نشكر سايمون البرتي للمساعدة في تطوير هذا البروتوكول. وأيد هذا العمل عن طريق منحة من المعاهد القومية للصحة (GM25874) ، ومعهد هوارد هيوز الطبي Investigatorship (لSL) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم منح التدريب predoctoral (لRH).

<html> الجزء 1 : تحضير هلام <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع علبة صب جل. ويمكن استخدام المعدات القياسية للالكهربائي الحمض النووي الأفقي. لأعداد كبيرة من العينات ، ونحن نستعد سم 20 × 24 سم البلاطة مع ما يصل الى 50 أمشاط جيدا الأربعة. تأكد من لوح لايوجد خدوش ، وهذه يمكن أن تشوه صورة لطخة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ايجاد حل agarose 1.5 ٪ (متوسطة أو عالية القوة هلام ، تكافؤ فرص العمل قليلة) في تاي 1X. ينبغي أن تكون كافية لحجم غمر أسنان المشط تماما -- ستحتاج لتحميل عينة أكبر قدر ممكن لتعظيم الكشف. الميكروويف الخليط حتى يذوب تماما agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة SDS بسرعة إلى 0.1 ٪ من الأسهم 10 ٪. دوامة إلى المزيج. إذا كانت بعض agarose يتصلب خلال هذه الخطوة ، redissolve باستخدام صفيحة ساخنة وتوخي الحذر لتجنب الغليان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل الحل في درج الصب. استخدام المشط لأشعل النار من أي فقاعات ، لأنها يمكن أن تتداخل مع نقل في وقت لاحق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقد وضعت بعد جيل ، وإزالة أمشاط ووضع الجل في خزان هلام. يغرق تماما في الجل 1X TAE تحتوي على 0.1 ٪ SDS. </li></ol> الجزء 2 : تحضير عينات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإنتاجية العالية للتحليل lysates الخميرة ، ونحن نبدأ مع 2 مل الثقافات نمت بين عشية وضحاها مع الانفعالات السريعة في كتل 96 - جيدا. في هذه الحالة ، كل ثقافة هو overexpressing بروتين من الفائدة. عند تحليل البروتينات وفرة منخفضة ، يجب استخدام كميات أكبر ثقافة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي في إطار التعاون الإقليمي 2000 لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا في جهاز الطرد المركزي والمياه مرة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend في حل 1 مل spheroplasting. احتضان لحوالي 30 دقيقة عند 30 درجة مئوية (قد تؤكد كفاءة spheroplasting بواسطة الفحص المجهري). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في إطار التعاون الإقليمي 800 لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend spheroplasts مكعبات في 100 مل تحلل العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية كتلة مع الشريط ودوامة على سرعة عالية لمدة 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الحطام الخلوي في 4000 RCF لمدة 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية طاف إلى حاوية جديدة ، على سبيل المثال ، وكذلك لوحة 96 - PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا رغبت في ذلك ، تحديد تركيز البروتين من lysates. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 4X العازلة العينة إلى عينات لتوليد lysates 1X العازلة التي تحتوي على العينة. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل هلام. إذا رغبت في ذلك ، حفظ نصف حجم العينة وأنها تغلي لSDS - PAGE التحليل. من أجل رصد مدى نقل في وقت لاحق ، وتشمل ما قبل الملطخة SDS - PAGE علامة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام علامة الوزن الجزيئي التي تتكون من البروتينات كبيرة جدا (على سبيل المثال ، والدجاج استخراج الصدرية) لتقدير أحجام المجمعات حلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل في الجهد المنخفض (3 ≤ طول هلام V / سم) حتى تصل إلى الجبهة صبغ ~ 1 سم من نهاية الجل. وسوف يستغرق ذلك عدة ساعات. من المهم أن تظل جل بارد ، وإلا نشر منخفضة الوزن الجزيئي بروتين (على سبيل المثال ، مونومرات) يمكن أن تحد من الكشف عنها. </li></ol> الجزء 3 : نقل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع قطعة من النيتروسليلوز للأبعاد نفس الجل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20 قطعة من قطع GB004 و 8 قطع من الورق النشاف GB002 ، للأبعاد نفس الجل. قطع قطعة إضافية من GB004 لاستخدامه بمثابة الفتيل ؛ جعله حوالي 20 سنتيمترا على نطاق أوسع من هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غمر النيتروسليلوز ، الفتيل ، و 4 قطع من GB002 في TBS 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في وعاء من البلاستيك وتجميع كومة من الأوراق على النحو التالي : 20 قطعة من GB004 الجافة ، ثم 4 قطع من GB002 الجافة ، ثم قطعة واحدة من قبل GB002 الرطب. النيتروسليلوز وضع على رأس هذا المكدس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الجل على الدرج لفترة وجيزة في صب الماء لإزالة الزائدة العازلة على التوالي. ثم ، تبدأ بعناية لشريحة الجل قبالة الدرج إلى المكدس. في حين ينزلق الجل قبالة الدرج ، مع غشاء اخماد TBS حسب الضرورة. المخزن المؤقت إضافية تساعد على منع هذه الفقاعات من أن تصبح محاصرين تحت الجل. ماصة نقل يعمل بشكل جيد لهذا الغرض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أن تم نقله الجل إلى المكدس ، تحقق بدقة عن الفقاعات. إذا أي وجود ، ورفع حافة جل وتطبيق العازلة حتى يمكن عمل فقاعات الخروج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الثلاثة المتبقية قبل المبللة GB002 القطع على قمة هلام. ضمان الاتصال بين جميع طبقات شامل من قبل المتداول ماصة بحزم عبر الجزء العلوي من المكدس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجناح المكدس نقل مع اثنين من الأدراج التي تحتوي على TBS مرتفعة. ثنى الفتيل قبل الرطب عبر مكدس بحيث يتم إما مغمورة نهاية الفتيل في TBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية المكدس نقل تجميعها مع علبة بلاستيكية إضافية تحمل الوزن الزائد (على سبيل المثال ، زجاجة 500 مل من الماء). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للنقل على المضي مدة لا تقل عن ثلاث ساعات ، أو بين عشية وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد نقل ، يمكن معالجتها من خلال الغشاء القياسية الغربية النشاف. </li></ol> Spheroplasting الحل 1.2 D - M السوربيتول 0.5 مم MgCl 2 20 ملي تريس ، ودرجة الحموضة 7.5 50 ملي BME (إضافة جديدة) 0.5 ملغ / مل Zymolyase 100T (إضافة جديدة) coration : تسطير &quot;؛ الاحتياطي تحلل&gt; 100 ملي تريس 7.5 50 ملي كلوريد الصوديوم 10 ملي BME (إضافة جديدة) مثبطات الأنزيم البروتيني (إضافة جديدة) 4X نموذج العازلة 2X TAE 20 ٪ الجلسرين 8 ٪ SDS زرقة البروموفينول إلى تفضيل

