معتمدة حاليا الخلايا الجذعية الجنينية البشرية الدراسات في المختبر Teitell بواسطة معهد كاليفورنيا للطب التجديدي (CIRM) منح البذور RS1 - 00313. نشكر الدكتور كارلا كولر (جامعة كاليفورنيا) وأعضاء المختبر كوهلر عن تقديم المشورة والرؤى في هذه الدراسات وإضافية.

قرار واضح عالية Electophoresis جل الأصلية (hrCNE) لمجمع الميتوكوندريا فحوصات النشاط في جل واستمرت الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) على أحادي الطبقة من ˠ - المشع أو mitomycin الليفية الماوس C - تعامل الجنينية (MEFs) ، ثم تحولت إلى النمو على Matrigel لمدة 5 أيام في المتوسط ​​MEF مكيفة به الظروف القياسية. لإزالة تلوث MEFs ، تم إعادة hESCs مطلي على Matrigel ونمت في المتوسط ​​MEF مكيفة ل3 أيام إضافية. تم استخدام المجهر المناعي للعلامات تعدد القدرات أكتوبر - 4 - 4 وSSEA لتأكيد عدم وجود تمايز hESC. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع 1X PBS الحارة ، ودرجة الحموضة 7.4 ، تليها trypsinization (1ml من 1X التربسين لكل بئر في لوحة 6 أيضا) لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة حجم مساو من التربسين المانع الطازج (1X 1mg/ml في برنامج تلفزيوني ، ودرجة الحموضة 7.4). خلايا الحصاد وأجهزة الطرد المركزي في 200G ، 5 دقائق ، ودرجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل الخلايا وطاف في resuspend مكعبات 0.8 -- 1.7ml (استنادا إلى حجم الخلية بيليه) من الجليد الباردة عازلة عزل الميتوكوندريا (السكروز 83mM ؛ 6.6mM إيميدازول / حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 7.0) مع الطازجة 1 &#39;البروتياز كوكتيل المانع. احتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dounce الخلايا مع الخالط (~ 40-50 السكتات الدماغية). وصمة عار an قسامة من الخلايا dounced مع الأزرق التريبان للتحقق من اكتمال التجانس باستخدام مجهر الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ز الطرد المركزي في 20000 لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية في الحصول على النفط الخام الميتوكوندريا بيليه الذي يحتوي أيضا نواة الخلية وشظايا أكبر. صب وتجاهل طاف وتزن عجلت الخام الميتوكوندريا بيليه. ويمكن تخزين بيليه في -80 درجة مئوية بعد تجميد لحظة في النيتروجين السائل ، إذا كانت هذه هي نقطة التوقف. ملاحظة : يمكن استخدام الطرد المركزي التفاضلي أو غيرها من الإجراءات المستندة إلى التدرج من أجل عزل وجمع محض كسر غشاء الميتوكوندريا. انظر المرجع. 4 لمزيد من التفاصيل. وهذا النهج البديل العائد النشاط الميتوكوندريا المعقدة في ملغ من البروتين بدلا من الميتوكوندريا النشاط المعقدة في ملغ من وزن الخلية أو عدد الخلايا. وسوف تركز بروتينات الميتوكوندريا يجب أن يتم تحديد بعد تنقيتها لجعل هذه المقارنة. أيضا ، قد تكون هناك حاجة إلى العزلة عازلة مختلفة لهذا النهج. لsolubilization من الكسر غشاء الميتوكوندريا نقية ، انظر الملاحظة التالية الخطوة 6 أدناه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Solubilize الخام الميتوكوندريا بيليه على الثلج بواسطة vortexing مع العازلة solubilization الجليد الباردة (50mM ، 50mM إيميدازول كلوريد الصوديوم / حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.0 ، 1MM EDTA ، 2mm و6 aminohexanoic حامض). يمكن استبدال حمض 6 aminohexanoic مع كوكتيل البروتياز المانع 