Teitell 연구소에서 인간 배아 줄기 세포 연구는 현재 재생 의료에 대한 캘리포니아 연구소 (CIRM) 씨앗 부여 RS1 - 00313에 의해 지원됩니다. 우리는 이러한 추가적인 연구에 조언과 통찰력을 제공하는 박사 칼라 쾰러 (UCLA)와 쾰러 실험실 구성원 감사합니다.

Mitochondrial 콤플렉스에 대한 고해상도 네이티브 클리어 젤 Electophoresis (hrCNE)가 인 - 젤 활동 Assays 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)은 다음 표준 약관을 사용 MEF - 냉방 중간에 5 일 동안 Matrigel에서 성장으로 전환 ˠ - 조사 또는 mitomycin C - 대우 마우스 배아 섬유아 세포 (MEFs)의 monolayer에서 유지 관리되었습니다. MEFs 오염을 제거하려면, hESCs는 Matrigel에 다시 도금 및 추가 3 일간 MEF - 냉방 매체 성장했다. pluripotency 마커 월 4 SSEA - 4 Immunofluorescence 현미경은 hESC 차별 부족을 확인하는 데 사용되었다. <ol><li> 5 분 trypsinization (6 잘 플레이트에 따라 잘 1ml 1X의 트립신) 다음 따뜻한 1X PBS, pH를 7.4와 세포를 씻으십시오. </li><li> 신선한 트립신 억제제의 동일한 음량을 (1X PBS, pH를 7.4에서 1mg/ml) 추가합니다. 200g에 수확 세포와 원심 분리기, 5 분, 실온. </li><li> 신선한 1 &#39;테아제 억제제 칵테일과 함께, 1.7ml (세포 펠렛의 크기에 따라) 얼음 차가운 mitochondria 절연 버퍼 (6.6mM 이미다졸 / HCL, pH를 7.0 83mM 자당)의 - 0.8에서 뜨는 및 resuspend pelleted 세포를 폐기하십시오. 10 분 얼음에 품어. </li><li> 균 질기 (- 50 치기 ~ 40)와 세포를 다운스. 가벼운 현미경을 사용하여 균질의 완전성을 확인 trypan 파랑과 dounced 세포의 나누어지는 스테인. </li><li> 4 10 분 2만그램에서 원심 분리기 ° C 또한 핵 및 큰 세포 조각이 들어있는 원유 mitochondrial 펠렛을 얻을 수 있습니다. 가만히 따르다가와 뜨는을 버리고 시켰던 원유 mitochondrial 펠렛의 무게. 펠렛은 -80에 저장할 수 있습니다 ·이가 멈추는 지점있다면 C 액화 질소에 즉시 냉동에 따라. 참고 : 차등 원심 분리 또는 기타 그라디언트 기반 절차가 순수한 mitochondrial 막 분획을 분리하고 수집하기 위해 사용될 수 있습니다. 심판을 참조하십시오. 자세한 내용은 4. 이러한 대체 방법은 mitochondrial 단백질 대신 세포 중량 또는 휴대폰 번호의 MG 당 복잡한 활동의​​ MG 당 mitochondrial 복잡한 활동을 얻을 것입니다. mitochondrial 단백질의 농도는이 비교를하기 위해 정화 후 결정이 필요합니다. 또한, 다른 절연 버퍼이 접근 방식이 필요할 수 있습니다. 순수 mitochondrial 막 분획의 solubilization 들어, 아래의 단계 6 다음의 참고를 참조하십시오. </li><li> 얼음 차가운 solubilization 버퍼 (50mM NaCl, 50mM 이미다졸 / HCL 산도 7.0, 1mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 2mM 6 aminohexanoic 산성)과 vortexing하여 얼음에 원유 mitochondrial 펠렛을 Solubilize. 6 - aminohexanoic 산성은 1X 테아제 억제제 칵테일로 교체할 수 있습니다. 펠렛 중량의 20mg 당 solubilization 버퍼의 35μl를 사용하십시오. 10% 펠렛 중량 및 튜브를 flicking하여 믹스 20mg 당 W / V digitonin의 20μl를 추가합니다. 얼음 5-10 분 알을 품다. Dodecyl - BD - maltoside 또는 트리톤 X - 100은 단백질을 solubilize하는 digitonin에 대한 대체하실 수 있습니다. 세제 및 수량의 선택은 supercomplexes 또는 mitochondrial 단지의 multimeric 형태의 형성에 영향을 줄 수 있습니다. 자세한 내용은 ref.1를 참조하십시오. 참고 : 순수한 mitochondrial 막 분획을 solubilize에 필요한 세제의 수량 2~6그램 / G. 이르는 세제 / 단백질 무게 비율에 해당하는 mitochondrial 세포막을 solubilize하는 최적의 비율이 dodecyl - BD - maltoside에 대한 G / 2.5G이며, 대한 3g / G 트리톤 X - 100과 6g / digitonin에 대한 g. </li><li> 4 15 분 ° C.에 대한 10만그램에서 solubilized 펠릿을 원심 분리기 맑은 뜨는를 수집합니다. </li><li> 최종 5% W / V 글리세롤과 0.01 % W / V 개양귀비빛의 S (50 % W / V 글리세롤, 0.1 % W / V 개양귀비빛의 S 로딩 버퍼 재고 솔루션을 사용)에 버퍼를 로드할 추가합니다. </li><li> 레인 당 원유 mitochondrial 펠릿 20 - 40mg이 들어있는 볼륨 젤 우물을로드합니다. 3.5 %가 젤 스태킹있는 아크릴 아미드 기울기 젤 (4 -13 %)를 사용합니다. 참고 : 젤 준비와 전기 영동 조건 : bisacrylamide의 아크릴 아미드와 1.5g (49.5 % T, T는 AA와 bisAA와 C의 총 농도는 3% C.가의 48g : 겔 준비, 다음과 같은 아크릴 아미드 / 비스 - 아크릴 아미드 (AA / bisAA) 3 믹스를 사용하여 총 단량체로 crosslinker (bisAA)의 비율). 