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Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

University of Massachusetts Medical School

&#x591A;&#x5DF4;&#x80FA; (DA) &#x518D;&#x6444;&#x53D6;&#x591A;&#x5DF4;&#x80FA;&#x80FD;&#x9012;&#x8D28;&#x4F5C;&#x7528;&#xFF0C;&#x7EC8;&#x6B62;&#xFF0C;&#x5E76;&#x4ECB;&#x5BFC; DA &#x8F6C;&#x8FD0;&#x86CB;&#x767D; (Dat)&#x3002;&#x6025;&#x6027;&#x86CB;&#x767D;&#x6FC0;&#x9176; C (PKC) &#x6FC0;&#x6D3B;&#x52A0;&#x901F;&#x4E86; DAT &#x5185;&#x5316;&#x7387;&#xFF0C;&#x4ECE;&#x800C;&#x51CF;&#x5C11; DAT &#x8868;&#x9762;&#x8868;&#x8FBE;&#x3002;&#x57FA;&#x5E95; DAT &#x541E;&#x548C; PKC &#x523A;&#x6FC0; DAT &#x529F;&#x80FD;&#x4E0B;&#x8C03;&#x867D;&#x7136; pkc DAT &#x4E0B;&#x8C03;&#x53CD;&#x6620;&#x4E86;&#x519C;&#x7528;&#x8FD0;&#x8F93;&#x8F66;&#x5185;&#x541E;&#x4F5C;&#x7528;&#x673A;&#x5236;&#x6302;&#x94A9;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x63A7;&#x5236;&#x57FA;&#x5E95;&#x5185;&#x541E;&#x4F5C;&#x7528;&#x7387;&#x662F;&#x5426;&#x672A;&#x77E5;&#x4F9D;&#x8D56; 587 596 &#x533A;&#x57DF;&#x5185;&#x7684;&#x6B8B;&#x7559;&#x7269;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x5B9A;&#x4E49;&#x4E86;&#x5173;&#x4E8E;&#x57FA;&#x5E95;&#x548C; PKC &#x523A;&#x6FC0; DAT &#x5185;&#x541E;&#x7684;&#x6B8B;&#x7559;&#x7269;&#x3002;&#x4E19;&#x6C28;&#x9178;&#x4EE3; DAT &#x6B8B;&#x7559; 587-590 1) &#x5E9F;&#x9664; PKC &#x523A;&#x6FC0; DAT &#x5185;&#x541E;&#x4F5C;&#x7528;&#x548C; 2&#xFF09; &#x663E;&#x8457;&#x52A0;&#x901F;&#x57FA;&#x5E95; DAT&#x3001; &#x5185;&#x5316;&#xFF0C;tn &#x91CE;&#x6BD2; DAT PKC &#x6FC0;&#x6D3B;&#x671F;&#x95F4;&#x76F8;&#x5AB2;&#x7F8E;&#x3002;&#x52A0;&#x901F;&#x57FA;&#x5E95; DAT &#x5185;&#x5316;&#x4E13;&#x95E8;&#x4F9D;&#x9760;&#x6B8B;&#x7559; 588-590&#xFF0C;&#x9AD8;&#x4FDD;&#x5B88; SLC6 &#x795E;&#x7ECF;&#x9012;&#x8D28;&#x8F6C;&#x8FD0;&#x4F53;&#x4E4B;&#x95F4;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x7ED3;&#x679C;&#x652F;&#x6301;&#x7684;&#x6A21;&#x578B;&#x5373; 587-590 &#x62C9;&#x4F38;&#x5185;&#x7684;&#x6B8B;&#x7559;&#x7269;&#x53EF;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x57FA;&#x5E95; DAT &#x5185;&#x5316;&#x7387;&#x80FD;&#x70BC;&#x5C31; PKC &#x654F;&#x611F;&#x5236;&#x52A8;&#x673A;&#x5236;&#x7684;&#x8F68;&#x8FF9;&#x3002;

&#x591A;&#x5DF4;&#x80FA;&#x8F6C;&#x8FD0;&#x4F53;&#x541E;&#x51B3;&#x5B9A;&#x56E0;&#x7D20;&#xFF1A; &#x7FA7;&#x57FA;&#x7EC8;&#x7AEF;&#x6B8B;&#x7559;&#x57FA;&#x5E95;&#x548C; PKC &#x6FC0;&#x53D1;&#x5185;&#x5728;&#x5316;&#x7684;&#x5173;&#x952E;&#x3002;

Dopamine (DA) reuptake terminates dopaminergic neurotransmission and is mediated by DA transporters (DATs). Acute protein kinase C (PKC) activation accelerates DAT internalization rates, thereby reducing DAT surface expression. Basal DAT endocytosis and PKC-stimulated DAT functional downregulation rely on residues within the 587-596 region, although whether PKC-induced DAT downregulation reflects transporter endocytosis mechanisms linked to those controlling basal endocytosis rates is unknown. Here, we define residues governing basal and PKC-stimulated DAT endocytosis. Alanine substituting DAT residues 587-590 1) abolished PKC stimulation of DAT endocytosis, and 2) markedly accelerated basal DAT internalization, comparable to that of wildtype DAT during PKC activation. Accelerated basal DAT internalization relied specifically on residues 588-590, which are highly conserved among SLC6 neurotransmitter transporters. Our results support a model whereby residues within the 587-590 stretch may serve as a locus for a PKC-sensitive braking mechanism that tempers basal DAT internalization rates.

Dopamine transporter endocytic determinants: carboxy terminal residues critical for basal and PKC-stimulated internalization.

