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ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells.  While fluorescent 
proteins ...

Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute

Proteine misfolding Form gro&szlig;e makroskopische vorkommen bei vielen neurodegenerativen Erkrankungen anf&auml;llig. Dennoch bleibt die in-situ-Aggregation-Kinetik wegen Unf&auml;higkeit Vorl&auml;ufer Oligomere aus Monomeren Grenzziehung weitgehend unverstanden. Wir entwickelten eine Strategie f&uuml;r die Zuordnung der Lokalisierungs von l&ouml;slichen Oligomere und Monomere direkt in live-Zellen. Sensoren f&uuml;r mutant Chorea Huntington, welche Formen Aggregate in Huntington-Krankheit, wurden durch die Einf&uuml;hrung eines Tetracysteine-Motiv in Chorea Huntington, die von verbindlichen Biarsenical Fluorophore Oligomere, aber nicht Monomere verschlossen wird. Bis zu 70 % der diffus verteilten Chorea Huntington schien Molek&uuml;le als submikroskopische Oligomere im einzelnen Neuroblastoma Zellen auszudr&uuml;cken mutant Chorea Huntington. Wir erwarten die Sensoren um Einblick in die zellul&auml;ren Mechanismen vermittelt durch Oligomere und Monomere und f&uuml;r den Ansatz anpassungsf&auml;hig ganz allgemein in der Studie von Protein-Self-association zu aktivieren.

Konformation-Sensoren, die Monomere Proteine von Oligomeren in unterscheiden Leben Zellen.

Proteine incline al misfolding formare grandi depositi macroscopico in molte malattie neurodegenerative. La cinetica di aggregazione in situ rimane ancora scarsamente comprensibile a causa di un&#39;incapacit&agrave; di demarcare oligomeri precursore da monomeri. Abbiamo sviluppato una strategia per la mappatura la localizzazione di solubile oligomeri e monomeri direttamente in cellule vivono. Sensori per huntingtina mutante, che forma aggregati nella malattia di Huntington, sono stati realizzati con l&#39;introduzione di un motivo di tetracysteine in huntingtina che diventa occluso dall&#39;associazione biarsenical fluorofori in oligomeri, ma non di monomeri. Fino al 70% dell&#39;huntingtina diffusamente distribuito molecole apparvero come oligomeri submicroscopiche in neuroblastoma singolo cellule che esprimono huntingtina mutante. Anticipiamo i sensori per abilitare la visione meccanismi cellulari mediati da oligomeri e monomeri e per l&#39;approccio ad essere adattabile, pi&ugrave; in generale nello studio di moltiplicava proteina.

Sensori di conformazione che contraddistinguono le proteine monomeriche da oligomeri in cellule vivono.

&#x6613;&#x4E8E;&#x6298;&#x53E0;&#x5F62;&#x5F0F;&#x5927;&#x5B8F;&#x89C2;&#x5B58;&#x6B3E;&#x5728;&#x8BB8;&#x591A;&#x795E;&#x7ECF;&#x9000;&#x884C;&#x6027;&#x75BE;&#x75C5;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x3002;&#x5C1A;&#x672A;&#x539F;&#x4F4D;&#x805A;&#x5408;&#x52A8;&#x529B;&#x5B66;&#x7531;&#x4E8E;&#x4E0D;&#x80FD;&#x5C06;&#x5212;&#x5B9A;&#x5355;&#x4F53;&#x524D;&#x4F53;&#x867E;&#x58F3;&#x4ECD;&#x7136;&#x77E5;&#x4E4B;&#x751A;&#x5C11;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x5236;&#x5B9A;&#x4E86;&#x6218;&#x7565;&#x7528;&#x4E8E;&#x6620;&#x5C04;&#x672C;&#x5730;&#x5316;&#x7684;&#x53EF;&#x6EB6;&#x6027;&#x4F4E;&#x805A;&#x7269;&#x548C;&#x5355;&#x4F53;&#x76F4;&#x63A5;&#x5728;&#x6D3B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x3002;&#x4F20;&#x611F;&#x5668;&#x7684;&#x7A81;&#x53D8;&#x4F53; huntingtin&#xFF0C;&#x54EA;&#x4E9B;&#x5F62;&#x5F0F;&#x805A;&#x5408;&#x5728;&#x4EA8;&#x5EF7;&#x987F;&#x6C0F;&#x821E;&#x8E48;&#x75C5;&#xFF0C;&#x8A00;&#x5F15;&#x5165;&#x6210;&#x4E3A;&#x963B;&#x585E;&#x4ECE;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x7684;&#x4F4E;&#x805A;&#x7269;&#xFF0C;&#x4F46;&#x4E0D;&#x662F;&#x5355;&#x4F53; biarsenical &#x8367;&#x5149;&#x7684; huntingtin tetracysteine &#x6BCD;&#x9898;&#x3002;&#x8FBE; 70%&#x7684;&#x6F2B;&#x5206;&#x5E03;&#x5F0F; huntingtin &#x5206;&#x5B50;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x5FAE;&#x89C2;&#x4E16;&#x754C;&#x7684;&#x4F4E;&#x805A;&#x7269;&#x51FA;&#x73B0;&#x5728;&#x4E2A;&#x522B;&#x795E;&#x7ECF;&#x6BCD;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7624;&#x7EC6;&#x80DE;&#x8868;&#x8FBE;&#x7A81;&#x53D8;&#x4F53; huntingtin&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x9884;&#x6599;&#x5230;&#x7684;&#x4F20;&#x611F;&#x5668;&#xFF0C;&#x4F7F;&#x7EC6;&#x80DE;&#x673A;&#x5236;&#x4ECB;&#x5BFC;&#x7684;&#x4F4E;&#x805A;&#x7269;&#x548C;&#x5355;&#x4F53;&#x548C;&#x7684;&#x529E;&#x6CD5;&#x662F;&#x53EF;&#x4EE5;&#x8C03;&#x6574;&#x7684;&#x4E00;&#x822C;&#x60C5;&#x51B5;&#xFF0C;&#x81EA;&#x7F14;&#x5408;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x6DF1;&#x5165;&#x3002;

&#x4E2D;&#x9F50;&#x805A;&#x7269;&#x533A;&#x522B;&#x5F00;&#x6765;&#x5355;&#x4F53;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x7684;&#x6784;&#x8C61;&#x4F20;&#x611F;&#x5668;&#x6D3B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x3002;

Proteins prone to misfolding form large macroscopic deposits in many neurodegenerative diseases. Yet the in situ aggregation kinetics remains poorly understood because of an inability to demarcate precursor oligomers from monomers. We developed a strategy for mapping the localization of soluble oligomers and monomers directly in live cells. Sensors for mutant huntingtin, which forms aggregates in Huntington's disease, were made by introducing a tetracysteine motif into huntingtin that becomes occluded from binding biarsenical fluorophores in oligomers, but not monomers. Up to 70% of the diffusely distributed huntingtin molecules appeared as submicroscopic oligomers in individual neuroblastoma cells expressing mutant huntingtin. We anticipate the sensors to enable insight into cellular mechanisms mediated by oligomers and monomers and for the approach to be adaptable more generally in the study of protein self-association.