1X. 35μl استخدام المخزن المؤقت في solubilization 20mg من وزن بيليه. إضافة 20μl 10 ٪ ث / ت ديجيتونين 20mg لكل من وزن بيليه ومزيج عبها بواسطة الأنبوب. لاحتضان 5-10 دقيقة على الجليد. يمكن أن تكون بديلا دوديسيل - BD - maltoside أو تريتون X - 100 لديجيتونين لsolubilize البروتينات. يجوز للاختيار من المنظفات وكميته تؤثر على تكوين أشكال أو supercomplexes multimeric المجمعات الميتوكوندريا. لمزيد من المعلومات ، انظر ref.1. ملاحظة : كمية من المنظفات اللازمة لsolubilize محض كسر غشاء الميتوكوندريا يناظر نسبة الوزن المنظفات / البروتين تتراوح بين 6G - 2 / ز النسبة المثلى لsolubilize أغشية الميتوكوندريا هي 2.5G / ز لدوديسيل - BD - maltoside ، 3G / ز لتريتون X - 100 ، و6G / ز لديجيتونين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لبيليه في solubilized 100000 ز لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. جمع طاف واضحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى تحميل العازلة الجلسرين النهائي ث / ت 5 ٪ و 0.01 ٪ W / V الشقائقية S (استخدام 50 ٪ ث / ت الجلسرين ، و 0.1 ٪ وزن / حجم المخزون الاحتياطي الشقائقية S حل التحميل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل الآبار هلام مع وحدة التخزين التي تحتوي على 20 - 40mg من بيليه الميتوكوندريا الخام في الممر. استخدام هلام تدرج الأكريلاميد (4 -13 ٪) مع 3.5 ٪ التراص هلام. ملاحظة : إعداد جيل والشروط الكهربائي : لتحضير هلام ، واستخدام مادة الأكريلاميد / مكرر الأكريلاميد (AA / bisAA) 3 المزيج على النحو التالي : 48G 1.5G من الأكريلاميد وbisacrylamide من (49.5 ٪ T ، 3 ٪ C. T أين هو التركيز الكلي لألف وbisAA و C النسبة المئوية للcrosslinker (bisAA) لمونومر المجموع). هلام العازلة (3 &#39;) : 6 - 1.5M aminohexanoic حمض ؛ إيميدازول 75mM ، ودرجة الحموضة 7.0 </li></ol><table style="padding-left: 60px;;text-align:right;direction:rtl" border="0"><tbody><tr><td> التدرج الجل : </td><td> 4 ٪ </td><td> 13 ٪ </td><td> التراص الجل : </td><td> 3.5 ٪ </td></tr><tr><td> AA / 3 مزيج bisAA </td><td> 2 مل </td><td> 6.5 مل </td><td></td><td> 0.6 مل </td></tr><tr><td> هلام العازلة 3 &#39; </td><td> 8.3 مل </td><td> 8.3 مل </td><td></td><td> 2.7 مل </td></tr><tr><td> الغليسيرول </td><td></td><td> 5 ز </td><td></td><td></td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 14.7 مل </td><td> 5 مل </td><td></td><td> 4.7 مل </td></tr><tr><td> اجمالى حجم </td><td> 25 مل </td><td> 25 مل </td><td></td><td> 8 مل </td></tr><tr><td> 10 ٪ وكالة الأنباء الجزائرية </td><td> 139 ميكرولتر </td><td> 125 ميكرولتر </td><td></td><td> 67 ميكرولتر </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> 14 ميكرولتر </td><td> 12.5 ميكرولتر </td><td></td><td> 6.7 ميكرولتر </td></tr></tbody></table> الأنود العازلة : 25mM إيميدازول / حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 7.0 العازلة الكاثود : Tricine 50mM ، 7.5mM إيميدازول / حمض الهيدروكلوريك ، 0.02 ٪ W / V - BD - دوديسيل maltoside ، 0.05 ٪ W / V deoxycholate ، ودرجة الحموضة 7.0 صب وتشغيل المواد الهلامية في غرفة باردة (4-7 درجة مئوية). الجهد 100V الأولية المستخدمة. عندما دخلت عينة هلام التراص ، يتم رفع الجهد إلى 500V مع محدودة الحالية ل15mA (على 0.15 &#39;14&#39; 14 سم ، والمواد الهلامية). توقفت الكهربائي بعد ح 3-4 عند خط حاد في صبغ أحمر الشقائقية S نهج الجبهة هلام. بدلا من ذلك ، يمكن تشغيل هلام بين عشية وضحاها مع الجهد المستمر في 100V - 70. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقايسات النشاط في جل. وقت الحضانة لكل مقايسة يعتمد على كفاءة solubilization البروتين وكمية المواد المحملة لكل بئر. مجمعات الأول والرابع والخامس العائد عادة أقوى من اشارات المجمعات الثاني والثالث. </li></ol> المجمع الأول (CI) احتضان شريحة هلام مع العازلة CI (5mM تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 7.4 ؛ 0.1mg/ml NADH ؛ 2.5mg/ml NBT) في درجة حرارة الغرفة لعدة ساعات. CI العازلة : إضافة لكل من 100ML 5mM تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 7.4 : 0.01g NADH 0.25g NBT إصلاح هلام في الميثانول بنسبة 50 ٪ وحامض الخل بنسبة 10 ٪ عن 15-45 دقيقة. يحفظ الجل ثابتة في حامض الخليك 10 ٪. المجمع الثاني (CII) احتضان شريحة هلام مع العازلة CII (الصوديوم 20mM سكسينات ؛ 0.2mM methasulfate phenazine ؛ 2.5mg/ml NBT ؛ 5mM تريس حمض الهيدروكلوريك ، الرقم الهيدروجيني 7.4) في درجة حرارة الغرفة لعدة ساعات. CII العازلة : إضافة لكل من 100ML 5mM تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 7.4 : 200μl سكسينات الصوديوم 1M 80μl methasulfate phenazine (PMS 250mM الذائبة في DMSO) 0.25g NBT إصلاح هلام صفه للمجمع الأول المجمع الثالث (CIII) احتضان شريحة هلام مع العازلة CIII (50mM فوسفات الصوديوم ، ودرجة الحموضة 7.2 ، 0.05 ٪ 3،3 &#39;- diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)) في درجة حرارة الغرفة لعدة ساعات. CIII العازلة : إضافة الرقم الهيدروجيني في 100ML الصوديوم والفوسفات و50mM 7.2 : 50mg diaminobenzidine tetrahydrochloride إصلاح هلام صفه للمجمع الأول المجمع الرابع (CIV) احتضان شريحة هلام مع العازلة CIV (50mM فوسفات الصوديوم ، ودرجة الحموضة 7.2 ، 0.05 ٪ 3،3 &#39;- diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) ، 50μM الحصان القلب السيتوكروم ج) في درجة حرارة الغرفة لعدة ساعات. CIV العازلة : إضافة الرقم الهيدروجيني في 100ML الصوديوم والفوسفات و50mM 7.2 : 50mg diaminobenzidine tetrahydrochloride 0.1g الحصان القلب السيتوكروم ج إصلاح هلام صفه للمجمع الأول المجمع الخامس (CV) احتضان شريحة هلام العازلة مع السيرة الذاتية (35mM تريس القاعدة ، جليكاين 270mM ، ودرجة الحموضة 8.3 عند 25 درجة مئوية ، 14mM MgSO 4 ، 0.2 ٪ ث / ت الرصاص (NO 3) 2 ، 8MM ATP) في درجة حرارة الغرفة لعدة ساعات. السيرة الذاتية العازلة : 100ML لكل من الحل إضافة : <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> تريس القاعدة </td><td> 0.424g </td></tr><tr><td> جليكاين </td><td> 2.026g </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 0.345g </td></tr><tr><td> PB (NO 3) 2 </td><td> 0.29g </td></tr></tbody></table> لا حاجة لتعديل درجة الحموضة (يجب أن تكون 8.3) -- عدم استخدام حمض أو قاعدة. وإضافة فلتر <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ATP </td><td> 0.441g </td></tr></tbody></table> إصلاح هلام في الميثانول بنسبة 50 ٪ لمدة 30 دقيقة ، ونقل إلى الماء.