La dopamine (DA) de la recapture de la neurotransmission dopaminergique et se termine est m&#xE9;di&#xE9;e par les transporteurs DA (DAT). Aigu&#xEB; la prot&#xE9;ine kinase C (PKC) d&#x26;#39;activation acc&#xE9;l&#xE8;re taux d&#x26;#39;internalisation DAT, r&#xE9;duisant ainsi l&#x26;#39;expression de surface DAT. Endocytose DAT basale et stimul&#xE9;e par la PKC r&#xE9;gulation &#xE0; la baisse DAT fonctionnelle compter sur les r&#xE9;sidus dans la r&#xE9;gion 587-596, bien que ce soit PKC induite par la r&#xE9;gulation n&#xE9;gative refl&#xE8;te les m&#xE9;canismes d&#x26;#39;endocytose DAT transporteurs li&#xE9;s &#xE0; ces taux de contr&#xF4;le endocytose basales est inconnue. Ici, nous d&#xE9;finissons les r&#xE9;sidus r&#xE9;gissant basale et stimul&#xE9;e par la PKC endocytose DAT. Alanine substituant les r&#xE9;sidus 587-590 DAT 1) a supprim&#xE9; la stimulation de l&#x26;#39;endocytose PKC DAT, et 2) sensiblement acc&#xE9;l&#xE9;r&#xE9; internalisation DAT basale, comparable &#xE0; celle de type sauvage DAT lors de l&#x26;#39;activation de PKC. Acc&#xE9;l&#xE9;ration de l&#x26;#39;internalisation DAT basale s&#x26;#39;appuie sp&#xE9;cifiquement sur les r&#xE9;sidus 588-590, qui sont hautement conserv&#xE9;es parmi les SLC6 transporteurs de neurotransmetteurs. Nos r&#xE9;sultats appuient un mod&#xE8;le dans lequel les r&#xE9;sidus dans le tron&#xE7;on de 587 &#xE0; 590 peut servir comme un lieu d&#x26;#39;un m&#xE9;canisme PKC-sensibles de freinage qui temp&#xE8;re basales taux d &#x26;#39;internalisation DAT.

D&#xE9;terminants transporteur de la dopamine endocytose: R&#xE9;sidus carboxy-terminal critiques pour l&#x26;#39;internalisation basale et stimul&#xE9;e par la PKC

Dopamin (DA)-Reuptake beendet die dopaminergen Neurotransmission und ist von DA-Transporter (DAT) vermittelt. Akute Proteinkinase C (PKC) Aktivierung beschleunigt DAT Internalisierung Preise, wodurch DAT Oberfl&auml;che Ausdruck. Basale DAT Endozytose und PKC-stimuliert DAT funktionale Heraufregulation Vertrauen auf R&uuml;ckst&auml;nde innerhalb der 587-596-Region, obwohl ob PKC-induzierte DAT Heraufregulation Transporter Endozytose Mechanismen verbunden spiegelt diese steuernde basale Endozytose-Raten ist unbekannt. Hier definieren wir R&uuml;ckst&auml;nde f&uuml;r basale und PKC-stimuliert DAT Endozytose. Alanin ersetzen DAT R&uuml;ckst&auml;nde 587-590 1) abgeschafft PKC Stimulation der DAT Endozytose und 2) deutlich beschleunigten basale DAT Internalisierung, vergleichbar mit der Wildtyp DAT w&auml;hrend der PKC-Aktivierung. Beschleunigte basale DAT Internalisierung st&uuml;tzte sich speziell auf R&uuml;ckst&auml;nde 588-590, die stark unter SLC6 Neurotransmitter-Transporter konserviert werden. Unsere Ergebnisse unterst&uuml;tzen ein Modell, wobei R&uuml;ckst&auml;nde innerhalb der 587-590-Strecke als ein Ort f&uuml;r ein PKC-Sensitive-Bremsen-Mechanismus dienen k&ouml;nnen, die basale DAT Internalisierung Preise m&auml;&szlig;igt.

Dopamin Transporter endocytic Determinanten: Carboxy-terminal-R&uuml;ckst&auml;nde f&uuml;r basale und PKC-stimuliert Internalisierung von entscheidender Bedeutung.

Reuptake della dopamina (DA) termina la neurotrasmissione dopaminergica ed &egrave; mediata da trasportatori DA (dat). Chinasi di proteina acuta attivazione C (PKC) accelera i tassi di interiorizzazione DAT, riducendo in tal modo espressione superficiale DAT. Endocitosi DAT basale e PKC-stimolato DAT funzionale downregulation affidano residui all&#39;interno della regione di 587-596, pur se DAT PKC indotta downregulation riflette meccanismi di endocitosi trasportatore collegati a tali tariffe controllo basale endocitosi &egrave; sconosciuto. Qui, definiamo residui direttivo endocitosi DAT basale e stimolata da PKC. Alanina sostituendo residui DAT 587-590 1) abolita stimolazione PKC di endocitosi DAT e 2) notevolmente accelerato basale DAT interiorizzazione, paragonabile a quella di wildtype DAT durante l&#39;attivazione della PKC. Interiorizzazione di DAT basale accelerato invocata specificamente residui 588-590, che sono altamente conservati tra i trasportatori del neurotrasmettitore SLC6. I nostri risultati supportano un modello per cui residui all&#39;interno del tratto di 587-590 possono servire come un locus per un meccanismo frenante PKC-sensibili che temperamenti basali tassi di interiorizzazione di DAT.

Determinanti endocitico dopamina trasportatore: carbossi terminale residui critici per interiorizzazione basale e stimolata da PKC.