Conformation sensors that distinguish monomeric proteins from oligomers in live cells.

Prot&#xE9;ines sujettes &#xE0; repliement former d&#x26;#39;importants d&#xE9;p&#xF4;ts macroscopiques dans de nombreuses maladies neurod&#xE9;g&#xE9;n&#xE9;ratives. Pourtant, la cin&#xE9;tique de l&#x26;#39;agr&#xE9;gation in situ reste mal comprise en raison d&#x26;#39;une incapacit&#xE9; &#xE0; d&#xE9;limiter oligom&#xE8;res pr&#xE9;curseurs &#xE0; partir de monom&#xE8;res. Nous avons d&#xE9;velopp&#xE9; une strat&#xE9;gie pour la cartographie de la localisation des oligom&#xE8;res solubles et monom&#xE8;res directement dans les cellules vivantes. Des capteurs pour la huntingtine mutante, qui forme des agr&#xE9;gats dans la maladie de Huntington, sont faites par l&#x26;#39;introduction d&#x26;#39;un motif dans la huntingtine t&#xE9;tracyst&#xE9;ine qui devient occlus de liaison fluorophores biars&#xE9;nicale dans oligom&#xE8;res, monom&#xE8;res mais pas. Jusqu&#x26;#39;&#xE0; 70% des mol&#xE9;cules distribu&#xE9;es de fa&#xE7;on diffuse la huntingtine est apparu que les oligom&#xE8;res submicroscopiques dans les cellules de neuroblastome individuelles exprimant la huntingtine mutante. Nous pr&#xE9;voyons que les capteurs pour permettre la connaissance des m&#xE9;canismes cellulaires induits par les oligom&#xE8;res et les monom&#xE8;res et de l&#x26;#39;approche pour &#xEA;tre adaptable, plus g&#xE9;n&#xE9;ralement, dans l&#x26;#39;&#xE9;tude des prot&#xE9;ines auto-association.

Capteurs de conformation qui distinguent prot&#xE9;ines monom&#xE9;riques &#xE0; partir d&#x26;#39;oligom&#xE8;res en cellules vivantes

&#x6298;&#x308A;&#x7573;&#x307F;&#x3057;&#x3084;&#x3059;&#x3044;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306F;&#x591A;&#x304F;&#x306E;&#x795E;&#x200B;&#x200B;&#x7D4C;&#x5909;&#x6027;&#x75BE;&#x60A3;&#x3067;&#x5927;&#x898F;&#x6A21;&#x306A;&#x5DE8;&#x8996;&#x7684;&#x306A;&#x5806;&#x7A4D;&#x7269;&#x3092;&#x5F62;&#x6210;&#x3059;&#x308B;&#x3002;&#x307E;&#x3060;&#x73FE;&#x5834;&#x51DD;&#x96C6;&#x52D5;&#x614B;&#x306E;&#x4E0D;&#x5341;&#x5206;&#x306A;&#x306E;&#x3067;&#x3001;&#x524D;&#x99C6;&#x4F53;&#x30E2;&#x30CE;&#x30DE;&#x30FC;&#x304B;&#x3089;&#x30AA;&#x30EA;&#x30B4;&#x30DE;&#x30FC;&#x3092;&#x533A;&#x5225;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x306A;&#x3044;&#x304B;&#x3089;&#x7406;&#x89E3;&#x3057;&#x305F;&#x307E;&#x307E;&#x306B;&#x306A;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x751F;&#x304D;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x7D30;&#x80DE;&#x306B;&#x76F4;&#x63A5;&#x53EF;&#x6EB6;&#x6027;&#x30AA;&#x30EA;&#x30B4;&#x30DE;&#x30FC;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x30E2;&#x30CE;&#x30DE;&#x30FC;&#x306E;&#x5C40;&#x5728;&#x3092;&#x30DE;&#x30C3;&#x30D4;&#x30F3;&#x30B0;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x6226;&#x7565;&#x3092;&#x958B;&#x767A;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30CF;&#x30F3;&#x30C1;&#x30F3;&#x30C8;&#x30F3;&#x75C5;&#x3067;&#x306F;&#x51DD;&#x96C6;&#x4F53;&#x3092;&#x5F62;&#x6210;&#x3057;&#x3001;&#x5909;&#x7570;&#x30CF;&#x30F3;&#x30C1;&#x30F3;&#x30C1;&#x30F3;&#x3001;&#x3001;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x30BB;&#x30F3;&#x30B5;&#x30FC;&#x304C;&#x7D50;&#x5408;biarsenical&#x30AA;&#x30EA;&#x30B4;&#x30DE;&#x30FC;&#x306E;&#x30D5;&#x30EB;&#x30AA;&#x30ED;&#x30D5;&#x30A9;&#x30A2;&#x3067;&#x306F;&#x306A;&#x304F;&#x3001;&#x30E2;&#x30CE;&#x30DE;&#x30FC;&#x304B;&#x3089;&#x9589;&#x585E;&#x3068;&#x306A;&#x308B;&#x30CF;&#x30F3;&#x30C1;&#x30F3;&#x30C1;&#x30F3;&#x306B;&#x30C6;&#x30C8;&#x30E9;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30A4;&#x30F3;&#x30E2;&#x30C1;&#x30FC;&#x30D5;&#x3092;&#x5C0E;&#x5165;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x884C;&#x308F;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30A2;&#x30C3;&#x30D7;&#x304C;&#x5E83;&#x304F;&#x5206;&#x5E03;&#x3057;&#x30C1;&#x30F3;&#x30C1;&#x30F3;&#x5206;&#x5B50;&#x306E;70&#xFF05;&#x306B;&#x5909;&#x7570;&#x30CF;&#x30F3;&#x30C1;&#x30F3;&#x30C1;&#x30F3;&#x3092;&#x767A;&#x73FE;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x500B;&#x3005;&#x306E;&#x795E;&#x7D4C;&#x82BD;&#x7D30;&#x80DE;&#x816B;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x8D85;&#x9855;&#x5FAE;&#x93E1;&#x7684;&#x306A;&#x30AA;&#x30EA;&#x30B4;&#x30DE;&#x30FC;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x767B;&#x5834;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;&#x30BB;&#x30F3;&#x30B5;&#x30FC;&#x306F;&#x3001;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x81EA;&#x5DF1;&#x4F1A;&#x5408;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x3067;&#x306F;&#x3088;&#x308A;&#x4E00;&#x822C;&#x7684;&#x306B;&#x9069;&#x5FDC;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x30AA;&#x30EA;&#x30B4;&#x30DE;&#x30FC;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x30E2;&#x30CE;&#x30DE;&#x30FC;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5A92;&#x4ECB;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x30E1;&#x30AB;&#x30CB;&#x30BA;&#x30E0;&#x306B;&#x3068;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x6D1E;&#x5BDF;&#x529B;&#x3092;&#x6709;&#x52B9;&#x306B;&#x3059;&#x308B;&#x306B;&#x306F;&#x3001;&#x671F;&#x5F85;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x751F;&#x7D30;&#x80DE;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x30AA;&#x30EA;&#x30B4;&#x30DE;&#x30FC;&#x304B;&#x3089;&#x30E2;&#x30CE;&#x30DE;&#x30FC;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x3092;&#x533A;&#x5225;&#x3059;&#x308B;&#x30B3;&#x30F3;&#x30D5;&#x30A9;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x30BB;&#x30F3;&#x30B5;

