to culture tooth germs in mandible slices using a tissue chopper. This method allows unique access to the tooth during development, providing excellent opportunity for manipulation and lineage tracing, not available using more traditional culture methods.