&#x30C9;&#x30FC;&#x30D1;&#x30DF;&#x30F3;&#xFF08;DA&#xFF09;&#x53D6;&#x308A;&#x8FBC;&#x307F;&#x306F;&#x3001;&#x30C9;&#x30FC;&#x30D1;&#x30DF;&#x30F3;&#x4F5C;&#x52D5;&#x6027;&#x795E;&#x7D4C;&#x4F1D;&#x9054;&#x3092;&#x7D42;&#x4E86;&#x3057;&#x3001;DA&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#xFF08;DAT&#x30D5;&#x30A1;&#x30A4;&#x30EB;&#xFF09;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5A92;&#x4ECB;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x3002;&#x6025;&#x6027;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C6;&#x30A4;&#x30F3;&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;C&#xFF08;PKC&#xFF09;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x308A;DAT&#x306E;&#x8868;&#x9762;&#x767A;&#x73FE;&#x3092;&#x6E1B;&#x5C11;&#x3055;&#x305B;&#x308B;&#x3001;DAT&#x306E;&#x5185;&#x5728;&#x5316;&#x306E;&#x901F;&#x5EA6;&#x3092;&#x52A0;&#x901F;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002; PKC&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x8A98;&#x5C0E;&#x3055;&#x308C;&#x308B;DAT&#x306E;&#x30C0;&#x30A6;&#x30F3;&#x30EC;&#x30AE;&#x30E5;&#x30EC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x5236;&#x5FA1;&#x306E;&#x57FA;&#x790E;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x30FC;&#x30B7;&#x30B9;&#x7387;&#x306B;&#x30EA;&#x30F3;&#x30AF;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x306E;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x30FC;&#x30B7;&#x30B9;&#x306E;&#x30E1;&#x30AB;&#x30CB;&#x30BA;&#x30E0;&#x3092;&#x53CD;&#x6620;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x304B;&#x3069;&#x3046;&#x304B;&#x306F;&#x4E0D;&#x660E;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x304C;&#x3001;&#x57FA;&#x5E95;&#x306E;DAT&#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x30FC;&#x30B7;&#x30B9;&#x3068;PKC&#x523A;&#x6FC0;DAT&#x6A5F;&#x80FD;&#x306E;&#x30C0;&#x30A6;&#x30F3;&#x30EC;&#x30AE;&#x30E5;&#x30EC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306F;&#x3001;587&#x304B;&#x3089;596&#x306E;&#x9818;&#x57DF;&#x5185;&#x306E;&#x6B8B;&#x57FA;&#x306B;&#x4F9D;&#x5B58;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x57FA;&#x790E;&#x3068;PKC&#x523A;&#x6FC0;DAT&#x306E;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x30FC;&#x30B7;&#x30B9;&#x3092;&#x652F;&#x914D;&#x3059;&#x308B;&#x6B8B;&#x57FA;&#x3092;&#x5B9A;&#x7FA9;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002; DAT&#x6B8B;&#x57FA;587&#x304B;&#x3089;590&#x306B;1&#x3092;&#x4EE3;&#x5165;&#x3059;&#x308B;&#x30A2;&#x30E9;&#x30CB;&#x30F3;&#xFF09;&#x306F;&#x3001;DAT&#x306E;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x30FC;&#x30B7;&#x30B9;&#x306E;PKC&#x523A;&#x6FC0;&#x3092;&#x5EC3;&#x6B62;&#x3057;&#x3001;2&#xFF09;&#x8457;&#x3057;&#x304F;&#x52A0;&#x901F;&#x3055;&#x308C;&#x3001;&#x57FA;&#x5E95;DAT&#x5185;&#x5728;&#x5316;&#x3001;PKC&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x4E2D;&#x306E;&#x91CE;&#x751F;&#x578B;DAT&#x306B;&#x5339;&#x6575;&#x3059;&#x308B;&#x3002;&#x52A0;&#x901F;&#x57FA;&#x5E95;DAT&#x5185;&#x5728;&#x5316;&#x306F;&#x3001;&#x975E;&#x5E38;&#x306B;SLC6&#x795E;&#x7D4C;&#x4F1D;&#x9054;&#x7269;&#x8CEA;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x306E;&#x9593;&#x3067;&#x4FDD;&#x5B58;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x6B8B;&#x57FA;588&#x304B;&#x3089;590&#x3001;&#x306B;&#x7279;&#x306B;&#x4F9D;&#x5B58;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x3001;587&#x304B;&#x3089;590&#x30B9;&#x30C8;&#x30EC;&#x30C3;&#x30C1;&#x5185;&#x306E;&#x6B8B;&#x57FA;&#x306F;&#x6012;&#x308A;&#x57FA;&#x5E95;DAT&#x5185;&#x5728;&#x5316;&#x7387;&#x304C;&#x305D;&#x306E;PKC-&#x654F;&#x611F;&#x306A;&#x5236;&#x52D5;&#x6A5F;&#x69CB;&#x306E;&#x8ECC;&#x8DE1;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x50CD;&#x304F;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x30E2;&#x30C7;&#x30EB;&#x3092;&#x30B5;&#x30DD;&#x30FC;&#x30C8;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x30C9;&#x30FC;&#x30D1;&#x30DF;&#x30F3;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x30FC;&#x30B7;&#x30B9;&#x306E;&#x6C7A;&#x5B9A;&#x8981;&#x56E0;&#xFF1A;&#x57FA;&#x790E;&#x3068;PKC&#x523A;&#x6FC0;&#x5185;&#x5728;&#x5316;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x30AB;&#x30EB;&#x30DC;&#x30AD;&#x30B7;&#x672B;&#x7AEF;&#x6B8B;&#x57FA;

&#xB3C4;&#xD30C;&#xBBFC; (DA) &#xC7AC;&#xD761;&#xC218; dopaminergic neurotransmission&#xB97C; &#xC885;&#xB8CC; &#xD558; &#xACE0; &#xB2E4; &#xC804;&#xC1A1;&#xAE30; (DATs)&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC911;&#xC7AC;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xAE09;&#xC131; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xD0A4; &#xB2C8; &#xC544; &#xC81C; C (PKC) &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xAC00;&#xC18D; DAT internalization &#xC694;&#xAE08;, DAT &#xD45C;&#xBA74; &#xC2DD; &#xAC10;&#xC18C; &#xD55C;&#xB2E4;. &#xBE44;&#xB85D; &#xADF8; &#xC81C;&#xC5B4; &#xAE30;&#xC800; endocytosis &#xC694;&#xAE08; &#xC54C;&#xB824;&#xC838; PKC &#xC720;&#xB3C4; DAT downregulation &#xC804;&#xC1A1; endocytosis &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998;&#xC5D0; &#xC5F0;&#xACB0; &#xBC18;&#xC601; &#xC5EC;&#xBD80; &#xAE30;&#xC800; DAT endocytosis &#xBC0F; PKC &#xC790;&#xADF9; DAT &#xAE30;&#xB2A5; downregulation 587-596 &#xC9C0;&#xC5ED; &#xB0B4; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C;&#xC5D0; &#xC758;&#xC874;. &#xC5EC;&#xAE30;, &#xAE30;&#xC800; &#xBC0F; PKC &#xC790;&#xADF9; DAT endocytosis &#xD1B5;&#xCE58; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C;&#xC744; &#xC815;&#xC758; &#xD588;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC54C;&#xB77C;&#xB2CC; &#xB300;&#xCCB4; DAT &#xC794;&#xB958;&#xBB3C; 587-590 1) &#xD3D0;&#xC9C0; PKC &#xC790;&#xADF9; DAT endocytosis &#xBC0F; 2) &#xD604;&#xC800; &#xD558; &#xAC8C; &#xAC00;&#xC18D;&#xB41C; &#xAE30;&#xC800; DAT &#xAD6D;&#xC81C;&#xD654;, PKC &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xD558;&#xB294; &#xB3D9;&#xC548; wildtype DAT&#xC758; &#xBE44;&#xAD50;. &#xAC00;&#xC18D;&#xB41C; &#xAE30;&#xC800; DAT &#xAD6D;&#xC81C;&#xD654; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C; 588-590, SLC6 &#xC2E0;&#xACBD; &#xC804;&#xB2EC; &#xBB3C;&#xC9C8; &#xC6B4;&#xBC18; &#xC911; &#xACE0;&#xB3C4;&#xB85C; &#xBCF4;&#xC874; &#xAD6C;&#xCCB4;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC758;&#xC874; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xACB0;&#xACFC; 587-590 &#xC2A4;&#xD2B8;&#xB808;&#xCE58; &#xB0B4; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C; &#xAE30;&#xC800; DAT internalization &#xC694;&#xAE08; tempers PKC &#xBBFC;&#xAC10;&#xD55C; &#xC81C;&#xB3D9; &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xB85C;&#xCEE4; &#xC2A4;&#xB85C; &#xC81C;&#xACF5;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB2E4; &#xADF8;&#xAC83;&#xC5D0; &#xC758;&#xD558;&#xC5EC; &#xBAA8;&#xB378;&#xC744; &#xC9C0;&#xC6D0; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xB3C4;&#xD30C;&#xBBFC; &#xC218;&#xC1A1; endocytic &#xACB0;&#xC815; &#xC694;&#xC778;: carboxy &#xD130;&#xBBF8;&#xB110; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C; &#xAE30;&#xC800; &#xBC0F; PKC &#xC790;&#xADF9; &#xAD6D;&#xC81C;&#xD654;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC911;&#xC694; &#xD55C;.