젤 버퍼 (3 &#39;) : 1.5M 6 - aminohexanoic 산성, 75mM 이미다졸, 산도 7.0 </li></ol><table style="padding-left: 60px;" border="0"><tbody><tr><td> 그라데이션 젤 : </td><td> 4퍼센트 </td><td> 13% </td><td> 젤 스태킹 : </td><td> 3.5 % </td></tr><tr><td> AA / bisAA 세 믹스 </td><td> 2 ML </td><td> 6.5 ML </td><td></td><td> 0.6 ML </td></tr><tr><td> 젤 버퍼 3 &#39; </td><td> 8.3 ML </td><td> 8.3 ML </td><td></td><td> 2.7 ML </td></tr><tr><td> 글리세린 </td><td></td><td> 5g </td><td></td><td></td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 14.7 ML </td><td> 5 ML </td><td></td><td> 4.7 ML </td></tr><tr><td> 총 부피 </td><td> 25 ML </td><td> 25 ML </td><td></td><td> 8 ML </td></tr><tr><td> 10 % APS </td><td> 139 μl </td><td> 125 μl </td><td></td><td> 67 μl </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> 14 μl </td><td> 12.5 μl </td><td></td><td> 6.7 μl </td></tr></tbody></table> 양극 버퍼 : 25mM 이미다졸 / HCL, pH를 7.0 음극 버퍼 : 50mM Tricine, 7.5mM 이미다졸 / HCL, 0.02 % W / V dodecyl - BD - maltoside, 0.05 % W / V deoxycholate, 산도 7.0 기름을 붓고 감기 방 (4-7 ° C)에서 젤을 실행합니다. 사용되는 초기 전압은 100V입니다. 예제는 스태킹 젤 입력되면, 전압은 15mA (0.15 &#39;14&#39;14 cm 젤)로 현재 제한과 500V 증가합니다. 전기 영동은 붉은 개양귀비빛의 S 염료의 날카로운 라인이 젤 전면에 접근 3-4 H 후에 중지됩니다. 또는 젤은 70 100V에서 일정한 전압 밤새 실행할 수 있습니다. <ol><li> 인 겔 활동 assays. 각 분석에 대한 부화의 시간은 단백질 solubilization의 효율성과 잘 당 로드된 자료의 양에 따라 달라집니다. 단지 I, IV 및 V는 일반적으로 단지 II 및 III보다 강한 신호를 얻을 수 있습니다. </li></ol> 콤플렉스 I (CI) 몇 시간 동안 실온에서 CI 버퍼 (2.5mg/ml NBT,, 0.1mg/ml NADH 5mM 트리스 - HCL, pH를 7.4)로 겔 슬라이스를 품어. CI 버퍼 : 5mM 트리스 - HCL, pH를 7.4의 100ml 당 추가 : 0.01g NADH 0.25g NBT 15-45 분의 50 %와 10 %의 메탄올 초산에​​서 젤 수정. 고정 젤은 10% 초산에 보존되어 있습니다. 콤플렉스 II (CII) 몇 시간 동안 실온에서 CII 버퍼 (5mM 트리스 - HCL pH는 7.4, 0.2mM phenazine의 methasulfate,, 2.5mg/ml NBT succinate 20mM 나트륨)로 겔 슬라이스를 품어. CII 버퍼 : 5mM 트리스 - HCL, pH를 7.4의 100ml 당 추가 : 200μl 1M 나트륨 succinate 80μl의 phenazine의 methasulfate (250mM PMS는 DMSO에 용해) 0.25g NBT 처럼 복잡한에 대한 설명 젤 수정 콤플렉스 III (CIII) 상온에서 몇 시간 동안, CIII 버퍼 (0.05 % 3,3 &#39;- diaminobenzidine의 tetrahydrochloride (DAB) 50mM 인산 나트륨, 산도 7.2)로 겔 슬라이스를 품어. CIII 버퍼 : 50mM 인산 나트륨, 산도 7.2 100ml 당 추가 : 50mg의 diaminobenzidine의 tetrahydrochloride 처럼 복잡한에 대한 설명 젤 수정 콤플렉스 IV (문학) 몇 시간 동안 실온에서, 문학 버퍼 (0.05 % 3,3 &#39;- diaminobenzidine의 tetrahydrochloride (DAB), 50μM 말을 마음 시토크롬 C 50mM 인산 나트륨, 산도 7.2)로 겔 슬라이스를 품어. 문학 버퍼 : 50mM 인산 나트륨, 산도 7.2 100ml 당 추가 : 50mg의 diaminobenzidine의 tetrahydrochloride 0.1g 말을 마음 시토크롬 C 처럼 복잡한에 대한 설명 젤 수정 콤플렉스 V (CV) CV 버퍼 (35 밀리 트리스베이스, 270mM 글리신, 25 pH를 8.3 ° C, 14mM MgSO 4, 0.2 % W / V PB (NO 3) 2, 필름 ATP) 몇 시간 동안 실온에서.로 겔 슬라이스를 품어 CV 버​​퍼 : 솔루션의 당 100ml 추가 : <table border="0"><tbody><tr><td> 트리스베이스 </td><td> 0.424g </td></tr><tr><td> 글리신 </td><td> 2.026g </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 0.345g </td></tr><tr><td> PB (NO 3) 2 </td><td> 0.29g </td></tr></tbody></table> 산도를 (8.3 있어야합니다) 조정 필요 - 산성이나베이스를 사용하지 마십시오. 필터 추가 <table border="0"><tbody><tr><td> ATP </td><td> 0.441g </td></tr></tbody></table> 30 분 50 % 메탄올에서 젤를 수정하고 물을 전송할 수 있습니다.

<ol>
	<li>Wittig, I., Braun, H. -. P., Sch&#747;gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+PAGE.">Blue native PAGE.</a> Nature Protocols. 1, 418-428 (2006).</li><li>Wittig, I., Karas, M., Sch&#747;gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Resolution+Clear+Native+Electrophoresis+for+In-gel+Functional+Assays+and+Fluorescence+Studies+of+Membrane+Protein+Complexes.++6.">High Resolution Clear Native Electrophoresis for In-gel Functional Assays and Fluorescence Studies of Membrane Protein Complexes. 6.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 6, 1215-1225 (2007).</li><li>Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Sch&#747;gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assays+in+high-resolution+clear+native+gels+to+quantify+mitochondrial+complexes+in+human+biopsies+and+cell+lines.">Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines.</a> Electrophoresis. 28, 3811-3820 (2007).</li><li>Castle, J. D., Coligan, J. E., Dunn, B. M., Speicher, D. W., Wingfield, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Organelles+from+Mammalian+Cells.">Purification of Organelles from Mammalian Cells.</a> Current Protocols in Protein Science. 4.2, 4.2.1-4.2.57 (2007).</li></ol>

이 비디오에서는, 우리는 인간의 배아 줄기 세포, 높은 해상도 명확한 기본 겔 전기 영동 (hrCNE)하여 분리하고, 인 겔 촉매 활동 assays에 의해 이후의 분석에서 mitochondrial 단백질 단지의 추출을 설명합니다. hrCNE 파란색 기본 겔 전기 영동의 비교 해상도 mitochondrial 막 단백질 단지를 해결 및 - 겔 활동 assays를위한 우수합니다. 이 기술은 mitochondrial 호흡 단지 IV를 정할뿐만 아니라 hESCs과 그들의 유도체 자손 모두에 어?...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>0.5M EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP120-1</td>
<td>adjust pH to 8.0 with NaOH </td>
</tr>
<tr>
<td>1M NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S3014-500MG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1M Sodium succinate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific </td>
<td>S413-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.1M Sodium phosphate buffer pH 7.2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP332-1 and BP329-1</td>
<td>Mix 68.4 ml of 1M Na2HPO4 and 31.6 ml of 1M NaH2PO4 to prepare 0.1M sodium phosphate buffer with pH 7.2 at 25 C </td>
</tr>
<tr>
<td>1M Tricine, pH 7.0 (adjusted with NaOH)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD</td>
<td>9010</td>
<td>store at 4 C </td>
</tr>
<tr>
<td>1M imidazole/HCl, pH 7.0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>I-2399</td>
<td>store at 4 C</td>
</tr>
<tr>
<td>1M Tris-HCl, pH 7.4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific </td>
<td>BP153-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>20% (wt/vol) dodecyl-b-D-maltoside (DDM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>44205-500MG</td>
<td>Dissolved in water. Store 1 ml aliquots at &#x2013;20 C.</td>
</tr>
<tr>
<td>10% (wt/vol) digitonin (>50% purity, used without recrystallization)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>37008-1G</td>
<td>Dissolved in water. Store 0.1&#x2013;1 ml aliquots at &#x2013;20 C. Should be warmed up to 95 C before use.</td>
</tr>
<tr>
<td>2M 6-aminohexanoic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>07260-100G</td>
<td>store at 4 C</td>
</tr>
<tr>
<td>10x Ponceau S/glycerol stock solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P-3504 and G6279-1L</td>
<td>0.1% Ponceau S, 50% glycerol, (wt/vol) in water.</td>
</tr>
<tr>
<td>10% w/v sodium deoxycholate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka </td>
<td>30970-25G</td>
<td>Dissolved in water. Must be protected from light. Adjust pH to 7.0 with HCl, filter and store at room temperature.</td>
</tr>
<tr>
<td>250 mM phenazine methasulfate (PMS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>TCI America</td>
<td>P0083</td>
<td>Dissolved in DMSO and aliquoted. Store at &#x2013;20 C.</td>
</tr>
<tr>
<td>Nitro-blue tetrazolium (NBT)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amresco </td>
<td>0329-1G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>3,3&#x2019;-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>TCI America </td>
<td>D0078</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pb(NO3)2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific </td>
<td>L62-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MgSO4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific </td>
<td>BP213-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris base </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific </td>
<td>BP152-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>G45-212</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Adenosine 5&#x2019;-triphosphate disodium salt (ATP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td>A2383-5G</td>
<td>Grade I, minimum 99%</td>
</tr>
<tr>
<td>beta-nicotineamide adenine dinucleotide (NADH) reduced form </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td>N-8129</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytochrome c From horse heart</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td>C2506-250MG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sucrose </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific </td>
<td>BP220-212</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100x protease inhibitor cocktail</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td>P8340</td>
<td>Store at &#x2013; 20 C.</td>
</tr>
<tr>
<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>D128-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypan blue Stain 0.4%</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco </td>
<td>15250-061</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10x Trypsin (0.5%)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco </td>
<td>15400-054</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin Inhibitor </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco </td>
<td>17075-029</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

probing for mitochondrial complex activity in human embryonic stem cells

Mitochondria 세포질 세포의 대사 및 항상성에 주요 역할을 organelles, 세포 신호 네트워크의 규제 및 프로그램 세포 사망 있습니다. Mitochondria 생산 ATP는 세포질 산화 환원 상태와 Ca2 + 균형을 조절 지방산을 catabolize, 헴, 세포핵, 스테로이드 호르몬, 아미노산을 합성하고, 단백질의 철 - 유황 클러스터를 조립 도움이됩니다. Mitochondria는 열 생산에 필수적인 역할을했습니다. mitochondrial 게놈의 변이는 인간의 장애 여러 종류의 원인이됩니다. mtDNA 변이의 축적이 노화와 상호 및 암의 개발에 중요한 역할을 가지고 의심됩니다. 모든 세포 유형에서 극히 중요한 역할로 인해, mitochondria의 기능은 또한 줄기 세포에 중요합니다. 주요 진보는 줄기 세포 생존, 증식 및 분화 능력에 대한 우리의 이해에되었습니다. 그러나 줄기 세포의 기능 활동은, 특히 그들의 에너지 상태, 아직 자세히 연구되지 ​​않았습니다. 거의 아무것도 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)와 그들의 차별화된 전구체 자손의 mitochondrial 속성에 대한 알려진되지 않습니다. hESC 기능과 발달 가능성에 mitochondria의 역할을 이해하고 평가하는 한 가지 방법은 직접 mitochondrial 호흡 단지의 활동을 측정하는 것입니다. 여기, 우리는 hESCs의 다섯 호흡기 체인 단지를 분석하는 방법으로 젤 활동 시각화의 고해상도 명확한 기본 겔 전기 영동과 이후에 대해 설명합니다.

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Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

이 비디오에서는, 우리는 인간의 배아 줄기 세포의 mitochondrial 호흡 체인 단지가 겔 활동 assays 사용하여 분석할 수있는 방법을 보여줍니다.

인간 배아 줄기 세포에서 Mitochondrial 복잡한 활동에 대한 탐색

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

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Biology

14.2K 조회수.  University of California, Los Angeles. 이 비디오에서는, 우리는 인간의 배아 줄기 세포의 mitochondrial 호흡 체인 단지가 겔 활동 assays 사용하여 분석할 수있는 방법을 보여줍니다.