<ol>
	<li>Kryndushkin, D. S., Alexandrov, I. M., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+[PSI+]+prion+aggregates+are+formed+by+small+Sup35+polymers+fragmented+by+Hsp104.">Yeast [PSI+] prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hsp104.</a> J. Biol. Chem. 278, 49636-49643 (2003).</li><li>Alexandrov, I. M., Vishnevskaya, A. B., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appearance+and+Propagation+of+Polyglutamine-based+Amyloids+in+Yeast:+TYROSINE+RESIDUES+ENABLE+POLYMER+FRAGMENTATION.">Appearance and Propagation of Polyglutamine-based Amyloids in Yeast: TYROSINE RESIDUES ENABLE POLYMER FRAGMENTATION.</a> J. Biol. Chem. 283, 15185-15192 (2008).</li><li>Allen, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+chaperones+as+modulators+of+prion+life+cycle:+novel+effects+of+Ssa+and+Ssb+on+the+Saccharomyces+cerevisiae+prion+[PSI+].">Hsp70 chaperones as modulators of prion life cycle: novel effects of Ssa and Ssb on the Saccharomyces cerevisiae prion [PSI+].</a> Genetics. 169, 1227-1242 (2005).</li><li>Aron, R., Higurashi, T., Sahi, C., Craig, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=J-protein+co-chaperone+Sis1+required+for+generation+of+[RNQ+]+seeds+necessary+for+prion+propagation..">J-protein co-chaperone Sis1 required for generation of [RNQ+] seeds necessary for prion propagation..</a> The EMBO journal. 26, 3794-3803 (2007).</li><li>Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+amyloid+aggregates+using+agarose+gel+electrophoresis.">Analysis of amyloid aggregates using agarose gel electrophoresis.</a> Methods in Enzymology. 412, 33-48 (2006).</li><li>Borchsenius, A. S., Muller, S., Newnam, G. P., Inge-Vechtomov, S. G., Chernoff, Y. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion+variant+maintained+only+at+high+levels+of+the+Hsp104+disaggregase.">Prion variant maintained only at high levels of the Hsp104 disaggregase.</a> Current Genetics. 49, 21-29 (2006).</li><li>Salnikova, A. B., Kryndushkin, D. S., Smirnov, V. N., Kushnirov, V. V., Ter-Avanesyan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonsense+suppression+in+yeast+cells+overproducing+Sup35+(eRF3)+is+caused+by+its+non-heritable+amyloids.">Nonsense suppression in yeast cells overproducing Sup35 (eRF3) is caused by its non-heritable amyloids.</a> J. Biol. Chem. 280, 8808-8812 (2005).</li><li>Tank, E. M., Harris, D. A., Desai, A. A., True, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion+protein+repeat+expansion+results+in+increased+aggregation+and+reveals+phenotypic+variability.">Prion protein repeat expansion results in increased aggregation and reveals phenotypic variability.</a> Mol. Cell. Biol. 27, 5445-5455 (2007).</li><li>Douglas, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone-dependent+amyloid+assembly+protects+cells+from+prion+toxicity.">Chaperone-dependent amyloid assembly protects cells from prion toxicity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 7206-7211 (2008).</li><li>Nagy, B., Costello, R., Csako, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downward+blotting+of+proteins+in+a+model+based+on+apolipoprotein(a)+phenotyping.">Downward blotting of proteins in a model based on apolipoprotein(a) phenotyping.</a> Analytical Biochemistry. 231, 40-45 (1995).</li></ol>