La dopamina (DA) termina la recaptaci&#xF3;n de la neurotransmisi&#xF3;n dopamin&#xE9;rgica y est&#xE1; mediada por los transportadores de DA (DAT). Quinasa aguda prote&#xED;na C (PKC) acelera la activaci&#xF3;n tasas DAT internalizaci&#xF3;n, reduciendo as&#xED; la expresi&#xF3;n de DAT superficie. Endocitosis DAT basal y estimulada por la PKC regulaci&#xF3;n a la baja DAT funcionales dependen de los residuos dentro de la regi&#xF3;n 587-596, aunque si la PKC inducida por la regulaci&#xF3;n a la baja DAT refleja los mecanismos de endocitosis del transportador vinculados a esos tipos de endocitosis basales controlan es desconocida. En este caso, definimos los residuos que regulan la endocitosis DAT basal y estimulado la PKC. Alanina sustituyendo los residuos 587-590 DAT 1) aboli&#xF3; la estimulaci&#xF3;n de la PKC endocitosis DAT, y 2) notablemente acelerado internalizaci&#xF3;n DAT basal, comparable a la de tipo salvaje DAT durante la activaci&#xF3;n de PKC. Internalizaci&#xF3;n acelerada DAT basal se bas&#xF3; espec&#xED;ficamente en los residuos 588-590, que son altamente conservadas entre SLC6 transportadores de neurotransmisores. Nuestros resultados apoyan un modelo en el que los residuos dentro del tramo 587-590 puede servir como un locus para un mecanismo PKC sensible frenado que atempera basales tasas de internalizaci&#xF3;n DAT.

Determinantes transportador de dopamina endoc&#xED;tica: residuos carboxilo terminal cr&#xED;ticos para la internalizaci&#xF3;n basal y estimulado la PKC-

&#x591A;&#x5DF4;&#x80FA;&#x80FD;&#x7684;&#x4FE1;&#x53F7;&#x4F20;&#x5BFC;&#x548C;&#x53EF;&#x5851;&#x6027;&#x5BF9;&#x8BB8;&#x591A;&#x4E2D;&#x67A2;&#x795E;&#x7ECF;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x529F;&#x80FD;&#x4E0E;&#x75C5;&#x7406;&#xFF0C;&#x5305;&#x62EC;&#x8FD0;&#x52A8;&#x3001; &#x8BA4;&#x77E5;&#x3001; &#x548C;&#x6210;&#x763E;&#x81F3;&#x5173;&#x91CD;&#x8981;&#x3002;&#x82EF;&#x4E19;&#x80FA;&#x548C;&#x53EF;&#x5361;&#x56E0;&#x654F;&#x611F;&#x591A;&#x5DF4;&#x80FA; (DA) &#x8F6C;&#x8FD0;&#x86CB;&#x767D; (DAT) &#x4E25;&#x683C;&#x63A7;&#x5236;&#x80DE;&#x5916; DA &#x6D53;&#x5EA6;&#x548C;&#x534A;&#x8870;&#x671F;&#x3002;DAT &#x529F;&#x80FD;&#x548C;&#x8868;&#x9762;&#x8868;&#x8FBE;&#x4E0D;&#x662F;&#x9759;&#x6001;&#x7684;&#x4F46;&#x52A8;&#x6001;&#x4ECB;&#x5BFC;&#x819C;&#x8D29;&#x5356;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x6700;&#x8FD1;&#x5C55;&#x793A;&#x4E86; DAT C &#x603B;&#x7AD9;&#x5BF9;&#x8FD8;&#x53D6;&#x6D88;&#x57FA;&#x5E95; DAT &#x541E;&#x7684; PKC &#x654F;&#x611F;&#x5316;&#x4FE1;&#x53F7;&#x8FDB;&#x884C;&#x7F16;&#x7801;&#x3002;&#x7136;&#x800C;&#xFF0C;&#x7406;&#x4E8B;&#x4F1A;&#x76D1;&#x7BA1; DAT &#x8D29;&#x8FD0;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#x673A;&#x5668;&#x4E0D;&#x662F;&#x5B9A;&#x4E49;&#x597D;&#x7684;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#x4ECB;&#x7ECD;&#x7684;&#x5DE5;&#x4F5C;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x627E;&#x51FA;&#x7C7B;&#x4F3C;&#x7684; Ras &#x86CB;&#x767D;&#xFF0C;Rin (&#x4E3A;&#x795E;&#x7ECF;&#x5143;&#x7684; Ras &#x6837;&#xFF09; &#xFF08;Rit2&#xFF09;&#xFF0C;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x4E00;&#x79CD;&#x86CB;&#x767D;&#xFF0C;DAT C &#x7EC8;&#x7AEF;&#x541E;&#x4FE1;&#x53F7;&#x8FDB;&#x884C;&#x4EA4;&#x4E92;&#x3002;&#x9175;&#x6BCD;&#x53CC;&#x6742;&#x4EA4;&#x3001; GST &#x62C9;&#x4E0B;&#x548C;&#x97F3;&#x54C1;&#x7814;&#x7A76;&#x5EFA;&#x7ACB; DAT &#x548C; Rin &#x76F4;&#x63A5;&#x8FDB;&#x884C;&#x4EA4;&#x4E92;&#xFF0C;&#x5E76;&#x5171;&#x5B9A;&#x4F4D;&#x7814;&#x7A76;&#x63ED;&#x793A; DAT/Rin &#x534F;&#x4F1A;&#x53D1;&#x751F;&#x4E3B;&#x8981;&#x5728;&#x8102;&#x7B4F;&#x5FAE;&#x533A;&#x3002;Coimmunoprecipitations &#x8868;&#x660E; PKC &#x6D3B;&#x5316;&#x8C03;&#x8282; Rin Rin dat &#x4E2D;&#x6444;&#x52A8;&#x51FD;&#x6570;&#x5173;&#x8054;&#x86CB;&#x767D;&#x7A81;&#x53D8;&#x4F53;&#x4ECB;&#x5BFC; shRNA Rin &#x2477; &#x63ED;&#x793A;&#x4E86; Rin PKC &#x4ECB;&#x5BFC; DAT &#x5185;&#x5316;&#x548C;&#x529F;&#x80FD;&#x6027;&#x4E0B;&#x8C03;&#x81F3;&#x5173;&#x91CD;&#x8981;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x7ED3;&#x679C;&#x5EFA;&#x7ACB; Rin &#x662F; DAT &#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x6240;&#x9700;&#x7684; PKC &#x89C4;&#x8303; DAT &#x8D29;&#x5356;&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x9879;&#x5DE5;&#x4F5C;&#x8868;&#x660E; Rin &#x53C2;&#x52A0;&#x53D7;&#x89C4;&#x7BA1;&#x7684;&#x5185;&#x541E;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;