<ol>
	<li>Wittig, I., Braun, H. -. P., Sch&#747;gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+PAGE.">Blue native PAGE.</a> Nature Protocols. 1, 418-428 (2006).</li><li>Wittig, I., Karas, M., Sch&#747;gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Resolution+Clear+Native+Electrophoresis+for+In-gel+Functional+Assays+and+Fluorescence+Studies+of+Membrane+Protein+Complexes.++6.">High Resolution Clear Native Electrophoresis for In-gel Functional Assays and Fluorescence Studies of Membrane Protein Complexes. 6.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 6, 1215-1225 (2007).</li><li>Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Sch&#747;gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assays+in+high-resolution+clear+native+gels+to+quantify+mitochondrial+complexes+in+human+biopsies+and+cell+lines.">Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines.</a> Electrophoresis. 28, 3811-3820 (2007).</li><li>Castle, J. D., Coligan, J. E., Dunn, B. M., Speicher, D. W., Wingfield, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Organelles+from+Mammalian+Cells.">Purification of Organelles from Mammalian Cells.</a> Current Protocols in Protein Science. 4.2, 4.2.1-4.2.57 (2007).</li></ol>

في هذا الفيديو ، ووصف لنا استخراج البروتين المجمعات الميتوكوندريا من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية ، والانفصال عن طريق قرار واضح عالية هلام إستشراد الأصلي (hrCNE) ، وتحليل لاحق من قبل في جل المقايسات نشاط الحفاز. hrCNE يحل مجمعات البروتين غشاء الميتوكوندريا في قرار مشابه لذلك من ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>0.5M EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP120-1</td>
<td>adjust pH to 8.0 with NaOH </td>
</tr>
<tr>
<td>1M NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S3014-500MG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1M Sodium succinate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific </td>
<td>S413-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.1M Sodium phosphate buffer pH 7.2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP332-1 and BP329-1</td>
<td>Mix 68.4 ml of 1M Na2HPO4 and 31.6 ml of 1M NaH2PO4 to prepare 0.1M sodium phosphate buffer with pH 7.2 at 25 C </td>
</tr>
<tr>
<td>1M Tricine, pH 7.0 (adjusted with NaOH)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD</td>
<td>9010</td>
<td>store at 4 C </td>
</tr>
<tr>
<td>1M imidazole/HCl, pH 7.0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>I-2399</td>
<td>store at 4 C</td>
</tr>
<tr>
<td>1M Tris-HCl, pH 7.4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific </td>
<td>BP153-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>20% (wt/vol) dodecyl-b-D-maltoside (DDM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>44205-500MG</td>
<td>Dissolved in water. Store 1 ml aliquots at &#x2013;20 C.</td>
</tr>
<tr>
<td>10% (wt/vol) digitonin (>50% purity, used without recrystallization)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>37008-1G</td>
<td>Dissolved in water. Store 0.1&#x2013;1 ml aliquots at &#x2013;20 C. Should be warmed up to 95 C before use.</td>
</tr>
<tr>
<td>2M 6-aminohexanoic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>07260-100G</td>
<td>store at 4 C</td>
</tr>
<tr>
<td>10x Ponceau S/glycerol stock solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P-3504 and G6279-1L</td>
<td>0.1% Ponceau S, 50% glycerol, (wt/vol) in water.</td>
</tr>
<tr>
<td>10% w/v sodium deoxycholate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka </td>
<td>30970-25G</td>
<td>Dissolved in water. Must be protected from light. Adjust pH to 7.0 with HCl, filter and store at room temperature.</td>
</tr>
<tr>
<td>250 mM phenazine methasulfate (PMS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>TCI America</td>
<td>P0083</td>
<td>Dissolved in DMSO and aliquoted. Store at &#x2013;20 C.</td>
</tr>
<tr>
<td>Nitro-blue tetrazolium (NBT)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amresco </td>
<td>0329-1G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>3,3&#x2019;-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>TCI America </td>
<td>D0078</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pb(NO3)2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific </td>
<td>L62-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MgSO4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific </td>
<td>BP213-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris base </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific </td>
<td>BP152-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>G45-212</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Adenosine 5&#x2019;-triphosphate disodium salt (ATP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td>A2383-5G</td>
<td>Grade I, minimum 99%</td>
</tr>
<tr>
<td>beta-nicotineamide adenine dinucleotide (NADH) reduced form </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td>N-8129</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytochrome c From horse heart</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td>C2506-250MG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sucrose </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific </td>
<td>BP220-212</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100x protease inhibitor cocktail</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td>P8340</td>
<td>Store at &#x2013; 20 C.</td>
</tr>
<tr>
<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>D128-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypan blue Stain 0.4%</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco </td>
<td>15250-061</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10x Trypsin (0.5%)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco </td>
<td>15400-054</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin Inhibitor </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco </td>
<td>17075-029</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

probing for mitochondrial complex activity in human embryonic stem cells

الميتوكوندريا هي العضيات السيتوبلازمية التي لها دور أساسي في عملية الأيض الخلوية والتوازن ، وتنظيم شبكة الخلية إشارات ، وموت الخلايا المبرمج. الميتوكوندريا إنتاج ATP ، وتنظيم الدولة وحشوية الأكسدة CA2 ميزان + ، يقوض الأحماض الدهنية ، واصطناع الهيم ، النيوكليوتيدات ، وهرمونات الستيرويد ، والأحماض الأمينية ، وتساعد على تجميع الحديد والكبريت في مجموعات البروتينات. الميتوكوندريا أيضا أن يكون له دور أساسي في إنتاج الحرارة. الطفرات للجينوم الميتوكوندريا تسبب عدة أنواع من اضطراب الإنسان. تراكم الطفرات و mtDNA يرتبط مع الشيخوخة ، ويشتبه في أن لها دورا هاما في تطور السرطان. نظرا لدورها المهم جدا في جميع أنواع الخلايا ، يجب أن يكون وظيفة الميتوكوندريا أيضا أن تكون حاسمة للخلايا الجذعية. وقد تم إحراز تقدم رئيسي في فهمنا للبقاء الخلايا الجذعية ، والانتشار ، والقدرة على التمايز. ولكن النشاط الوظيفي للخلايا الجذعية ، وبخاصة الوضع الطاقة لديها ، لم يتم بعد دراستها بالتفصيل. ولا يعرف شيء تقريبا عن خصائص الميتوكوندريا من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) وذريتها السلائف متباينة. طريقة واحدة لفهم وتقييم دور في وظيفة الميتوكوندريا hESC والتنموية المحتملة لقياس مباشرة نشاط المجمعات التنفسي الميتوكوندريا. هنا ، نحن تصف قرار واضح عالية هلام إستشراد الأصلية واللاحقة في التصور النشاط هلام كوسيلة لتحليل خمسة مجمعات سلسلة من hESCs الجهاز التنفسي.