وكانت أول SDD - AGE بواسطة Kryndushkin آخرون 1 ، لدراسة SDS المقاوم للمجمعات [PSI +] بريون في الخميرة ، ولقد وجدت دراسة على نطاق واسع منذ استخدام كلا بريون وعدم بريون المجاميع 2-9. ومع ذلك ، نقل البروتينات إلى غشاء التالية الكهربائي في هلام agarose إشكالية ، ويمكن أن يؤدي في صورة مشوهة لطخة 5. بالإضافة إلى ذلك ، تقنية المغمورة electroblotting الأكثر استخداما يقدم القيود العملية لحجم الهلام ، وبالتالي عدد العينات التي يمكن معالجتها. وقد تناولنا هذه المشاكل من خلال توظيف نقل الشعرية النزولي 10 ، وهو إجراء بسيط والذي يستخدم كومة من الأوراق الجافة النشاف لنقل البروتينات من الهلام إلى غشاء النيتروسليلوز. نقل الشعرية يمنع تشويه ويسمح معالجة المواد الهلامية كبيرة بسهولة. هناك بضعة أشياء يجب مراعاتها قبل استخدام SDD - AGE. لعينات الخام (على سبيل المثال ، lysates) ، مناعي من بروتينات معينة أمر ضروري. SDD - AGE لا تفسد تماما مجمعات البروتين من الفائدة ، ولذلك فإن بروتين (ق) ليتم الكشف يجب أن تحمل علامة حاتمة خارج المنطقة amyloidogenic. عموما يمكن Lysates يكون مستعدا لأنها ستكون لSDS - PAGE عادية ، مع اثنين من الاختلافات الهامة. أولا ، يجب زيادة العناية التي يجب اتخاذها لمنع تدهور بواسطة التحلل البروتيني. تغيير طبيعة الظروف جزئيا المستخدمة هنا ليست كافية لتعطيل البروتياز ، ويمكن أيضا جعل البروتينات المستهدفة أكثر عرضة للتحلل البروتين. استخدام مثبطات الأنزيم البروتيني كوكتيل في تركيز كامل على الأقل شقين الموصى بها. ثانيا ، ينبغي تجنب التدفئة العينات. إذا كان هو المطلوب لمراقبة جميع مونومر سلبية ، على سبيل المثال للتأكد من أن ارتفاع الوزن الجزيئي الأنواع ليست بسبب التعديلات التساهمية ، والحضانة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة 95 درجة مئوية يمكن استخدامها ، والتي سوف استعادة معظم amyloids موحودي للبروتين.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>zymolyase 100T</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Seikagaku America</td>
<td>120493-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Halt Protease Inhibitor Cocktail</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific </td>
<td>78429</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hybond-C extra nitrocellulose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amersham</td>
<td>RPN303E</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GB004 blotting paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>10427926</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GB002 (3MM Chr) blotting paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>3030-917</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Agarose (UltraPure)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15510-027</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