&#x7B49;&#x79BB;&#x5B50;&#x819C;&#x76F8;&#x5173; GTPase Rin &#x4E0E;&#x591A;&#x5DF4;&#x80FA;&#x8F6C;&#x8FD0;&#x4F53;&#x8FDB;&#x884C;&#x4EA4;&#x4E92;&#xFF0C;&#x5E76;&#x9700;&#x5BF9;&#x86CB;&#x767D;&#x6FC0;&#x9176; C &#x8C03;&#x8282;&#x591A;&#x5DF4;&#x80FA;&#x8F6C;&#x8FD0;&#x4F53;&#x8D29;&#x5356;&#x3002;

Dopaminergic signaling and plasticity are essential to numerous CNS functions and pathologies, including movement, cognition, and addiction. The amphetamine- and cocaine-sensitive dopamine (DA) transporter (DAT) tightly controls extracellular DA concentrations and half-life. DAT function and surface expression are not static but are dynamically modulated by membrane trafficking. We recently demonstrated that the DAT C terminus encodes a PKC-sensitive internalization signal that also suppresses basal DAT endocytosis. However, the cellular machinery governing regulated DAT trafficking is not well defined. In work presented here, we identified the Ras-like GTPase, Rin (for Ras-like in neurons) (Rit2), as a protein that interacts with the DAT C-terminal endocytic signal. Yeast two-hybrid, GST pull down and FRET studies establish that DAT and Rin directly interact, and colocalization studies reveal that DAT/Rin associations occur primarily in lipid raft microdomains. Coimmunoprecipitations demonstrate that PKC activation regulates Rin association with DAT. Perturbation of Rin function with GTPase mutants and shRNA-mediated Rin knockdown reveals that Rin is critical for PKC-mediated DAT internalization and functional downregulation. These results establish that Rin is a DAT-interacting protein that is required for PKC-regulated DAT trafficking. Moreover, this work suggests that Rin participates in regulated endocytosis.

The plasma membrane-associated GTPase Rin interacts with the dopamine transporter and is required for protein kinase C-regulated dopamine transporter trafficking.

Signalisation dopaminergique et la plasticit&#xE9; sont essentielles &#xE0; de nombreuses fonctions du syst&#xE8;me nerveux central et les pathologies, y compris le mouvement, la cognition, et de la toxicomanie. La dopamine amph&#xE9;tamine et de coca&#xEF;ne-sensibles (DA) transporteur (DAT) contr&#xF4;le &#xE9;troitement les concentrations extracellulaires DA et la demi-vie. Fonction de DAT et d&#x26;#39;expression de surface ne sont pas statiques, mais sont dynamiquement modul&#xE9;e par le trafic membranaire. Nous avons r&#xE9;cemment d&#xE9;montr&#xE9; que le terminus DAT C code pour un signal d&#x26;#39;internalisation PKC-sensible qui supprime aussi l&#x26;#39;endocytose DAT basale. Cependant, la machinerie cellulaire qui r&#xE9;git le trafic r&#xE9;glement&#xE9; DAT n&#x26;#39;est pas bien d&#xE9;finie. Dans le travail pr&#xE9;sent&#xE9; ici, nous avons identifi&#xE9; la Ras-GTPase, Rin (pour Ras-like dans les neurones) (Rit2), comme une prot&#xE9;ine qui interagit avec le DAT C-terminale du signal d&#x26;#39;endocytose. Deux hybrides de levure, GST pull vers le bas et &#xE9;tudes FRET &#xE9;tablir que DAT et Rin interagir directement, et les &#xE9;tudes r&#xE9;v&#xE8;lent que de colocalisation DAT / Rin associations se produisent principalement dans des microdomaines radeaux lipidiques. Coimmunoprecipitations d&#xE9;montrer que activation de la PKC r&#xE9;gule Rin association avec DAT. Perturbation de la fonction Rin avec des mutants GTPases et shRNA m&#xE9;diation knockdown Rin r&#xE9;v&#xE8;le que Rin est critique pour l&#x26;#39;internalisation DAT PKC-m&#xE9;diation et de r&#xE9;gulation &#xE0; la baisse fonctionnelle. Ces r&#xE9;sultats &#xE9;tablissent que Rin est une prot&#xE9;ine interagissant avec DAT qui est n&#xE9;cessaire pour la PKC-r&#xE9;glement&#xE9; le trafic DAT. En outre, ce travail sugg&#xE8;re que Rin participe &#xE0; l&#x26;#39;endocytose r&#xE9;glement&#xE9;.