&#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xB9CE;&#xC740; &#xC2E0;&#xACBD; &#xD1F4;&#xD589; &#xC131; &#xC9C8;&#xD658;&#xC5D0; &#xC591;&#xC2DD; &#xD070; &#xAC70;&#xC2DC;&#xC801;&#xC778; &#xC608;&#xAE08; misfolding &#xD558;&#xB294; &#xACBD;&#xD5A5;&#xC774; &#xC788;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098; &#xD604;&#xC7A5;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC9D1;&#xACC4; &#xC18D;&#xB3C4; &#xB860; &#xC804;&#xC870; &#xC62C;&#xB9AC;&#xACE0; &#xB2E8;&#xC704;&#xCCB4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xAD6C;&#xBD84; &#xD558;&#xB294; &#xBB34; &#xB2A5;&#xB825; &#xB54C;&#xBB38;&#xC5D0; &#xC81C;&#xB300;&#xB85C; &#xC774;&#xD574; &#xB0A8;&#xC544; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC; &#xC131; &#xC62C;&#xB9AC;&#xACE0; &#xC9C0;&#xC5ED;&#xD654;&#xC5D0; &#xB9E4;&#xD551;&#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD55C; &#xC804;&#xB7B5; &#xAC1C;&#xBC1C;&#xACFC;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB2E8;&#xC704;&#xCCB4; &#xC9C1;&#xC811;&#xB294; &#xC140;&#xC744; &#xB77C;&#xC774;&#xBE0C;. &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; huntingtin, Huntington&#xC758; &#xC9C8;&#xBCD1;&#xC5D0; &#xC5B4;&#xB5A4; &#xD615;&#xD0DC;&#xC758; &#xC9D1;&#xACC4;, &#xC13C;&#xC11C;&#xC5D0; &#xC62C;&#xB9AC;&#xACE0;, &#xD558;&#xC9C0;&#xB9CC; &#xD558;&#xC9C0; &#xB2E8;&#xC704;&#xCCB4;&#xC5D0; biarsenical fluorophores &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB0B4;&#xD3EC; &#xB418; &#xACE0; huntingtin tetracysteine &#xBAA8;&#xD2F0;&#xBE0C;&#xB97C; &#xB3C4;&#xC785; &#xD558; &#xC5EC; &#xB9CC;&#xB4E4;&#xC5B4;&#xC84C;&#xB2E4;. &#xBD84;&#xC790; submicroscopic &#xC62C;&#xB9AC;&#xACE0; &#xAC1C;&#xBCC4; &#xC2E0;&#xACBD;&#xC5D0; &#xB4F1;&#xC7A5; &#xD558;&#xB294; &#xBE0C;&#xB7EC;&#xC2DC;&#xAC00; &#xBD84;&#xC0B0;&#xB41C; huntingtin&#xC758; 70%&#xAE4C;&#xC9C0; &#xD45C;&#xD604; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; huntingtin &#xC138;&#xD3EC;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xC911;&#xC7AC; &#xC62C;&#xB9AC;&#xACE0; &#xBC0F; &#xB2E8;&#xC704;&#xCCB4;&#xC640; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; self-association&#xC758; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0; &#xB354; &#xC77C;&#xBC18;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC801;&#xC6A9;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB3C4;&#xB85D; &#xC811;&#xADFC;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC138;&#xD3EC; &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD1B5;&#xCC30;&#xB825; &#xC218; &#xC788;&#xB3C4;&#xB85D; &#xC13C;&#xC11C;&#xB97C; &#xC608;&#xC0C1;.

Monomeric &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC5D0; &#xC62C;&#xB9AC;&#xACE0;&#xC5D0;&#xC11C; &#xAD6C;&#xBCC4; &#xD558;&#xB294; &#xB098; &#xB780; &#xC13C;&#xC11C; &#xB77C;&#xC774;&#xBE0C; &#xC140;.

Las prote&#xED;nas con tendencia a formar grandes dep&#xF3;sitos de mal plegamiento macrosc&#xF3;picas en muchas enfermedades neurodegenerativas. Sin embargo, la cin&#xE9;tica de agregaci&#xF3;n in situ sigue siendo poco conocida debido a su incapacidad para demarcar olig&#xF3;meros precursores a partir de mon&#xF3;meros. Hemos desarrollado una estrategia para el mapeo de la localizaci&#xF3;n de los olig&#xF3;meros y mon&#xF3;meros solubles directamente en las c&#xE9;lulas vivas. Sensores para mutante huntingtina, que forma agregados en la enfermedad de Huntington, se hicieron mediante la introducci&#xF3;n de un motivo tetracysteine &#x200B;&#x200B;en huntingtina que se convierte en ocluida de uni&#xF3;n fluor&#xF3;foros biarsenical en olig&#xF3;meros, pero no mon&#xF3;meros. Hasta el 70% de las mol&#xE9;culas huntingtin difusamente distribuidas apareci&#xF3; como olig&#xF3;meros submicrosc&#xF3;picas en c&#xE9;lulas de neuroblastoma individuales que expresan huntingtina mutante. Anticipamos los sensores para permitir penetraci&#xF3;n en los mecanismos celulares mediadas por olig&#xF3;meros y mon&#xF3;meros y para el enfoque de ser adaptables m&#xE1;s generalmente en el estudio de la prote&#xED;na auto-asociaci&#xF3;n.