screening for amyloid aggregation by semi-denaturing detergent-agarose gel electrophoresis

ويرتبط مع العديد من تجميع اميلويد الأمراض misfolding البروتين وراء خصائص البريونات المعدية ، والتي هي conformationally الذاتي قالبي templating البروتينات التي يعتقد أن لها أدوار مفيدة في أقل الكائنات الحية. وقد Amyloids بالغ الصعوبة لدراسة بسبب عدم التجانس والصلابة الهيكلية. ومع ذلك ، فقد تم قرار من البوليمرات اميلويد على أساس حجم واللاانحلال المنظفات ممكن عن طريق تغيير طبيعة شبه منظفات - Agarose الكهربائي جل (SDD - AGE). هذا الأسلوب هو العثور على الاستخدام الواسع النطاق للكشف وتوصيف المتغيرات اميلويد بتكوين جزئي. هنا ، علينا أن نظهر للتكيف من هذه التقنية التي تسهل استخدامه في تطبيقات واسعة النطاق ، مثل شاشات البريونات للرواية والبروتينات amyloidogenic الأخرى. الجديد SDD - AGE يستخدم أسلوب نقل الشعرية لمزيد من الموثوقية وسهولة الاستخدام ، ويسمح استيعاب أي هلام الحجم. وبالتالي ، يمكن معالجة عدد كبير من العينات ، وأعدت من الخلايا البروتينات أو المنقى ، في الوقت نفسه عن وجود SDS - الملتزمون غير قابلة للذوبان البروتينات المفتاحية.

Watch this Scientific Journal Video about Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis at JoVE.com

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

SDD - AGE هو تقنية مفيدة للكشف وتوصيف اميلويد مثل البوليمرات في الخلايا. هنا علينا أن نظهر للتكيف الذي يجعل هذه التقنية قابلة للتطبيقات واسعة النطاق.

الكشف عن تجميع اميلويد بواسطة تغيير طبيعة شبه الكهربائي جل منظفات - Agarose

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are ...

screening-for-amyloid-aggregation-semi-denaturing-detergent-agarose

Research

JoVE Journal

Biology

26.7K Views.  Whitehead Institute for Biomedical Research. SDD - AGE هو تقنية مفيدة للكشف وتوصيف اميلويد مثل البوليمرات في الخلايا. هنا علينا أن نظهر للتكيف الذي يجعل هذه التقنية قابلة للتطبيقات واسعة النطاق.

