هذا البروتوكول مهم لأنه يسمح للمستخدمين بإعداد عينات الميتوكوندريا من الأنسجة المجمدة التي تم جمعها من الدراسات السابقة وأرشيفها. كما يقلل هذا البروتوكول من استخدام الحيوانات الحية لحصاد الأنسجة. تسمح هذه التقنية للمستخدمين باستخدام أنسجة الأرشيف المجمدة سابقا لإعداد عينات الميتوكوندريا المخصبة من خلال استخدام طريقة لطيفة لتمزيق الأنسجة.
هذه الطريقة في التحضير يزيد من غلة إعداد الميتوكوندريا. من خلال قراءة البروتوكول من المستحسن لضمان توافر جميع المكونات والأدوات وخاصة محرك التقطيع مشحونة بالكامل وأيضا ممارسة مع بعض الأنسجة غير المرغوب فيها للتعرف على الخطوات. إثبات الإجراء سيكون إدينا كوسا، باحث مشارك من مختبري.
في البداية، سجل وزن الأنبوب الذي يحتوي على أنسجة القلب. الآن وزن أنبوب فارغ وطرحه من الوزن المسجل سابقا للحصول على وزن صافي من أنسجة القلب. وضع أنسجة القلب المجمدة مباشرة في كوب من محلول الجليد البارد.
يحرك لمدة خمس دقائق. في وقت واحد باستخدام ملاقط تطبيق ضغط طفيف على الأنسجة للخروج من الدم قدر الإمكان. أخرج الأنسجة باستخدام ملقط واعصر القلب بمنشفة ورقية نظيفة لإزالة الدم.
ثم ضع الأنسجة في كوب آخر من محلول البرد الجليدي. بعد تحريك الأنسجة لمدة خمس دقائق، قم بتجفيف الأنسجة برفق على منشفة ورقية وأزل الدهون والدم المتخثر والأوريسيل واللفافة. تجمع الأنسجة البطينية.
لتمزيق عينات الأنسجة، ضع 50 إلى 300 ملليغرام من أنسجة القلب في غرفة تقطيع الأنسجة من جانب الكبش وإغلاق جانب الكبش. ثم أضف حوالي 0.2 إلى 0.8 ملليلتر من عازلة الغسيل إلى جانب الغطاء من الأنبوب. استخدام أداة أنبوب لسقف غرفة التقطيع مع غطاء التقطيع بشكل مريح دون أكثر من تشديد عليه.
ضع غرفة التقطيع في وحدة حامل التقطيع مع جانب الكبش لأسفل لتركيبها. إدراج وإشراك بت من سائق التقطيع مشحونة بالكامل مع غطاء التقطيع ضمان يتم تأمين بت بشكل مريح في مكان ثم تطبيق الضغط وصولا الى سائق التقطيع في غرفة التقطيع حتى مؤشر الضغط على حامل التقطيع تصل إلى إعداد ما يقرب من اثنين. اضغط على المشغل وتشغيل برنامج تشغيل التقطيع لمدة 10 إلى 12 ثانية مع الحفاظ على الإعداد عند اثنين.
مراقبة أنبوب لضمان تمزيق وتمرير كل أو معظم كتلة الأنسجة من خلال قرص التحلل في غرفة التقطيع العلوي وإذا لزم الأمر العودة أنبوب إلى حامل التقطيع لمواصلة تمزيق. بعد تمزيق العينة رفع غرفة التقطيع من وحدة حامل واستخدام أداة أنبوب لإزالة غطاء التقطيع ووضعه على سطح نظيف للاستخدام في وقت لاحق أوصى فقط داخل نفس العينة لتجنب التلوث عبر من عينات الأنسجة الأخرى. نقل أنسجة القلب الممزقة إلى الكأس الثالث مع 40 ملليلتر من العازلة الغسيل مع شريط ضجة وأثار الأنسجة لمدة خمس دقائق بسرعة متوسطة بينما على لوحة اثارة.
تصفية التعليق من خلال شبكة النايلون المبتلة مسبقا monofilament. بعد التخلص من الشعيرات غسل الأنسجة الممزقة على مرشح ثلاث مرات مع 10 ملليلتر من العازلة الغسيل. نقل الأنسجة المغسولة إلى كوب 50 ملليلتر مع 20 ملليلتر من العازلة الغسيل وضعت في حمام الجليد على ضجة المغناطيسي.
إضافة 0.5 ملليلتر من محلول تريبسين في حين اثارة باستمرار لمدة 15 دقيقة. في منتصف الطريق تقريبا من خلال اثارة نقل تعليق الأنسجة في التجانس الزجاج على الزجاج المحمولة فضفاضة التي يمكن أن تعقد 15 ملليلتر من حجم. تجانس التعليق مع أربع إلى خمس ضربات لطيف دون إنتاج زبد.
ثم، ضع المتجانسة في كوب 50 ملليلتر واخلطها على طبق إثارة. بعد ذلك ، أضف 10 ملليلترات من العازلة العزلة التي تحتوي على مثبط التربسين إلى المتجانسة واحتضانها أثناء التحريك بلطف. بعد تصفية التعليق مرة أخرى من خلال مرشح النايلون حفظ مرشح في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر ونقل جزء الجسيمات اليسار على مرشح إلى التجانس الزجاج على الزجاج.
في 15 إلى 20 ملليلتر من العازلة الغسيل وتجانس بلطف مع اليد لمدة 25 إلى 30 ثانية. بعد الجمع بين المتجانسة مع الخيوط وتحقيق التوازن بين الأنابيب، والطرد المركزي ومن ثم استخدام ماصة بلاستيكية إزالة supernatant ترك 0.2 ملليلتر من الجزء العلوي من بيليه رقيق. تصفية supernatant الناتجة في أنبوب مخروطي جديد باستخدام مرشح النايلون لتجنب التلوث والطرد المركزي مرة أخرى.
بعد التخلص من الناسخة العملاقة غسل بيليه مرتين إلى ثلاث مرات عن طريق إضافة العازلة العزل إلى جانب الأنبوب لمنع كسر أو تلويث بيليه. تجاهل طبقة الحافة الخارجية البيضاء المنفوشة في كل مرة. إضافة خمسة ملليلتر من العازلة العزلة إلى كل أنبوب وتفتيت بيليه باستخدام ماصة مع طرف ملليلتر واحد أو ماصة نقل جديدة ثم تمييع التعليق مع 20 ملليلتر من العازلة العزل إضافية والطرد المركزي تعليق في 8, 500 X ز لمدة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية.
بعد التخلص من resuspend supernatant بيليه أولا في خمسة ملليلتر ثم في 15 ملليلتر إضافية من العازلة وإعادة تعليق والطرد المركزي في 8، 500 X غرام لمدة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية. الآن تجاهل supernatant وحفظ بيليه البني التي تحتوي على الميتوكوندريا سليمة غسلها. إعادة إنفاق بيليه الميتوكوندريا المخصب في 250 ميكرولتر من العازلة إعادة تعليق بما في ذلك مثبطات البروتيز.
Aliquot تعليق في حجم 25 ميكرولتر، وتجميد سريع في النيتروجين السائل وتخزينها في ثلاجة عميقة 80 درجة مئوية لعدة سنوات. بعد البروتوكول تم إعداد البروتين المخصب بالميتوكوندريا من قلب النسل المولود لمجموعتين من البذرات. ومارست إحداها أثناء الحمل والأخرى كانت مستقرة.
وكشف تحليل الملف الشخصي للبروتين ETC أن ذرية البذرات التي تمارس قدمت مستويات منخفضة نسبيا في بعض مجمعات ETC. تم حل البروتينات الميتوكوندريا في 3 إلى 8٪ التدرج BN-PAGE والمناعة مع كوكتيلات الأجسام المضادة. كل من الجماعات التي تمارس والمستقرة تظهر supercomplexes متعددة.
وكانت الزيادة البارزة في الاتصال الفائق التي لوحظت في تسعة أشهر في المجموعة التي تمارس مقارنة بالمجموعة المستقرة. تم تحليل البروتينات المخصبة بالميتوكوندريا التي تم الحصول عليها من فئات عمرية مختلفة من 48 ساعة ثلاثة أشهر وستة أشهر وتسعة أشهر لنشاط I-II المعقد باستخدام الفحص الحركي. وأظهرت المجموعة التي تمارس نشاط معقد من الفئة الأولى إلى الثانية مقارنة بنشاط المجموعة المستقرة.
وتظهر جدوى الدراسات الوظيفية على الميتوكوندريا التي تم الحصول عليها من الأنسجة والخلايا المجمدة من قبل محققين آخرين. يمكن تطبيق إعداد الميتوكوندريا التي تم الحصول عليها من الأنسجة المجمدة لمجموعة واسعة من الأنسجة مع الحد الأدنى من الضرر.