Sensores de conformaci&#xF3;n que distinguir las prote&#xED;nas monom&#xE9;ricas de los olig&#xF3;meros en c&#xE9;lulas vivas

&#x4EA8;&#x5EF7;&#x987F;&#x75C5;&#x662F;&#x7531;&#x6269;&#x5927;&#x7684; polyglutamine &#x5E8F;&#x5217;&#x5728; huntingtin&#xFF0C;&#x4FC3;&#x5176;&#x805A;&#x5408;&#x5230;&#x7EC6;&#x80DE;&#x5185;&#x5305;&#x6DB5;&#x4F53; (IBs) &#x5F15;&#x8D77;&#x7684;&#x3002;&#x9884;&#x8BA1;&#x805A;&#x5408;&#x7684;&#x4E2D;&#x95F4;&#x4F53;&#xFF0C;&#x5982;&#x53EF;&#x6EB6;&#x6027;&#x4F4E;&#x805A;&#x7269;&#xFF0C;&#x6709;&#x6BD2;&#x7684;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#xFF0C;&#x4F46;&#x7531;&#x4E8E;&#x7F3A;&#x4E4F;&#x5B9A;&#x91CF;&#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#xFF0C;&#x5728;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4E2D;&#x7684;&#x805A;&#x5408;&#x7684;&#x52A8;&#x529B;&#x5B66;&#x4ECD;&#x7136;&#x77E5;&#x4E4B;&#x751A;&#x5C11;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x53EF;&#x4EE5;&#x7528;&#x6C89;&#x6DC0;&#x901F;&#x5EA6;&#x5206;&#x6790;&#x6765;&#x5B9A;&#x4E49;&#x548C;&#x6BD4;&#x8F83;&#x7684;&#x5F02;&#x8D28;&#x6027;&#x548C;&#x901A;&#x91CF;&#x7684;&#x7EAF;&#x5316; huntingtin &#x4E0E; huntingtin &#x975E;&#x53D8;&#x6027;&#x6761;&#x4EF6;&#x4E0B;&#x7684;&#x54FA;&#x4E73;&#x52A8;&#x7269;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4E2D;&#x8868;&#x8FBE;&#x3002;&#x975E;&#x81F4;&#x75C5;&#x6027; huntingtin &#x4ECD;&#x7136;&#x4F5C;&#x4E3A; hydrodynamically &#x8292;&#x5355;&#x4F53;&#x4F53;&#x5916;&#x548C;&#x5728;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4E2D;&#x3002;&#x7EAF;&#x51C0;&#x7684; polyglutamine &#x6269;&#x5927;&#x81F4;&#x75C5;&#x6027; huntingtin &#x5F62;&#x6210;&#x6F14;&#x53D8;&#x6210;&#x5F02;&#x7C7B;&#x5408;&#x8BA1;&#x4EBA;&#x53E3;&#x968F;&#x65F6;&#x95F4; (100-6,000 S) &#x589E;&#x52A0;&#x5927;&#x5C0F;&#x7684;&#x7EC6;&#x957F;&#x7684;&#x5355;&#x4F53; &#xFF08;2.4 S&#xFF09;&#x3002;&#x4E0D;&#x8FC7;&#xFF0C;&#x5728;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x7A81;&#x53D8;&#x4F53; huntingtin &#x6210;&#x7ACB;&#x4E86;&#x4E09;&#x4E2A;&#x4E3B;&#x8981;&#x7FA4;&#x4F53;&#xFF1A; &#x5355;&#x4F53; (2.3 S)&#xFF0C;&#x9F50;&#x805A;&#x7269; (&#x6A21;&#x5F0F; s(20,w) = 140 S) &#x548C; IBs (&#x6A21;&#x5F0F; s(20,w) = 320,000 S)&#x3002;&#x5F15;&#x4EBA;&#x6CE8;&#x76EE;&#x7684;&#x662F;&#xFF0C;&#x4F4E;&#x805A;&#x7269;&#x6CA1;&#x6709;&#x6539;&#x53D8;&#x5927;&#x5C0F;&#x975E;&#x5747;&#x8D28;&#x6027;&#x6216;&#x5176;&#x5360;&#x603B; huntingtin &#x7684;&#x6BD4;&#x4F8B;&#x5C3D;&#x7BA1;&#x7EE7;&#x7EED;&#x5355;&#x4F53; 3 &#x5929;&#x4EE5;&#x4E0A; IBs&#xFF0C;&#x8FD9;&#x8868;&#x660E;&#x4F4E;&#x805A;&#x7269;&#x901F;&#x7387;&#x9650;&#x5236;&#x5230;&#x8F6C;&#x6362;&#x5230; IB &#x5F62;&#x6210;&#x4E2D;&#x95F4;&#x4F53;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x8FD8;&#x786E;&#x5B9A;&#x5DF2;&#x77E5;&#x8C03;&#x5236; huntingtin &#x6BD2;&#x6027;&#xFF0C;Hsc70&#xFF0C;&#x4F34;&#x4FA3;&#x662F;&#x5982;&#x4F55;&#x5F71;&#x54CD;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4E2D; huntingtin &#x5206;&#x533A;&#x3002;Hsc70 &#x4E0B;&#x8DCC;&#x7684;&#x4F4E;&#x805A;&#x7269; S 140 &#x6C60;&#xFF0C;&#x4F46;&#x589E;&#x52A0;&#x6574;&#x4F53;&#x901A;&#x91CF;&#x7684;&#x5355;&#x4F53;&#x5BF9; IBs&#xFF0C;&#x6697;&#x793A; Hsc70 &#x901A;&#x8FC7;&#x4FC3;&#x8FDB;&#x4F4E;&#x805A;&#x7269;&#x8F6C;&#x5165; IBs &#x964D;&#x4F4E;&#x6BD2;&#x6027;&#x3002;&#x5728;&#x4E00;&#x8D77;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x6570;&#x636E;&#x8868;&#x660E; huntingtin &#x805A;&#x5408;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x4E2D;&#x7B80;&#x5316;&#x7A0B;&#x5E8F;&#xFF0C;&#x5E76;&#x4E14;&#x662F;&#x7B26;&#x5408; 140 &#x9F50; S &#x805A;&#x7269;&#x5BF9;&#x4E0D;&#x8BBA;&#x603B;&#x8D1F;&#x8377;&#x4E0D;&#x6EB6;&#x6027;&#x805A;&#x5408;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#x6BD2;&#x6027;&#x4F5C;&#x7528;&#x4E0D;&#x65AD;&#x6E90;&#x968F;&#x7740;&#x65F6;&#x95F4;&#x7684;&#x63A8;&#x79FB;&#x4FDD;&#x6301;&#x4E0D;&#x53D8;&#x3002;

&#x8DDF;&#x8E2A;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7A81;&#x53D8; huntingtin &#x805A;&#x5408;&#x52A8;&#x529B;&#x5B66;&#x63ED;&#x793A;&#x4E86;&#x4E09;&#x4E2A;&#x4E3B;&#x8981;&#x7684;&#x7FA4;&#x4F53;&#xFF0C;&#x5176;&#x4E2D;&#x5305;&#x62EC;&#x4E00;&#x4E2A;&#x4E0D;&#x53D8;&#x7684;&#x4F4E;&#x805A;&#x7269;&#x6C60;&#x3002;

Huntington disease is caused by expanded polyglutamine sequences in huntingtin, which procures its aggregation into intracellular inclusion bodies (IBs). Aggregate intermediates, such as soluble oligomers, are predicted to be toxic to cells, yet because of a lack of quantitative methods, the kinetics of aggregation in cells remains poorly understood. We used sedimentation velocity analysis to define and compare the heterogeneity and flux of purified huntingtin with huntingtin expressed in mammalian cells under non-denaturing conditions. Non-pathogenic huntingtin remained as hydrodynamically elongated monomers in vitro and in cells. Purified polyglutamine-expanded pathogenic huntingtin formed elongated monomers (2.4 S) that evolved into a heterogeneous aggregate population of increasing size over time (100-6,000 S). However, in cells, mutant huntingtin formed three major populations: monomers (2.3 S), oligomers (mode s(20,w) = 140 S) and IBs (mode s(20,w) = 320,000 S). Strikingly, the oligomers did not change in size heterogeneity or in their proportion of total huntingtin over 3 days despite continued monomer conversion to IBs, suggesting that oligomers are rate-limiting intermediates to IB formation. We also determined how a chaperone known to modulate huntingtin toxicity, Hsc70, influences in-cell huntingtin partitioning. Hsc70 decreased the pool of 140 S oligomers but increased the overall flux of monomers to IBs, suggesting that Hsc70 reduces toxicity by facilitating transfer of oligomers into IBs. Together, our data suggest that huntingtin aggregation is streamlined in cells and is consistent with the 140 S oligomers, which remain invariant over time, as a constant source of toxicity to cells irrespective of total load of insoluble aggregates.

Tracking mutant huntingtin aggregation kinetics in cells reveals three major populations that include an invariant oligomer pool.

La maladie de Huntington est caus&#xE9;e par &#xE9;largis s&#xE9;quences polyglutamine dans la huntingtine, qui procure son agr&#xE9;gation dans les corps d&#x26;#39;inclusion intracellulaires (IBS). Interm&#xE9;diaires d&#x26;#39;agr&#xE9;gation, telles que les oligom&#xE8;res solubles, sont pr&#xE9;vus pour &#xEA;tre toxiques pour les cellules, mais &#xE0; cause d&#x26;#39;un manque de m&#xE9;thodes quantitatives, la cin&#xE9;tique d&#x26;#39;agr&#xE9;gation dans les cellules reste mal comprise. Nous avons utilis&#xE9; l&#x26;#39;analyse la vitesse de s&#xE9;dimentation afin de d&#xE9;finir et de comparer l&#x26;#39;h&#xE9;t&#xE9;rog&#xE9;n&#xE9;it&#xE9; et le flux de la huntingtine purifi&#xE9; avec la huntingtine exprim&#xE9; dans les cellules de mammif&#xE8;res en vertu des conditions non d&#xE9;naturantes. Non-pathog&#xE8;ne huntingtine est rest&#xE9; en tant que monom&#xE8;res hydrodynamique allong&#xE9;es in vitro et dans les cellules. Purifi&#xE9;e huntingtine pathog&#xE8;ne polyglutamine-expanded form&#xE9; monom&#xE8;res allong&#xE9;es (2,4 S) qui ont &#xE9;volu&#xE9; dans une population agr&#xE9;gat h&#xE9;t&#xE9;rog&#xE8;ne de taille croissante au fil du temps (100-6,000 S). Toutefois, dans les cellules, la huntingtine mutante form&#xE9; trois grandes populations: les monom&#xE8;res (2,3 S), les oligom&#xE8;res (mode s (20, w) = 140 S) et IB (mode s (20, w) = 320 000 S). &#xC9;tonnamment, les oligom&#xE8;res n&#x26;#39;a pas chang&#xE9; en h&#xE9;t&#xE9;rog&#xE9;n&#xE9;it&#xE9; de taille ou de leur proportion de la huntingtine total sur 3 jours, malgr&#xE9; la conversion du monom&#xE8;re suite &#xE0; l&#x26;#39;IBS, ce qui sugg&#xE8;re que les oligom&#xE8;res sont des taux de limitation des interm&#xE9;diaires &#xE0; la formation de l&#x26;#39;IB. Nous avons &#xE9;galement d&#xE9;termin&#xE9; la mani&#xE8;re dont un chaperon et connue pour moduler la huntingtine toxicit&#xE9;, Hsc70, influence dans les cellules de partitionnement huntingtine. Hsc70 diminu&#xE9; la piscine de 140 S oligom&#xE8;res, mais a augment&#xE9; le flux global de monom&#xE8;res &#xE0; l&#x26;#39;IBS, ce qui sugg&#xE8;re que Hsc70 r&#xE9;duit la toxicit&#xE9; en facilitant le transfert des oligom&#xE8;res en IB. Ensemble, nos donn&#xE9;es sugg&#xE8;rent que la huntingtine agr&#xE9;gation est simplifi&#xE9; dans les cellules et est compatible avec les oligom&#xE8;res S 140, qui restent invariant dans le temps, comme une source constante de la toxicit&#xE9; pour les cellules, ind&#xE9;pendamment de la charge totale d&#x26;#39;agr&#xE9;gats insolubles.

Suivi huntingtine mutante dans les cellules cin&#xE9;tique d&#x26;#39;agr&#xE9;gation r&#xE9;v&#xE8;le trois principales populations qui comprennent une piscine Oligom&#xE8;re Invariant

Huntington-Krankheit verursacht durch erweiterte bei Polyglutamin-Sequenzen in Chorea Huntington, die seine Zusammenfassung in intrazellul&auml;re Einschlussk&ouml;rperchen (IBs) beschafft. Aggregat Zwischenprodukte, wie l&ouml;sliche Oligomere werden voraussichtlich f&uuml;r Zellen giftig, doch aufgrund eines Mangels an quantitative Methoden, die Kinetik der Aggregation in Zellen bleibt weitgehend unverstanden. Wir verwendeten Ablagerung Geschwindigkeit Analyse definieren und vergleichen Sie die Heterogenit&auml;t und Lichtstrom der gereinigten Chorea Huntington mit Chorea Huntington, ausgedr&uuml;ckt in den S&auml;ugetier-Zellen unter Bedingungen nicht Denaturierung. Nicht pathogen Chorea Huntington blieb als hydrodynamisch l&auml;ngliche Monomere in-vitro- und in den Zellen. Gereinigte bei Polyglutamin-erweitert pathogenen Chorea Huntington gebildet l&auml;ngliche Monomere (2.4 S), die in heterogenen Aggregat Einwohner Vergr&ouml;&szlig;erung im Laufe der Zeit (100-6.000 S) entwickelt. Jedoch in den Zellen, mutant Chorea Huntington bildete drei gro&szlig;e Populationen: Monomere (2.3 S), Oligomere (Modus s(20,w) = 140 S) und IBs (Modus s(20,w) = 320.000 S). Auffallend, die Oligomere hat sich nicht ver&auml;ndert in Gr&ouml;&szlig;e Heterogenit&auml;t oder in ihren Anteil der gesamten Chorea Huntington &uuml;ber 3 Tage trotz anhaltenden Monomer Umstellung auf IBs, was darauf hindeutet, dass Oligomere geschwindigkeitsbestimmende sind Zwischenprodukte IB Bildung. Wir bestimmt auch, wie eine Anstandsdame, die bekannterma&szlig;en Chorea Huntington Toxizit&auml;t, Hsc70, modulieren Einfl&uuml;sse in der Zelle Chorea Huntington zu partitionieren. Hsc70 verringert den Pool von 140 S Oligomeren sondern erh&ouml;ht der gesamte Lichtstrom der Monomere, IBs, was darauf hindeutet, dass Hsc70 Toxizit&auml;t reduziert durch die Erleichterung der &Uuml;bertragung von Oligomeren in IBs. Gemeinsam empfehlen unsere Daten Chorea Huntington Aggregation ist in Zellen gestrafft und steht im Einklang mit den 140 S-Oligomere, die im Laufe der Zeit als eine st&auml;ndige Quelle der Toxizit&auml;t auf Zellen unabh&auml;ngig von Gesamtlast von unl&ouml;slichen Aggregaten invariant bleiben.

Nachverfolgen von mutant Chorea Huntington-Aggregation-Kinetik in Zellen zeigt drei gro&szlig;e Populationen, die einen unver&auml;nderlichen Oligomer-Pool enthalten.

Malattia di Huntington &egrave; causata da sequenze delle poliglutamine espansi in huntingtina, che si procura la sua aggregazione in corpi di inclusione intracellulari (IBs). Aggregazione intermedi, come oligomeri solubili, sono previsti per essere tossici per le cellule, ma a causa di una mancanza di metodi quantitativi, la cinetica di aggregazione di cellule rimane scarsamente comprensibile. Abbiamo utilizzato l&#39;analisi di velocit&agrave; di sedimentazione per definire e confrontare l&#39;eterogeneit&agrave; e il flusso di huntingtina purificata con huntingtina espresso in cellule di mammifero in condizioni di non-denaturante. Non patogeni huntingtina rimase come involucro allungati monomeri in vitro e nelle cellule. Purificato huntingtina patogeno delle poliglutamine espansi formato allungati monomeri (2.4 S) che si &egrave; evoluto in una popolazione eterogenea aggregata di dimensione crescente nel tempo (100-6.000 S). Tuttavia, nelle cellule, huntingtina mutante formata tre principali popolazioni: monomeri (S. 2.3), oligomeri (modalit&agrave; s(20,w) = 140 S) e IBs (modalit&agrave; s(20,w) = 320.000 S). Sorprendentemente, gli oligomeri non cambia nella eterogeneit&agrave; di dimensioni o nella loro proporzione dell&#39;huntingtina totale oltre i 3 giorni nonostante monomero continua conversione a IBs, suggerendo che gli oligomeri sono rate-limiting intermedi alla formazione di IB. Abbiamo anche determinato come un chaperone noto per modulare huntingtina tossicit&agrave;, Hsc70, influenze nella cella huntingtina partizionamento. Hsc70 diminuito il pool di oligomeri S 140 ma aumentato il flusso complessivo di monomeri di IBs, suggerendo che Hsc70 riduce la tossicit&agrave; di facilitare il trasferimento di oligomeri in IBs. Insieme, i nostri dati suggeriscono che la huntingtina aggregazione &egrave; snellito nelle cellule ed &egrave; coerente con i 140 oligomeri di S, che restano invarianti nel tempo, come una costante fonte di tossicit&agrave; alle cellule indipendentemente dal carico totale degli aggregati insolubili.

Cinetica di aggregazione di huntingtina mutante in cellule di rilevamento rivela tre principali popolazioni che includono una piscina oligomero invariante.

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HSC70&#x306F;&#x3001;140 S&#x30AA;&#x30EA;&#x30B4;&#x30DE;&#x30FC;&#x306E;&#x30D7;&#x30FC;&#x30EB;&#x3092;&#x6E1B;&#x5C11;&#x3055;&#x305B;&#x305F;&#x304C;&#x3001;Hsc70&#x306E;&#x304C;IBS&#x306B;&#x30AA;&#x30EA;&#x30B4;&#x30DE;&#x30FC;&#x306E;&#x79FB;&#x8EE2;&#x3092;&#x4FC3;&#x9032;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x3001;&#x6BD2;&#x6027;&#x3092;&#x6E1B;&#x5C11;&#x3055;&#x305B;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x5506;&#x3057;&#x3001;IBS&#x306B;&#x30E2;&#x30CE;&#x30DE;&#x30FC;&#x306E;&#x5168;&#x4F53;&#x7684;&#x306A;&#x30D5;&#x30E9;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x3092;&#x5897;&#x52A0;&#x3055;&#x305B;&#x305F;&#x3002;&#x4E00;&#x7DD2;&#x306B;&#x3001;&#x6211;&#x3005;&#x306E;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x306F;&#x3001;&#x30CF;&#x30F3;&#x30C1;&#x30F3;&#x30C1;&#x30F3;&#x306E;&#x51DD;&#x96C6;&#x304C;&#x7D30;&#x80DE;&#x5185;&#x3067;&#x5408;&#x7406;&#x5316;&#x3055;&#x308C;&#x3001;&#x4E0D;&#x6EB6;&#x6027;&#x51DD;&#x96C6;&#x4F53;&#x306E;&#x7DCF;&#x8CA0;&#x8377;&#x306B;&#x304B;&#x304B;&#x308F;&#x3089;&#x305A;&#x3001;&#x7D30;&#x80DE;&#x3078;&#x306E;&#x6BD2;&#x6027;&#x306E;&#x4E00;&#x5B9A;&#x306E;&#x6E90;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x6642;&#x9593;&#x306E;&#x7D4C;&#x904E;&#x3068;&#x3068;&#x3082;&#x306B;&#x4E0D;&#x5909;&#x306E;&#x307E;&#x307E;&#x3067;140 S&#x30AA;&#x30EA;&#x30B4;&#x30DE;&#x30FC;&#x3068;&#x4E00;&#x81F4;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x5506;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;

&#x7D30;&#x80DE;&#x306B;&#x5909;&#x7570;&#x30CF;&#x30F3;&#x30C1;&#x30F3;&#x30C1;&#x30F3;&#x51DD;&#x96C6;&#x30AB;&#x30A4;&#x30CD;&#x30C6;&#x30A3;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x3092;&#x8FFD;&#x8DE1;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306F;&#x4E0D;&#x5909;&#x30AA;&#x30EA;&#x30B4;&#x30DE;&#x30FC;&#x30D7;&#x30FC;&#x30EB;&#x3092;&#x542B;&#x3080;3&#x3064;&#x306E;&#x4E3B;&#x8981;&#x306A;&#x96C6;&#x56E3;&#x3092;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;

&#xD5CC;&#xD305;&#xD134; &#xBCD1;&#xC740; &#xC138;&#xD3EC;&#xB0B4; &#xD3EC;&#xD568; &#xC2DC;&#xCCB4; (IBs)&#xC5D0; &#xC9D1;&#xACC4; procures huntingtin&#xC5D0; &#xD655;&#xC7A5;&#xB41C; polyglutamine &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xBC1C;&#xC0DD; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC218;&#xC6A9; &#xC131; &#xC62C;&#xB9AC;&#xACE0; &#xAC19;&#xC740; &#xC9D1;&#xACC4; &#xC911;&#xAC04;&#xCCB4; &#xC140;, &#xB3C5;&#xC131;&#xC774; &#xC788;&#xC744; &#xAC83;&#xC73C;&#xB85C; &#xC608;&#xC0C1; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xC544;&#xC9C1; &#xC815;&#xB7C9;&#xC801; &#xBC29;&#xBC95;&#xC758; &#xBD80;&#xC871;&#xC73C;&#xB85C; &#xC778;&#xD574; &#xC140;&#xC5D0;&#xB294; &#xC9D1;&#xACC4;&#xC758; &#xC18D;&#xB3C4; &#xB860; &#xC81C;&#xB300;&#xB85C; &#xC774;&#xD574; &#xB0A8;&#xC544; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC815;&#xC758; &#xD558; &#xACE0;&#xC774; &#xC9C8; &#xBC0F; huntingtin &#xBE44; &#xBCC0;&#xC131; &#xC870;&#xAC74;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD3EC;&#xC720;&#xB958; &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0; &#xC788;&#xB294; &#xD45C;&#xD604;&#xC73C;&#xB85C; &#xC21C;&#xD654; huntingtin&#xC758; &#xBE44;&#xAD50;&#xB97C; &#xCE68; &#xAC15; &#xC18D;&#xB3C4; &#xBD84;&#xC11D;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD588;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xBE44; &#xBCD1;&#xC6D0; &#xC131; huntingtin hydrodynamically &#xAE38;&#xCB49;&#xD55C; &#xB2E8;&#xC704;&#xCCB4; &#xCCB4; &#xC678;&#xB85C; &#xC140;&#xC5D0; &#xB0A8;&#xC544; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC815;&#xD654; polyglutamine &#xD655;&#xC7A5; &#xBCD1;&#xC6D0; &#xC131; huntingtin &#xC2DC;&#xAC04; (100-6000 S)&#xC5D0; &#xB530;&#xB77C; &#xD06C;&#xAE30;&#xB97C; &#xB298;&#xB9AC;&#xBA74;&#xC758; &#xC774;&#xAE30;&#xC885; &#xC9D1;&#xACC4; &#xC778;&#xAD6C;&#xB85C; &#xC9C4;&#xD654; &#xD558;&#xB294; &#xAE38;&#xCB49;&#xD55C; &#xB2E8;&#xC704;&#xCCB4; (2.4 S) &#xD615;&#xC131;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098;, &#xC140;, &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; huntingtin &#xD615;&#xC131; &#xB41C; &#xC138; &#xAC00;&#xC9C0; &#xC8FC;&#xC694; &#xC778;&#xAD6C;: &#xB2E8;&#xC704;&#xCCB4; (S 2.3) &#xC62C;&#xB9AC;&#xACE0; (&#xBAA8;&#xB4DC; s(20,w) = 140 S) &#xBC0F; IBs (&#xBAA8;&#xB4DC; s(20,w) 320,000 S =). &#xAE30; &#xB9C9;&#xD788;&#xAC8C;,&#xB97C; &#xC62C;&#xB9AC;&#xACE0; &#xD06C;&#xAE30; &#xC774;&#xC885; &#xB610;&#xB294; &#xCD1D; huntingtin&#xC758; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xBE44;&#xC728; &#xBCC0;&#xACBD; &#xD558;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC740; IB &#xD615;&#xC131;&#xC5D0; &#xC9C0;&#xC18D;&#xC801;&#xC778;&#xB41C; &#xBAA8;&#xB178; &#xBA38;&#xC5D0;&#xB3C4; &#xBD88;&#xAD6C; &#xD558; &#xACE0; 3 &#xC77C; &#xB3D9;&#xC548; IBs, &#xC62C;&#xB9AC;&#xACE0; &#xC18D;&#xB3C4; &#xC81C;&#xD55C; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xC81C;&#xC548;&#xC73C;&#xB85C; &#xBCC0;&#xD658;&#xD560; &#xC911;&#xAC1C;&#xC790;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xB610;&#xD55C; &#xC5B4;&#xB5BB;&#xAC8C; &#xBCF4;&#xD638;&#xC790; huntingtin &#xB3C5;&#xC131;, Hsc70, &#xBCC0;&#xC870; &#xC54C;&#xB824;&#xC9C4; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xC140;&#xC5D0; huntingtin &#xBD84;&#xD560; &#xACB0;&#xC815;. Hsc70 140 S &#xC62C;&#xB9AC;&#xACE0; &#xD480; &#xAC10;&#xC18C; &#xD558;&#xC9C0;&#xB9CC; IBs, Hsc70 Ibs&#xC5D0; &#xC62C;&#xB9AC;&#xACE0;&#xC758; &#xC804;&#xC1A1;&#xC744; &#xC6A9;&#xC774; &#xD558; &#xAC8C; &#xD558; &#xC5EC; &#xB3C5;&#xC131;&#xC744; &#xAC10;&#xC18C;&#xB97C; &#xC81C;&#xC548; &#xD558;&#xB294; &#xB2E8;&#xC704;&#xCCB4;&#xC758; &#xC804;&#xCCB4; &#xC720;&#xB7C9;&#xC744; &#xC99D;&#xAC00; &#xD588;&#xB2E4;. &#xD568;&#xAED8;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xB370;&#xC774;&#xD130; huntingtin &#xC9D1;&#xACC4; &#xC140;&#xC5D0;&#xC11C; &#xAC04;&#xC18C; &#xD558; &#xACE0; &#xBD88;&#xC6A9; &#xC131; &#xC9D1;&#xACC4;&#xC758; &#xCD1D; &#xBD80;&#xD558;&#xC5D0; &#xAD00;&#xACC4; &#xC5C6;&#xC774; &#xC140;&#xC5D0; &#xB3C5;&#xC131;&#xC758; &#xC9C0;&#xC18D;&#xC801;&#xC778; &#xC18C;&#xC2A4;&#xB85C; &#xC2DC;&#xAC04;&#xC774; &#xC9C0;&#xB0A8;&#xC5D0; &#xACE0;&#xC815; &#xB0A8;&#xC544; 140 S &#xC62C;&#xB9AC;&#xACE0;&#xC640; &#xC77C;&#xCE58; &#xD558;&#xB294; &#xAC83;&#xC774; &#xC88B;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xC140;&#xC758; &#xC9D1;&#xACC4; &#xC18D;&#xB3C4; &#xB860; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; huntingtin &#xCD94;&#xC801; &#xACE0;&#xC815; &#xC62C;&#xB9AC;&#xACE0; &#xD480;&#xC744; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; &#xC138; &#xAC00;&#xC9C0; &#xC8FC;&#xC694; &#xC778;&#xAD6C;&#xB97C; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC900;&#xB2E4;.

La enfermedad de Huntington es causada por la ampliaci&#xF3;n de las secuencias de poliglutamina en la huntingtina, que garantiza su agregaci&#xF3;n en cuerpos de inclusi&#xF3;n intracelulares (SII). Intermedios globales, como olig&#xF3;meros solubles, se prev&#xE9; que sea t&#xF3;xico para las c&#xE9;lulas, sin embargo, debido a la falta de m&#xE9;todos cuantitativos, la cin&#xE9;tica de la agregaci&#xF3;n de las c&#xE9;lulas sigue siendo poco conocida. Se utiliz&#xF3; el an&#xE1;lisis de sedimentaci&#xF3;n velocidad para definir y comparar la heterogeneidad y el flujo de purificada huntingtina con huntingtina expresado en c&#xE9;lulas de mam&#xED;fero bajo condiciones no desnaturalizantes. No pat&#xF3;gena huntingtina se mantuvo como mon&#xF3;meros hidrodin&#xE1;micamente alargados in vitro y en c&#xE9;lulas. Purificada poliglutaminas ampliado huntingtin pat&#xF3;gena form&#xF3; mon&#xF3;meros alargadas (2.4 S) que se desarrollaron en una poblaci&#xF3;n total heterog&#xE9;neo de tama&#xF1;o creciente en el tiempo (100-6,000 S). Sin embargo, en las c&#xE9;lulas, huntingtina mutada se formaron tres poblaciones principales: mon&#xF3;meros (2.3 S), olig&#xF3;meros (modo s (20, W) = 140 S) y IB (modo s (20, W) = 320 000 S). Sorprendentemente, los olig&#xF3;meros no ha cambiado en la heterogeneidad en su tama&#xF1;o o proporci&#xF3;n de la huntingtina total de m&#xE1;s de 3 d&#xED;as a pesar de conversi&#xF3;n de mon&#xF3;mero continua con el SII, lo que sugiere que los olig&#xF3;meros son limitantes de la velocidad a la formaci&#xF3;n de intermediarios del IB. Tambi&#xE9;n se determin&#xF3; como un acompa&#xF1;ante sabe que modulan la huntingtina toxicidad, Hsc70, influye en la divisi&#xF3;n de las c&#xE9;lulas de la huntingtina. Hsc70 disminuci&#xF3;n de la piscina de 140 S olig&#xF3;meros, pero aument&#xF3; el flujo global de mon&#xF3;meros con el SII, lo que sugiere que Hsc70 reduce la toxicidad, facilitando la transferencia de los olig&#xF3;meros en IBS. En conjunto, nuestros datos sugieren que la agregaci&#xF3;n de huntingtina se hace m&#xE1;s eficiente en las c&#xE9;lulas y es consistente con los olig&#xF3;meros 140 S, que se mantienen invariables en el tiempo, como una constante fuente de toxicidad para las c&#xE9;lulas, independientemente de la carga total de agregados insolubles.

Seguimiento de huntingtina mutada cin&#xE9;tica de agregaci&#xF3;n en las c&#xE9;lulas revela tres principales poblaciones que incluyen una piscina Olig&#xF3;mero Invariante

Yasmin M. Ramdzan

Department of Biochemistry and Molecular Biology

Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute

ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

Yasmin M. Ramdzan

.css-o250i3{font-size:18px;font-family:Open Sans,sans-serif;line-height:21.6px;}Department of Biochemistry and Molecular Biology

Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute

ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

Department of Biochemistry and Molecular Biology