Video: Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis DGGE

تغيير طبيعة الكهربائي جل التدرج (DGGE)

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their separation in a polyacrylamide gel matrix based on the molecular weight. Fragments between 2 to 500 bases, with length differences as small as a single nucleotide, can be separated using this method1. The migration of the sample is dependent on the chosen acrylamide concentration. A higher percentage of polyacrylamide resolves lower molecular weight fragments. The combination of urea and temperatures of 45-55 &deg;C during the gel run allows for the separation of unstructured DNA or RNA molecules.
In general this method is required to analyze or purify single stranded DNA or RNA fragments, such as synthesized or labeled oligonucleotides or products from enzymatic cleavage reactions.
In this video article we show how to prepare and run the denaturing urea polyacrylamide gels. Technical tips are included, in addition to the original protocol 1,2.

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis Urea PAGE

Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis is used to separate single-stranded DNA or RNA up to a limit of 500 nucleotides. Urea in combination with heat denatures samples and unstructured single strands migrate within the gel matrix according to their molecular weight.

تغيير طبيعة جل بولي أكريلاميد الكهربائي اليوريا (PAGE اليوريا)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other proteins (Sali, Glaeser et al. 2003). Thus, the study of protein-protein interaction networks requires the detailed characterization of MPCs to gain an integrative understanding of protein function and regulation. For identification and analysis, MPCs must be separated under native conditions. In this video, we describe the analysis of MPCs by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). BN-PAGE is a technique that allows separation of MPCs in a native conformation with a higher resolution than offered by gel filtration or sucrose density ultracentrifugation, and is therefore useful to determine MPC size, composition, and relative abundance (Sch&auml;gger and von Jagow 1991); (Sch&auml;gger, Cramer et al. 1994). By this method, proteins are separated according to their hydrodynamic size and shape in a polyacrylamide matrix. Here, we demonstrate the analysis of MPCs of total cellular lysates, pointing out that lysate dialysis is the crucial step to make BN-PAGE applicable to these biological samples. Using a combination of first dimension BN- and second dimension SDS-PAGE, we show that MPCs separated by BN-PAGE can be further subdivided into their individual constituents by SDS-PAGE. Visualization of the MPC components upon gel separation is performed by standard immunoblotting. As an example for MPC analysis by BN-PAGE, we chose the well-characterized eukaryotic 19S, 20S, and 26S proteasomes.

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

In this video, we describe the characterization of multiprotein complexes (MPCs) by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). In a first dimension, dialyzed cellular lysates are separated by BN-PAGE to identify individual MPCs. In a second dimension SDS-PAGE, MPCs of interest are further subdivided to analyze their constituents by immunoblotting.

زرقاء هلام بولي أكريلاميد الأصلية الكهربائي (BN - PAGE) للتحليل من المجمعات Multiprotein Lysates الخليوي

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Pouring and Running a Protein Gel by reusing Commercial Cassettes

The evaluation of proteins using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis is a common technique used by biochemistry and molecular biology researchers1-4. For laboratories that perform daily analyses of proteins, the cost of commercially available polyacrylamide gels (&tilde;$10/gel) can be considerable over time. To mitigate this cost, some researchers prepare their own polyacrylamide gels. Traditional methods of pouring these gels typically utilize specialized equipment and glass gel plates that can be expensive and preclude pouring many gels and storing them for future use. Furthermore, handling of glass plates during cleaning or gel pouring can result in accidental breakage creating a safety hazard, which may preclude their use in undergraduate laboratory classes. Our protocol demonstrates how to pour multiple protein gels simultaneously by recycling Invitrogen Nupage Novex minigel cassettes, and inexpensive materials purchased at a home improvement store. This economical and streamlined method includes a way to store the gels at 4&deg;C for a few weeks. By re-using the plastic gel cassettes from commercially available gels, labs that run frequent protein gels can save significant costs and help the environment. In addition, plastic gel cassettes are extremely resistant to breakage, which makes them ideal for undergraduate laboratory classrooms.