Le plasma associ&#xE9;e &#xE0; la membrane GTPase Rin interagit avec le transporteur de la dopamine et est n&#xE9;cessaire pour la prot&#xE9;ine kinase C-r&#xE9;glement&#xE9; traite Dopamine Transporter

Dopaminergen Signalisierung und Plastizit&auml;t sind wesentlich f&uuml;r zahlreiche CNS-Funktionen und Krankheiten, einschlie&szlig;lich Bewegung, Kognition und sucht. Der Amphetamine und Kokain-Sensitive-Dopamin (DA)-Transporter (DAT) steuert eng extrazellul&auml;ren Konzentrationen in DA und Half-Life. DAT-Funktion und Oberfl&auml;che Ausdruck sind nicht statisch, sondern werden dynamisch durch Membranen moduliert. Wir vor kurzem gezeigt, dass das DAT Carboxyl-Terminus ein PKC-Sensitive Internalisierung Signal codiert, die auch basale DAT Endozytose unterdr&uuml;ckt. Die zellul&auml;re Maschinerie, die EZB geregelten DAT Menschenhandel ist jedoch nicht klar definiert. In der hier vorgestellten Arbeit, wir identifiziert die Ras-&auml;hnlichen GTPase, Rin (f&uuml;r Ras-wie in Neuronen) (Rit2), als ein Protein, das mit dem DAT-C-terminalen endocytic Signal interagiert. Hefe-zwei-Hybrid, GST herunterziehen und FRET Studien nachweisen, dass DAT und Rin direkt interagieren und Kolokalisation Studien zeigen, dass DAT/Rin Verb&auml;nde in erster Linie in Lipid Raft Microdomains auftreten. Coimmunoprecipitations zeigen, dass PKC Aktivierung Rin Verbindung mit DAT. St&ouml;rung von Rin-Funktion mit GTPase Mutanten reguliert und ShRNA-vermittelte Rin Niederschlag zeigt, dass Rin f&uuml;r PKC-vermittelte DAT Internalisierung und funktionale Heraufregulation wichtig ist. Diese Ergebnisse belegen, dass Rin ein DAT-Interaktion-Protein, das ist f&uuml;r DAT PKC geregelten Handels erforderlich ist. Dar&uuml;ber hinaus empfiehlt diese Arbeit Rin an geregelten Endozytose beteiligt ist.

Die Plasmamembran-assoziierten GTPase Rin interagiert mit den Dopamin-Transporter und ist erforderlich f&uuml;r Protein Kinase C geregelten Dopamin-Transporter-Handel.

Segnalazione di dopaminergico e plasticit&agrave; sono essenziali alle numerose funzioni di CNS e patologie, tra cui movimento, cognizione e dipendenza. Il trasportatore della dopamina (DA) anfetamine e cocaina-sensibili (DAT) controlla strettamente Half-Life e concentrazioni extracellulari di DA. Funzione di DAT ed espressione superficiale non sono statici ma dinamicamente sono modulati dal traffico di membrana. Abbiamo recentemente dimostrato che il capolinea DAT C codifica un segnale di interiorizzazione di PKC-sensibili che sopprime anche endocitosi DAT basale. Tuttavia, il macchinario cellulare che regolano il traffico DAT regolamentato non &egrave; ben definito. Nel lavoro qui presentato, abbiamo identificato il simil-Ras GTPasi, Rin (per Ras-come nei neuroni) (Rit2), come una proteina che interagisce con il segnale endocitico DAT C-terminale. Due-ibrido del lievito, GST tirare verso il basso e studi FRET stabiliscono che DAT e Rin interagire direttamente e presenza studi rivelano che le associazioni DAT/Rin si verificano principalmente in microdomains Zattera lipidica. Coimmunoprecipitations dimostrare che attivazione PKC regola Rin associazione con funzione di DAT. perturbazione di Rin con GTPase mutanti e mediata da shRNA Rin atterramento rivela che Rin &egrave; critica per interiorizzazione PKC-mediated DAT e funzionale downregulation. Questi risultati stabiliscono che Rin &egrave; una proteina interagente DAT che &egrave; necessaria per il traffico di DAT PKC-regolato. Inoltre, questo lavoro suggerisce che Rin partecipa endocitosi regolata.

La membrana plasmatica associati GTPase Rin interagisce con il trasportatore della dopamina ed &egrave; necessaria per la proteina chinasi C-regolato dopamina trasportatore traffico.