Watch this Scientific Journal Video about Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

في هذا الفيديو ، وسوف نظهر لكم كيف يمكن تحليل السلسلة التنفسية الميتوكوندريا مجمعات بشرية باستخدام الخلايا الجذعية الجنينية في المقايسات النشاط هلام.

سبر للنشاط مجمع الميتوكوندريا في خلايا المنشأ الجنينية البشرية

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

probing-for-mitochondrial-complex-activity-human-embryonic-stem

Research

JoVE Journal

Biology

14.2K Views.  University of California, Los Angeles. في هذا الفيديو ، وسوف نظهر لكم كيف يمكن تحليل السلسلة التنفسية الميتوكوندريا مجمعات بشرية باستخدام الخلايا الجذعية الجنينية في المقايسات النشاط هلام.

Video: Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

انتشار الخلايا الجنينية البشرية (ES) الجذعية

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

اشتقاق الخلايا الجذعية الجنينية البشرية التي Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

مناعي لونين من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of the predominant imaging modalities to assess the restoration of the injured myocardium. Furthermore, ex-vivo labeling agents, such as iron-oxide nanoparticles, have been employed to track and localize the transplanted stem cells. However, this method does not monitor a fundamental cellular biology property regarding the viability of transplanted cells. It has been known that manganese chloride (MnCl2) enters the cells via voltage-gated calcium (Ca2+) channels when the cells are biologically active, and accumulates intracellularly to generate T1 shortening effect. Therefore, we suggest that manganese-guided MRI can be useful to monitor cell viability after the transplantation of hESC into the myocardium.
In this video, we will show how to label hESC with MnCl2 and how those cells can be clearly seen by using MRI in vitro. At the same time, biological activity of Ca2+-channels will be modulated utilizing both Ca2+-channel agonist and antagonist to evaluate concomitant signal changes.

In this video, we are showing how to label human embryonic stem cells (hESC) with manganese chloride (MnCl2) which can enter cells via voltage-gated calcium channels when the cells are biologically active. Additionally, we show the use of MnCl2 as cellular MRI contrast agent to determine the in vitro viability of hESC.

وصفها في المختبر من خلايا المنشأ الجنينية البشرية لتصوير بالرنين المغناطيسي

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

الثقافة والمحافظة على الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture conditions they become prone to acquire chromosomal anomalies such as addition of whole or parts of chromosomes. Indeed, during long-term culture, karyotypic alterations are observed when enzymatic or chemical dissociation are used 2,3,4, while manual dissection of colonies for passaging retains a stable karyotype 5. Besides, changes in the environment such as the removal of feeder cells also seem to compromise the genetic integrity of hESC 3,6. Once chromosomal alterations could affect cellular physiology, the characterization of the genetic integrity of hESC in vitro is crucial considering hESC as an essential tool in embryogenesis studies and drug testing. Furthermore, for future therapeutic purposes chromosomal changes are a real concern as it is frequently associated to carcinogenesis.
Here we show a simple and useful method to obtain high quality chromosome spreads for subsequent analysis of chromosome set by G-banding, FISH, SKY or CGH techniques 7,8. We recommend checking the chromosomal status routinely with intervals of 5 passages in order to monitor the appearance of translocations and aneuploidies
Priscila Britto and Rafaela Sartore contributed equally to the paper.

Karyotyping is a simple and useful technique widely used for detecting genetic alterations. Here we describe a step by step protocol for chromosome spread preparation of human embryonic stem cells for monitoring the chromosomal status of these cells maintained in culture.

الكروموسومات التحضير انتشار الخلايا الجذعية الجنينية البشرية لKaryotyping

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

تجميد والذوبان الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

الفيديو المعلوماتية الحيوية تحليل النمو البشري الخلية الجذعية الجنينية كولوني

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

تمايز الخلايا الجذعية الجنينية في السلائف Oligodendrocyte

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.