Our protocol demonstrates how to pour multiple protein gels at a time by recycling Invitrogen Nupage Novex minigel cassettes, and inexpensive materials purchased at a home improvement store. This economical and streamlined method includes a way to store the gels at 4&deg;C for a few weeks. By re-using the plastic gel cassettes from commercially available gels, labs that run frequent protein gels can save significant costs and help the environment.

صب وتشغيل جل البروتين عن طريق إعادة استخدام شرائط التجاري

The evaluation of proteins using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis is a common technique used by biochemistry ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from the seaweed genera Gelidium and Gracilaria, and consists of repeated agarobiose (L- and D-galactose) subunits2. During gelation, agarose polymers associate non-covalently and form a network of bundles whose pore sizes determine a gel&#39;s molecular sieving properties. The use of agarose gel electrophoresis revolutionized the separation of DNA. Prior to the adoption of agarose gels, DNA was primarily separated using sucrose density gradient centrifugation, which only provided an approximation of size. To separate DNA using agarose gel electrophoresis, the DNA is loaded into pre-cast wells in the gel and a current applied. The phosphate backbone of the DNA (and RNA) molecule is negatively charged, therefore when placed in an electric field, DNA fragments will migrate to the positively charged anode. Because DNA has a uniform mass/charge ratio, DNA molecules are separated by size within an agarose gel in a pattern such that the distance traveled is inversely proportional to the log of its molecular weight3. The leading model for DNA movement through an agarose gel is &#34;biased reptation&#34;, whereby the leading edge moves forward and pulls the rest of the molecule along4. The rate of migration of a DNA molecule through a gel is determined by the following: 1) size of DNA molecule; 2) agarose concentration; 3) DNA conformation5; 4) voltage applied, 5) presence of ethidium bromide, 6) type of agarose and 7) electrophoresis buffer. After separation, the DNA molecules can be visualized under uv light after staining with an appropriate dye. By following this protocol, students should be able to: 
 
1. Understand the mechanism by which DNA fragments are separated within a gel matrix 
2. Understand how conformation of the DNA molecule will determine its mobility through a gel matrix 
3. Identify an agarose solution of appropriate concentration for their needs 
4. Prepare an agarose gel for electrophoresis of DNA samples 
5. Set up the gel electrophoresis apparatus and power supply 
6. Select an appropriate voltage for the separation of DNA fragments 
7. Understand the mechanism by which ethidium bromide allows for the visualization of DNA bands 
8. Determine the sizes of separated DNA fragments 
&#160;

A basic protocol for the separation of DNA fragments using agarose gel electrophoresis is described.

الاغاروز الكهربائي للهلام لفصل أجزاء الحمض النووي

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

الإنتاجية العالية للكشف عن المغيرون الكيميائية من الجينات المشاركة ما بعد transcriptionally الخاضعة للرقابة

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Mucin Agarose Gel Electrophoresis: Western Blotting for High-molecular-weight Glycoproteins

Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against invading pathogens. The main role of these macromolecules is to facilitate particle trapping and clearance while promoting lubrication of the mucosa. During protein synthesis, mucins undergo intense O-glycosylation and multimerization, which dramatically increase the mass and size of these molecules. These post-translational modifications are critical for the viscoelastic properties of mucus. As a result of the complex biochemical and biophysical nature of these molecules, working with mucins provides many challenges that cannot be overcome by conventional protein analysis methods. For instance, their high-molecular-weight prevents electrophoretic migration via regular polyacrylamide gels and their sticky nature causes adhesion to experimental tubing. However, investigating the role of mucins in health (e.g., maintaining mucosal integrity) and disease (e.g., hyperconcentration, mucostasis, cancer) has recently gained interest and mucins are being investigated as a therapeutic target. A better understanding of the production and function of mucin macromolecules may lead to novel pharmaceutical approaches, e.g., inhibitors of mucin granule exocytosis and/or mucolytic agents. Therefore, consistent and reliable protocols to investigate mucin biology are critical for scientific advancement. Here, we describe conventional methods to separate mucin macromolecules by electrophoresis using an agarose gel, transfer protein into nitrocellulose membrane, and detect signal with mucin-specific antibodies as well as infrared fluorescent gel reader. These techniques are widely applicable to determine mucin quantitation, multimerization and to test the effects of pharmacological compounds on mucins.

Mucins are high-molecular-weight glycoconjugates, with size ranging from 0.2 to 200 megadalton (MDa). As a result of their size, mucins do not penetrate conventional polyacrylamide gels and require larger pores for separation. We provide a detailed protocol for mucin agarose gel electrophoresis to assess relative quantification and study polymer assembly.

الميوسين الاغاروز جل الكهربائي: ويسترن التنشيف للبروتينات سكرية عالية الوزن الجزيئي


Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

أساليب "دراسة التغيرات" في "تجميع البروتين الأصيل" مع التقدم في السن في ايليجانس كاينورهابديتيس

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Confocal Microscopy Reveals Cell Surface Receptor Aggregation Through Image Correlation Spectroscopy

Confocal microscopy provides an accessible methodology to capture sub-cellular interactions critical for the characterization and further development of pre-clinical agents labeled with fluorescent probes. With recent advancements in antibody based cytotoxic drug delivery systems, understanding the alterations induced by these agents within the realm of receptor aggregation and internalization is of critical importance. This protocol leverages the well-established methodology of fluorescent immunocytochemistry and the open source FIJI distribution of ImageJ, with its inbuilt autocorrelation and image mathematical functions, to perform spatial image correlation spectroscopy (ICS). This protocol quantitates the fluorescent intensity of labeled receptors as a function of the beam area of the confocal microscope. This provides a quantitative measure of the state of target molecule aggregation on the cell surface. This methodology is focused on the characterization of static cells with potential to expand into temporal investigations of receptor aggregation. This protocol presents an accessible methodology to provide quantification of clustering events occurring at the cell surface, utilizing well established techniques and non-specialized imaging apparatus.

Antibodies that bind to target receptors on the cell surface can confer conformation and clustering alterations. These dynamic changes have implications for characterizing drug development in target cells. This protocol utilizes confocal microscopy and image correlation spectroscopy through ImageJ/FIJI to quantify the extent of receptor clustering on the cell surface.

[كنفوكل] مجهرية يكشف خلية مستقبلات سطح التجميع عن طريق التحليل الطيفي ارتباط الصورة

Confocal microscopy provides an accessible methodology to capture sub-cellular interactions critical for the characterization and further development of ...

Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Complexes in Cultured Human Cells using Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Immunoblotting

Mitochondrial respiration is performed by oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes within mitochondria. Internal and environmental factors can perturb the assembly and stability of OXPHOS complexes. This protocol describes the analysis of mitochondrial respiratory chain complexes by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) in application to cultured human cells. First, mitochondria are extracted from the cells using digitonin, then using lauryl maltoside, the intact OXPHOS complexes are isolated from the mitochondrial membranes. The OXPHOS complexes are then resolved by gradient gel electrophoresis in the presence of the negatively charged dye, Coomassie blue, which prevents protein aggregation and ensures electrophoretic mobility of protein complexes towards the cathode. Finally, the OXPHOS complexes are detected by standard immunoblotting. Thus, BN-PAGE is a convenient and inexpensive technique that can be used to evaluate the assembly of entire OXPHOS complexes, in contrast to the basic SDS-PAGE allowing the study of only individual OXPHOS complex subunits.

This protocol demonstrates the analysis of mitochondrial respiratory chain complexes by blue native polyacrylamide gel electrophoresis. Here the method applied to cultured human cells is described.

تحليل Mitochondrial مجمعات سلسلة التنفس في "الخلايا البشرية المزروعة" استخدام التفريد جل Polyacrylamide الأصلي الأزرق وإيمونوبلوتينج

Mitochondrial respiration is performed by oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes within mitochondria. Internal and environmental factors can perturb ...