&#x30C9;&#x30FC;&#x30D1;&#x30DF;&#x30F3;&#x30B7;&#x30B0;&#x30CA;&#x30EB;&#x4F1D;&#x9054;&#x3068;&#x53EF;&#x5851;&#x6027;&#x304C;&#x904B;&#x52D5;&#x3001;&#x8A8D;&#x77E5;&#x3001;&#x305D;&#x3057;&#x3066;&#x4E2D;&#x6BD2;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x591A;&#x6570;&#x306E;&#x4E2D;&#x67A2;&#x795E;&#x7D4C;&#x7CFB;&#x306E;&#x6A5F;&#x80FD;&#x3068;&#x75C5;&#x614B;&#x3078;&#x306E;&#x5FC5;&#x8981;&#x4E0D;&#x53EF;&#x6B20;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3002;&#x30A2;&#x30F3;&#x30D5;&#x30A7;&#x30BF;&#x30DF;&#x30F3;&#x3084;&#x30B3;&#x30AB;&#x30A4;&#x30F3;&#x306B;&#x654F;&#x611F;&#x306A;&#x30C9;&#x30FC;&#x30D1;&#x30DF;&#x30F3;&#xFF08;DA&#xFF09;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#xFF08;DAT&#xFF09;&#x306F;&#x3001;&#x3057;&#x3063;&#x304B;&#x308A;&#x3068;&#x7D30;&#x80DE;&#x5916;DA&#x6FC3;&#x5EA6;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x534A;&#x6E1B;&#x671F;&#x3092;&#x5236;&#x5FA1;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002; DAT&#x6A5F;&#x80FD;&#x3068;&#x8868;&#x9762;&#x767A;&#x73FE;&#x306F;&#x3001;&#x9759;&#x7684;&#x3067;&#x306F;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x304C;&#x3001;&#x819C;&#x8F38;&#x9001;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x52D5;&#x7684;&#x306B;&#x5909;&#x8ABF;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x6700;&#x8FD1;&#x3001;DAT&#x3001;C&#x672B;&#x7AEF;&#x306B;&#x3082;&#x57FA;&#x5E95;DAT&#x306E;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x30FC;&#x30B7;&#x30B9;&#x3092;&#x6291;&#x5236;&#x3057;&#x3001;PKC-&#x30BB;&#x30F3;&#x30B7;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6;&#x30CA;&#x30EA;&#x4FE1;&#x53F7;&#x3092;&#x30A8;&#x30F3;&#x30B3;&#x30FC;&#x30C9;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x5B9F;&#x8A3C;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3057;&#x304B;&#x3057;&#x3001;&#x898F;&#x5236;DAT&#x306E;&#x4EBA;&#x8EAB;&#x58F2;&#x8CB7;&#x3092;&#x652F;&#x914D;&#x3059;&#x308B;&#x7D30;&#x80DE;&#x6A5F;&#x69CB;&#x306F;&#x5341;&#x5206;&#x306B;&#x5B9A;&#x7FA9;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x7D39;&#x4ECB;&#x3059;&#x308B;&#x7814;&#x7A76;&#x3067;&#x306F;&#x3001;DAT&#x3001;C&#x672B;&#x7AEF;&#x306E;&#x200B;&#x200B;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x30FC;&#x30B7;&#x30B9;&#x30B7;&#x30B0;&#x30CA;&#x30EB;&#x3068;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3059;&#x308B;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x3001;RAS-GTP&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306A;&#x3001;&#x51DB;&#xFF08;&#x30CB;&#x30E5;&#x30FC;&#x30ED;&#x30F3;&#x3067;&#x306E;Ras&#x306A;&#x3069;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#xFF09;&#xFF08;Rit2&#xFF09;&#x3092;&#x540C;&#x5B9A;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x9175;&#x6BCD;&#x30C4;&#x30FC;&#x30CF;&#x30A4;&#x30D6;&#x30EA;&#x30C3;&#x30C9;&#x306F;&#x3001;GST&#x306F;&#x3001;&#x30D7;&#x30EB;&#x30C0;&#x30A6;&#x30F3;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x3067;&#x306F;&#x3001;DAT&#x3068;Rin&#x304C;&#x76F4;&#x63A5;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x78BA;&#x7ACB;&#x3059;&#x308B;FRET&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x5C40;&#x5728;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x3067;&#x306F;&#x3001;DAT / RIN&#x5354;&#x4F1A;&#x306F;&#x4E3B;&#x306B;&#x8102;&#x8CEA;&#x30E9;&#x30D5;&#x30C8;&#x306B;&#x767A;&#x751F;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x3057;&#x305F;&#x3002; Coimmunoprecipitations&#x306F;&#x3001;PKC&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x306F;DAT&#x3068;&#x30EA;&#x30F3;&#x306E;&#x95A2;&#x9023;&#x4ED8;&#x3051;&#x3092;&#x8ABF;&#x7BC0;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002; GTP&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x304A;&#x3088;&#x3073;shRNA&#x3092;&#x5A92;&#x4ECB;&#x308A;&#x3093;&#x30CE;&#x30C3;&#x30AF;&#x30C0;&#x30A6;&#x30F3;&#x3068;&#x51DB;&#x95A2;&#x6570;&#x306E;&#x6442;&#x52D5;&#x306F;&#x3001;RIN&#x306F;&#x3001;PKC&#x5A92;&#x4ECB;DAT&#x5185;&#x5728;&#x5316;&#x3068;&#x6A5F;&#x80FD;&#x306E;&#x30C0;&#x30A6;&#x30F3;&#x30EC;&#x30AE;&#x30E5;&#x30EC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x91CD;&#x8981;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x306A;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x3001;Rin&#x306F;PKC&#x8ABF;&#x7BC0;DAT&#x306E;&#x4EBA;&#x8EAB;&#x58F2;&#x8CB7;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x5FC5;&#x8981;&#x3068;&#x3055;&#x308C;&#x308B;DAT&#x3068;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3059;&#x308B;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x898F;&#x5B9A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x307E;&#x305F;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x4F5C;&#x54C1;&#x306F;&#x3001;&#x30EA;&#x30F3;&#x304C;&#x898F;&#x5236;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x30FC;&#x30B7;&#x30B9;&#x306B;&#x95A2;&#x4E0E;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x5506;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;

&#x7D30;&#x80DE;&#x819C;&#x95A2;&#x9023;GTP&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x51DB;&#x306F;&#x3001;&#x30C9;&#x30FC;&#x30D1;&#x30DF;&#x30F3;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x3068;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3057;&#x3001;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C6;&#x30A4;&#x30F3;&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;C&#x8ABF;&#x7BC0;&#x30C9;&#x30FC;&#x30D1;&#x30DF;&#x30F3;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x306E;&#x4EBA;&#x8EAB;&#x58F2;&#x8CB7;&#x304C;&#x5FC5;&#x8981;&#x3067;&#x3059;

Dopaminergic &#xC2E0;&#xD638; &#xBC0F; &#xC18C;&#xC131; &#xC218;&#xB9CE;&#xC740; CNS &#xAE30;&#xB2A5; &#xBC0F; &#xBCD1; &#xB9AC;, &#xC6B4;&#xB3D9;, &#xC778;&#xC9C0;, &#xC911;&#xB3C5; &#xB4F1; &#xD544;&#xC218;&#xC801;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC554;&#xD398;&#xD0C0;&#xBBFC;&#xACFC; &#xCF54;&#xCE74;&#xC778;&#xC5D0; &#xBBFC;&#xAC10;&#xD55C; &#xB3C4;&#xD30C;&#xBBFC; (DA) &#xC804;&#xC1A1; (DAT) &#xC138;&#xD3EC; &#xC678; &#xB2E4; &#xB18D;&#xB3C4; &#xD558;&#xD504; &#xB77C;&#xC774;&#xD504;&#xC5D0; &#xAE34;&#xBC00; &#xD558; &#xAC8C; &#xC81C;&#xC5B4;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. DAT &#xAE30;&#xB2A5; &#xBC0F; &#xD45C;&#xBA74; &#xC2DD; &#xACE0;&#xC815; &#xB418;&#xC9C0; &#xC54A;&#xACE0; &#xB9C9; &#xC778;&#xC2E0; &#xB9E4;&#xB9E4;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xB3D9;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xBCC0;&#xC870; &#xB41C;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xCD5C;&#xADFC; DAT C &#xB9D0;&#xB2E8; &#xAE30;&#xC800; DAT endocytosis &#xD45C;&#xC2DC; &#xD558;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; PKC &#xBBFC;&#xAC10;&#xD55C; &#xAD6D;&#xC81C;&#xD654; &#xC2E0;&#xD638;&#xB97C; &#xC778;&#xCF54;&#xB529;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xC2DC;&#xC5F0;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098;, &#xB808; &#xADE4; &#xB808;&#xC774;&#xD2B8; &#xB41C; DAT &#xBC00;&#xB9E4; &#xD1B5;&#xCE58; &#xC138;&#xD3EC;&#xC9C8; &#xAE30;&#xACC4; &#xC798; &#xC815;&#xC758; &#xB418;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xAE30;&#xC5D0; &#xC81C;&#xC2DC; &#xD558;&#xB294; &#xC791;&#xD488;&#xC5D0;&#xC11C; Ras &#xAC19;&#xC740; GTPase &#xB9B0; &#xC2DD;&#xBCC4; (&#xB300; &#xD55C; &#xC2E0;&#xACBD; &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0; Ras &#xAC19;&#xC740;) (Rit2), DAT C &#xD130;&#xBBF8;&#xB110; endocytic &#xC2E0;&#xD638; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; &#xD558;&#xB294; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC73C;&#xB85C;. &#xD6A8; &#xBAA8; 2 &#xC7A1;&#xC885; &#xD558; &#xACE0; GST &#xD480; &#xB2E4;&#xC6B4; &#xBB34;&#xC11C; &#xC6CC; &#xC5F0;&#xAD6C; &#xC218;&#xB9BD; DAT&#xC640; &#xB9B0; &#xC9C1;&#xC811; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;, colocalization &#xC5F0;&#xAD6C; &#xACF5;&#xAC1C; DAT/&#xB9B0; &#xD611;&#xD68C; &#xC9C0;&#xC9C8; &#xB5CF;&#xBAA9; microdomains&#xC5D0;&#xC11C; &#xC8FC;&#xB85C; &#xBC1C;&#xC0DD; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. Coimmunoprecipitations &#xBCF4;&#xC5EC; PKC &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xC870;&#xC808; GTPase &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774;&#xC640; DAT. &#xB9B0; &#xC12D; &#xB3D9; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC744; &#xAC00;&#xC9C4; &#xB9B0; &#xD611;&#xD68C; &#xB9B0; &#xCD5C;&#xC800;&#xC758; shRNA &#xC911;&#xC7AC; &#xBC1D;&#xD600; &#xB9B0; PKC &#xC911;&#xC7AC; DAT &#xAD6D;&#xC81C;&#xD654; &#xBC0F; downregulation &#xAE30;&#xB2A5;&#xC5D0; &#xC911;&#xC694; &#xD55C;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xACB0;&#xACFC; &#xB9B0; DAT &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; PKC &#xADDC;&#xC81C; DAT &#xC778;&#xC2E0; &#xB9E4;&#xB9E4;&#xC5D0; &#xD544;&#xC694;&#xD55C; &#xC124;&#xC815; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB610;&#xD55C;,&#xC774; &#xC791;&#xD488; &#xB9B0; &#xADDC;&#xC81C; endocytosis&#xC5D0; &#xCC38;&#xC5EC; &#xD558; &#xACE0; &#xB098;&#xC654;&#xB2E4;.

&#xD50C;&#xB77C;&#xC988;&#xB9C8; &#xBA64;&#xBE0C;&#xB808;&#xC778; &#xAD00;&#xB828; GTPase &#xB9B0; &#xB3C4;&#xD30C;&#xBBFC; &#xC804;&#xC1A1;&#xAE30;&#xC640; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; &#xD558; &#xACE0; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xD0A4; &#xB2C8; &#xC544; &#xC81C; C &#xADDC;&#xC81C; &#xB3C4;&#xD30C;&#xBBFC; &#xC804;&#xC1A1; &#xC778;&#xC2E0; &#xB9E4;&#xB9E4;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD544;&#xC694; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Se&#xF1;alizaci&#xF3;n dopamin&#xE9;rgica y la plasticidad son esenciales para las funciones del sistema nervioso central y patolog&#xED;as m&#xFA;ltiples, incluyendo el movimiento, la cognici&#xF3;n y la adicci&#xF3;n. La dopamina de tipo anfetam&#xED;nico y sensibles a la coca&#xED;na (DA) del transportador (DAT) controla estrechamente las concentraciones extracelulares de DA y la vida media. Funci&#xF3;n de DAT y expresi&#xF3;n en la superficie no son est&#xE1;ticos sino que son modulados por el tr&#xE1;fico de forma din&#xE1;mica de la membrana. Recientemente hemos demostrado que el t&#xE9;rmino DAT C codifica una se&#xF1;al de la internalizaci&#xF3;n de PKC-sensible, que tambi&#xE9;n suprime la endocitosis DAT basal. Sin embargo, la maquinaria celular que rige regulado el tr&#xE1;fico de DAT no est&#xE1; bien definida. En el trabajo que aqu&#xED; se presenta, se identific&#xF3; el barrio de Ras-al igual que GTPasa, Rin (de Ras-al igual que en las neuronas) (Rit2), como una prote&#xED;na que interact&#xFA;a con el DAT C-terminal de la se&#xF1;al endoc&#xED;tica. Levadura de dos h&#xED;bridos, GST tirar hacia abajo y FRET estudios establecen que DAT y Rin interactuar directamente, y los estudios revelan que la colocalizaci&#xF3;n DAT / Rin asociaciones se presentan principalmente en microdominios balsa de l&#xED;pidos. Coimmunoprecipitations demuestran que la activaci&#xF3;n de PKC regula Rin asociaci&#xF3;n con DAT. Perturbaci&#xF3;n de la funci&#xF3;n Rin con mutantes GTPasa y shRNA mediada desmontables Rin Rin revela que es fundamental para la internalizaci&#xF3;n DAT mediada por PKC y la regulaci&#xF3;n a la baja funcional. Estos resultados establecen que Rin es una prote&#xED;na DAT-interacci&#xF3;n que se requiere para la PKC-regulado el tr&#xE1;fico DAT. Por otra parte, este trabajo sugiere que participa en la endocitosis Rin regulado.

La membrana plasm&#xE1;tica asociada GTPasa Rin Interact&#xFA;a con el transportador de dopamina y es necesario para la prote&#xED;na quinasa C-regulado el tr&#xE1;fico transportador de dopamina

Zachary Stevens

University of Massachusetts Medical School

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation