Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

University of Maryland 

Preproricin &#x57FA;&#x56E0;&#x7F16;&#x7801;&#x84D6;&#x9EBB;&#x6BD2;&#x7D20;&#xFF0C;&#x6BD2;&#x6027;&#x6781;&#x5F3A;&#xFF0C;&#x7B2C;&#x4E8C;&#x7C7B;&#x6838;&#x7CD6;&#x4F53;&#x5931;&#x6D3B;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x84D6;&#x9EBB;&#x997C; (&#x84D6;&#x9EBB;&#xFF09;&#x3002;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x4E00;&#x4E2A;&#x901A;&#x624D;&#x690D;&#x7269;&#x9632;&#x5FA1;&#x57FA;&#x56E0;&#xFF0C;preproricin &#x9884;&#x8BA1;&#x5C55;&#x51FA;&#x4EBA;&#x53E3;&#x6C34;&#x5E73;&#x53D8;&#x5316;&#x7B26;&#x5408;&#x4E2D;&#x7ACB;&#x5E73;&#x8861;&#x6A21;&#x578B;&#xFF0C;&#x5E76;&#x5305;&#x62EC;&#x51E0;&#x4E2A;&#x529F;&#x80FD;&#x4E0D;&#x540C;&#x7684;&#x7B49;&#x4F4D;&#x57FA;&#x56E0;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7B2C;&#x4E00;&#x6B21;&#x6D4B;&#x8BD5; preproricin &#x57FA;&#x56E0;&#x5BB6;&#x65CF;&#x5E94;&#x8BE5;&#x5305;&#x62EC;&#x516D;&#x81F3;&#x516B;&#x4E2A;&#x6210;&#x5458;&#x901A;&#x8FC7;&#x641C;&#x7D22;&#x516C;&#x5F00;&#x8349;&#x6848;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4;&#x5E8F;&#x5217;&#x7684;&#x94A2;&#x7B4B;&#x674F;&#x548C;&#x5206;&#x6790;&#x5176;&#x7C7B;&#x4F3C;&#x84D6;&#x9EBB;&#x6BD2;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x4F4D;&#x70B9;&#x7684;&#x5047;&#x8BF4;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7136;&#x540E;&#x6D4B;&#x8BD5; preproricin &#x57FA;&#x56E0;&#x7684;&#x4E2D;&#x7ACB;&#x5E73;&#x8861;&#x671F;&#x671B;&#x7684;&#x7279;&#x70B9;&#x5176; 25 &#x5730;&#x7406;&#x4E0A;&#x5206;&#x6563;&#x7684;&#x84D6;&#x9EBB;&#x690D;&#x7269;&#x95F4;&#x7684;&#x7B49;&#x4F4D;&#x57FA;&#x56E0;&#x53D8;&#x5F02;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x786E;&#x8BA4;&#x4E0E; preproricin &#x57FA;&#x56E0; 62.9 96.3%&#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x8EAB;&#x4EFD;&#x548C;&#x5B8C;&#x597D; A &#x94FE;&#x5171;&#x4EAB;&#x7684;&#x516D;&#x4E2A;&#x7C7B;&#x4F3C;&#x84D6;&#x9EBB;&#x6BD2;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x7684;&#x5B58;&#x5728;&#x3002;Preproricin &#x5355;&#x500D;&#x578B;&#x4E4B;&#x95F4;&#x7684; DNA &#x5E8F;&#x5217;&#x53D8;&#x5F02;&#x663E;&#x8457;&#x62D2;&#x7EDD;&#x4E2D;&#x6027;&#x5E73;&#x8861;&#x6A21;&#x578B;&#x8BD5;&#x9A8C;&#x3002;&#x7F6E;&#x6362;&#x7A81;&#x53D8;&#x4FDD;&#x7559; 12 &#x7684;&#x6C28;&#x57FA;&#x9178;&#xFF0C;&#x5DF2;&#x77E5;&#x4F1A;&#x5F71;&#x54CD;&#x672C;&#x673A;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x6BD2;&#x7D20;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x8868;&#x660E;&#x7B49;&#x4F4D;&#x57FA;&#x56E0;&#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x529F;&#x80FD;&#x5DEE;&#x5F02;&#x4E00;&#x76F4;&#x662F;&#x6700;&#x5C0F;&#x7684;&#x50AC;&#x5316;&#x548C;&#x9759;&#x7535;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;&#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x591A;&#x6001;&#x6027;&#x7531;&#x51C0;&#x5316;&#x9009;&#x62E9; (&#x6B27;&#x7C73;&#x8304; &lt; 0.3) &#x5C1A;&#x672A;&#x5305;&#x62EC;&#x8FC7;&#x91CF;&#x7684;&#x7F55;&#x89C1;&#x6C89;&#x9ED8;&#x7A81;&#x53D8;&#x5927;&#x4E8E;&#x7531;&#x4E2D;&#x7ACB;&#x5E73;&#x8861;&#x6A21;&#x578B;&#x9884;&#x6D4B;&#x3002;&#x84D6;&#x9EBB;&#x6BD2;&#x7D20;&#x6C61;&#x67D3;&#x9C81;&#x68D2;&#x68C0;&#x6D4B;&#x65B9;&#x6CD5;&#x7684;&#x53D1;&#x5C55;&#x5FC5;&#x987B;&#x8003;&#x8651;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x5176;&#x4ED6;&#x7C7B;&#x4F3C;&#x84D6;&#x9EBB;&#x6BD2;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x5206;&#x5B50;&#x7684;&#x5B58;&#x5728;&#xFF0C;&#x5E76;&#x5E94;&#x5229;&#x7528;&#x63D0;&#x4F9B;&#x7684;&#x4F17;&#x591A; preproricin &#x57FA;&#x56E0;&#x5355;&#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x591A;&#x6001;&#x6027;&#x7684;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x3002;

&#x4EBA;&#x53E3;&#x6C34;&#x5E73;&#x7684; preproricin &#x57FA;&#x56E0;&#x53D8;&#x5F02;&#x4E0E;&#x4E2D;&#x7ACB;&#x5E73;&#x8861;&#x7684;&#x901A;&#x624D;&#x690D;&#x7269;&#x9632;&#x5FA1;&#x6BD2;&#x7D20;&#x7684;&#x671F;&#x671B;&#x76F8;&#x77DB;&#x76FE;&#x3002;

The preproricin gene encodes ricin, the highly toxic, type II ribosome-inactivating protein of castor bean (Ricinus communis L.). As a generalist plant defense gene, preproricin is expected to exhibit population-level variation consistent with the neutral equilibrium model and to comprise few functionally different alleles. We first test the hypothesis that the preproricin gene family should comprise six to eight members by searching the publicly available draft genome sequence of R. communis and analyzing its ricin-like loci. We then test the neutral equilibrium expectation for the preproricin gene by characterizing its allelic variation among 25 geographically diverse castor bean plants. We confirm the presence of six ricin-like loci that share with the preproricin gene 62.9-96.3% nucleotide identity and intact A-chains. DNA sequence variation among the preproricin haplotypes significantly rejects tests of the neutral equilibrium model. Replacement mutations preserve the 12 amino acids known to affect catalytic and electrostatic interactions of the native protein toxin, which suggests functional divergence among alleles has been minimal. Nucleotide polymorphism is maintained by purifying selection (omega < 0.3) yet includes an excess of rare silent mutations greater than predicted by the neutral equilibrium model. Development of robust detection methods for ricin contamination must account for the presence of these other ricin-like molecules and should leverage the specificity provided by the numerous single nucleotide polymorphisms in the preproricin gene.

Population-level variation of the preproricin gene contradicts expectation of neutral equilibrium for generalist plant defense toxins.

Le g&#xE8;ne codant pour la ricine preproricin, hautement toxique, de type II inactivant les ribosomes en prot&#xE9;ines de graines de ricin (Ricinus communis L.). Comme un g&#xE8;ne de la d&#xE9;fense centrale g&#xE9;n&#xE9;raliste, preproricin On s&#x26;#39;attend &#xE0; ce niveau de la population pr&#xE9;sentent une variation compatible avec le mod&#xE8;le d&#x26;#39;&#xE9;quilibre neutre et comprennent quelques fonctionnellement diff&#xE9;rents all&#xE8;les. Nous avons d&#x26;#39;abord tester l&#x26;#39;hypoth&#xE8;se que la famille des g&#xE8;nes preproricin devrait comporter de six &#xE0; huit membres en cherchant la s&#xE9;quence la disposition du public le projet de g&#xE9;nome de R. communis et l&#x26;#39;analyse de ses ricine comme loci. Nous testons ensuite l&#x26;#39;attente d&#x26;#39;&#xE9;quilibre neutre pour le g&#xE8;ne preproricin en caract&#xE9;risant sa variation all&#xE9;lique au sein de 25 g&#xE9;ographiquement diverses plantes de ricin. Nous confirmons la pr&#xE9;sence de six ricine comme loci qui partagent avec le g&#xE8;ne preproricin d&#x26;#39;identit&#xE9; en nucl&#xE9;otides de 62,9 &#xE0; 96,3% et intact cha&#xEE;nes A-. Variation de la s&#xE9;quence d&#x26;#39;ADN entre les haplotypes preproricin rejette de mani&#xE8;re significative les tests du mod&#xE8;le d&#x26;#39;&#xE9;quilibre neutre. Mutations de remplacement de pr&#xE9;server les 12 acides amin&#xE9;s connus pour affecter les interactions &#xE9;lectrostatiques et catalytiques de la toxine prot&#xE9;ine native, ce qui sugg&#xE8;re une divergence fonctionnelle entre les all&#xE8;les a &#xE9;t&#xE9; minime. Nucleotide Polymorphism est maintenu par une s&#xE9;lection purificatrice (om&#xE9;ga &#x26;lt;0,3) comprend encore un exc&#xE8;s de rares mutations silencieuses plus que pr&#xE9;vu par le mod&#xE8;le d&#x26;#39;&#xE9;quilibre neutre. D&#xE9;veloppement de m&#xE9;thodes de d&#xE9;tection fiables pour la contamination ricine doit tenir compte de la pr&#xE9;sence de ces autres ricine comme mol&#xE9;cules et devrait tirer parti de la sp&#xE9;cificit&#xE9; fournies par les nombreux polymorphismes de nucl&#xE9;otides simples dans le g&#xE8;ne preproricin.

Niveau de la population Variation du g&#xE8;ne Preproricin Contredit Attente d&#x26;#39;&#xE9;quilibre neutre pour les toxines g&#xE9;n&#xE9;ralistes de d&#xE9;fense des plantes

Das Preproricin-Gen codiert Rizin, hochgiftig, Typ II Ribosom-inactivating Proteins des Castor Bean (Ricinus Communis L.). Als Generalist Pflanze Verteidigung gen d&uuml;rfte die Preproricin Bev&ouml;lkerungsebene Variation mit der neutralen Gleichgewichtsmodell auszustellen und paar funktionell unterschiedliche Allele umfassen. Zun&auml;chst testen wir die Hypothese, dass die Preproricin-gen-Familie durch die &ouml;ffentlich zug&auml;nglichen Entwurf-Genom-Sequenz von R. Communis suchen und analysieren seine Loci Rizin-wie sechs bis acht Mitgliedern besteht. Anschlie&szlig;end testen wir die neutrale Gleichgewicht Erwartung f&uuml;r das Preproricin-gen von Charakterisierung seiner allelische Variante unter 25 geographisch verschiedenen Castor Bean-Pflanzen. Wir best&auml;tigen das Vorhandensein von sechs Rizin-wie Loci, die gemeinsam mit den Preproricin gen 62,9-96,3 % Nukleotid Identit&auml;t und intakt A-Ketten. DNA-Sequenz-Variante unter der Preproricin-Haplotypen lehnt deutlich Tests von der neutralen Gleichgewichtsmodell. Ersatz-Mutationen bewahren die 12 Aminos&auml;uren bekannt, katalytische und elektrostatische Wechselwirkungen zwischen der native Protein-Toxin zu beeinflussen, was darauf hindeutet, dass funktionale Unterschiede zwischen den Allelen minimal gewesen ist. Nukleotid Polymorphie wird betreut von reinigende Auswahl (Omega &lt; 0.3) noch umfasst ein &Uuml;berma&szlig; an seltenen stillen Mutationen, die gr&ouml;&szlig;er als durch die neutrale Gleichgewichtsmodell vorhergesagt. Entwicklung von robusten Nachweismethoden f&uuml;r Rizin Verunreinigungen muss ber&uuml;cksichtigen das Vorhandensein dieser anderen Rizin-&auml;hnliche Molek&uuml;le und sollte die Spezifit&auml;t, bereitgestellt durch die zahlreichen Einzel-Nukleotid-Polymorphismen im Preproricin-gen nutzen.

Bev&ouml;lkerungsebene Variation des Preproricin-Gens widerspricht Erwartung neutralen Gleichgewichtszustand f&uuml;r Generalisten Pflanze Verteidigung Toxine.

Il gene preproricin codifica ricina, altamente tossico, tipo II ribosoma-inattivazione di proteine dei semi di ricino (Ricinus communis L.). Come un gene di difesa impianto generalista, preproricin &egrave; previsto per esporre la variazione del livello di popolazione coerente con il modello di equilibrio neutro e comprendono alcuni alleli funzionalmente diversi. Ci prova prima l&#39;ipotesi che la famiglia del gene preproricin dovrebbe constare di sei-otto membri cercando la sequenza del genoma pubblicamente disponibile progetto di r. communis e analizzando la ricina-come loci. Abbiamo quindi testare l&#39;aspettativa di equilibrio neutro per il gene preproricin che caratterizzano la variante allelica tra 25 piante di ricino geograficamente diversificata. Confermiamo la presenza di sei loci ricina-like che condividono con il preproricin gene 62,9-96,3% nucleotide identit&agrave; e intatte A catene. Variazione di sequenza del DNA tra gli aplotipi preproricin significativamente rifiuta test del modello di equilibrio neutro. Mutazioni di sostituzione preservano i 12 aminoacidi noti per influenzare catalitiche ed elettrostatiche interazioni della tossina proteica nativa, che suggerisce funzionale divergenza tra gli alleli &egrave; stata minima. Polimorfismo nucleotide &egrave; mantenuto dalla selezione (omega &lt; 0,3) di purificazione ancora comprende un eccesso di rare mutazioni silenziose maggiore di quanto previsto nel modello di equilibrio neutro. Sviluppo di metodi di rilevamento robusto per contaminazione ricina deve tenere conto per la presenza di queste altre molecole simil-ricina e dovrebbe sfruttare la specificit&agrave; fornita dai numerosi polimorfismi a singolo nucleotide nel gene preproricin.

Variazione del livello di popolazione del gene preproricin contraddice aspettativa di equilibrio neutro per le tossine di difesa impianto generalista.

preproricin&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306F;&#x3001;&#x30EA;&#x30B7;&#x30F3;&#x3001;&#x30C8;&#x30A6;&#x30B4;&#x30DE;&#x306E;&#x975E;&#x5E38;&#x306B;&#x6709;&#x6BD2;&#x3067;&#x3001;II&#x578B;&#x30EA;&#x30DC;&#x30BD;&#x30FC;&#x30E0;&#x4E0D;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#xFF08;&#x30C8;&#x30A6;&#x30B4;&#x30DE;L.&#xFF09;&#x3092;&#x30A8;&#x30F3;&#x30B3;&#x30FC;&#x30C9;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30B8;&#x30A7;&#x30CD;&#x30E9;&#x30EA;&#x30B9;&#x30C8;&#x306E;&#x690D;&#x7269;&#x9632;&#x5FA1;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x3001;preproricin&#x306F;&#x3001;&#x4E2D;&#x6027;&#x5747;&#x8861;&#x30E2;&#x30C7;&#x30EB;&#x3068;&#x6574;&#x5408;&#x6027;&#x96C6;&#x56E3;&#x30EC;&#x30D9;&#x30EB;&#x306E;&#x5909;&#x52D5;&#x3092;&#x793A;&#x3059;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x3001;&#x3044;&#x304F;&#x3064;&#x304B;&#x306E;&#x6A5F;&#x80FD;&#x7684;&#x306B;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x5BFE;&#x7ACB;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x671F;&#x5F85;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x6700;&#x521D;&#x306E;preproricin&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x30D5;&#x30A1;&#x30DF;&#x30EA;&#x30FC;&#x306F;&#x3001;R.&#x30B3;&#x30E0;&#x30CB;&#x30B9;&#x306E;&#x516C;&#x7684;&#x306B;&#x5229;&#x7528;&#x53EF;&#x80FD;&#x306A;&#x30C9;&#x30E9;&#x30D5;&#x30C8;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;&#x914D;&#x5217;&#x3092;&#x691C;&#x7D22;&#x3057;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x30EA;&#x30B7;&#x30F3;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306A;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x5EA7;&#x3092;&#x89E3;&#x6790;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3067;&#x516D;&#x304B;&#x3089;&#x516B;&#x307E;&#x3067;&#x306E;&#x30E1;&#x30F3;&#x30D0;&#x30FC;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x3079;&#x304D;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3068;&#x3044;&#x3046;&#x4EEE;&#x8AAC;&#x3092;&#x30C6;&#x30B9;&#x30C8;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;25&#x5730;&#x7406;&#x7684;&#x306B;&#x591A;&#x69D8;&#x306A;&#x30C8;&#x30A6;&#x30B4;&#x30DE;&#x690D;&#x7269;&#x306E;&#x9593;&#x3067;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x5BFE;&#x7ACB;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x5909;&#x7570;&#x3092;&#x7279;&#x5FB4;&#x4ED8;&#x3051;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;preproricin&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x4E2D;&#x7ACB;&#x5E73;&#x8861;&#x306E;&#x671F;&#x5F85;&#x3092;&#x30C6;&#x30B9;&#x30C8;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;6&#x3064;&#x306E;&#x30EA;&#x30B7;&#x30F3;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306A;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x5EA7;&#x306E;&#x5B58;&#x5728;&#x3092;&#x78BA;&#x8A8D;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;preproricin&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;62.9&#x304B;&#x3089;96.3&#x30D1;&#x30FC;&#x30BB;&#x30F3;&#x30C8;&#x306E;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C9;&#x540C;&#x4E00;&#x6027;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x9396;&#x7121;&#x50B7;&#x3068;&#x5171;&#x6709;&#x3002; preproricin&#x30CF;&#x30D7;&#x30ED;&#x30BF;&#x30A4;&#x30D7;&#x9593;&#x306E;DNA&#x914D;&#x5217;&#x306E;&#x5909;&#x52D5;&#x306F;&#x8457;&#x3057;&#x304F;&#x4E2D;&#x7ACB;&#x5E73;&#x8861;&#x30E2;&#x30C7;&#x30EB;&#x306E;&#x30C6;&#x30B9;&#x30C8;&#x3092;&#x62D2;&#x5426;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x7F6E;&#x63DB;&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#x306F;&#x5BFE;&#x7ACB;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x9593;&#x306E;&#x6A5F;&#x80FD;&#x7684;&#x306A;&#x76F8;&#x9055;&#x304C;&#x6700;&#x5C0F;&#x9650;&#x306B;&#x6291;&#x3048;&#x3066;&#x304D;&#x305F;&#x793A;&#x5506;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x5929;&#x7136;&#x306E;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x6BD2;&#x7D20;&#x306E;&#x89E6;&#x5A92;&#x3068;&#x9759;&#x96FB;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306B;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x53CA;&#x307C;&#x3059;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x77E5;&#x3089;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;12&#x500B;&#x306E;&#x30A2;&#x30DF;&#x30CE;&#x9178;&#x3092;&#x4FDD;&#x6301;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x5869;&#x57FA;&#x591A;&#x578B;&#x306F;&#x3001;&#x307E;&#x3060;&#x9078;&#x629E;&#xFF08;&#x30AA;&#x30E1;&#x30AC;&#x26;lt;0.3&#xFF09;&#x3092;&#x7CBE;&#x88FD;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x7DAD;&#x6301;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x4E2D;&#x7ACB;&#x5747;&#x8861;&#x30E2;&#x30C7;&#x30EB;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x4E88;&#x6E2C;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x4EE5;&#x4E0A;&#x306E;&#x73CD;&#x3057;&#x3044;&#x30B5;&#x30A4;&#x30EC;&#x30F3;&#x30C8;&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#x306E;&#x904E;&#x5270;&#x304C;&#x542B;&#x307E;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30EA;&#x30B7;&#x30F3;&#x6C5A;&#x67D3;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x5805;&#x7262;&#x306A;&#x691C;&#x51FA;&#x65B9;&#x6CD5;&#x306E;&#x958B;&#x767A;&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x4ED6;&#x306E;&#x30EA;&#x30B7;&#x30F3;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306A;&#x5206;&#x5B50;&#x306E;&#x5B58;&#x5728;&#x3092;&#x8003;&#x616E;&#x3059;&#x308B;&#x3068;&#x30EC;&#x30D0;&#x30EC;&#x30C3;&#x30B8;preproricin&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x591A;&#x6570;&#x306E;&#x4E00;&#x5869;&#x57FA;&#x591A;&#x578B;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x3092;&#x3059;&#x3079;&#x304D;&#x5FC5;&#x8981;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

Preproricin&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x96C6;&#x56E3;&#x30EC;&#x30D9;&#x30EB;&#x306E;&#x3070;&#x3089;&#x3064;&#x304D;&#x306F;&#x3001;&#x30B8;&#x30A7;&#x30CD;&#x30E9;&#x30EA;&#x30B9;&#x30C8;&#x306E;&#x690D;&#x7269;&#x9632;&#x5FA1;&#x6BD2;&#x7D20;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x4E2D;&#x7ACB;&#x5E73;&#x8861;&#x306E;&#x671F;&#x5F85;&#x306B;&#x53CD;&#x3059;&#x308B;

Preproricin &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xC778;&#xCF54;&#xB529;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xC2E0;&#xC740; &#xB9E4;&#xC6B0; &#xB3C5;&#xC131; &#xC720;&#xD615; II &#xD53C; &#xB9C8;&#xC790; (&#xC544;&#xC8FC;&#xAE4C;&#xB9AC; &#xB77C;&#xACE0;&#xB3C4; L.) &#xCF69;&#xC758; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xB9AC;&#xBCF4;&#xC19C; &#xBE44;&#xD65C;&#xC131;&#xD654;. &#xC77C;&#xBC18; &#xC2DD;&#xBB3C; &#xBC29;&#xC5B4; &#xC9C4;&#xC73C;&#xB85C; preproricin&#xB294; &#xC911;&#xB9BD; &#xD3C9;&#xD615; &#xBAA8;&#xB378; &#xC77C;&#xCE58; &#xC778;&#xAD6C; &#xC218;&#xC900;&#xC758; &#xBCC0;&#xD654;&#xB97C; &#xC804;&#xC2DC; &#xD558; &#xACE0; &#xAD6C;&#xC131; &#xD558;&#xB294; &#xBA87; &#xAC00;&#xC9C0; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC11C;&#xB85C; &#xB2E4;&#xB978; &#xB300;&#xB9BD; &#xC608;&#xC0C1; &#xB41C;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xBA3C;&#xC800; preproricin &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xAC00;&#xC871; R. communis &#xACF5;&#xAC1C; &#xCD08;&#xC548; &#xAC8C;&#xB188; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4;&#xB97C; &#xAC80;&#xC0C9; &#xD558; &#xACE0; &#xADF8; &#xC2E0;&#xC740; &#xAC19;&#xC740; loci&#xB97C; &#xBD84;&#xC11D; &#xD558; &#xC5EC; 6 ~ 8 &#xD68C;&#xC6D0;&#xC744; &#xAD6C;&#xC131; &#xD574;&#xC57C; &#xD558;&#xB294; &#xAC00;&#xC124;&#xC744; &#xD14C;&#xC2A4;&#xD2B8; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xB2E4;&#xC74C; 25 &#xC9C0;&#xB9AC;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xBE44;&#xBC84; &#xCF69; &#xC2DD;&#xBB3C; &#xC911; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC758; &#xBCC0;&#xC774; &#xD2B9;&#xC131;&#xD654; &#xD558; &#xC5EC; preproricin &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC911;&#xB9BD; &#xD3C9;&#xD615; &#xAE30;&#xB300;&#xB97C; &#xD14C;&#xC2A4;&#xD2B8; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; preproricin &#xC720;&#xC804;&#xC790; 62.9 96.3% &#xB274;&#xD074;&#xB808;&#xC624;&#xD2F0;&#xB4DC; &#xC815;&#xCCB4;&#xC131;&#xACFC; &#xADF8;&#xB300;&#xB85C; A &#xC0AC;&#xC2AC;&#xACFC; &#xACF5;&#xC720; 6 &#xB9AC; &#xAC19;&#xC740; loci&#xC758; &#xC874;&#xC7AC;&#xB97C; &#xD655;&#xC778; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. Preproricin haplotypes &#xAC00;&#xC6B4;&#xB370; DNA &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4; &#xD3B8;&#xCC28;&#xB294; &#xD06C;&#xAC8C; &#xC911;&#xB9BD; &#xD3C9;&#xD615; &#xBAA8;&#xB378;&#xC758; &#xD14C;&#xC2A4;&#xD2B8; &#xAC70;&#xBD80;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB300;&#xCCB4; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xB300;&#xB9BD; &#xAC00;&#xC6B4;&#xB370; &#xAE30;&#xB2A5; &#xCC28;&#xC774; &#xCD5C;&#xC18C;&#xD654; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xC81C;&#xC548; &#xD558;&#xB294; &#xCC9C;&#xC5F0; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xB3C5; &#xC18C;&#xC758; &#xCD09;&#xB9E4;&#xC640; &#xC815;&#xC804;&#xAE30; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC5D0; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xBBF8;&#xCE60; &#xAC83;&#xC73C;&#xB85C; &#xC54C;&#xB824;&#xC9C4; 12 &#xC544;&#xBBF8;&#xB178;&#xC0B0;&#xC774; &#xC720;&#xC9C0;. &#xB274;&#xD074;&#xB808;&#xC624;&#xD2F0;&#xB4DC; &#xB2E4;&#xD615;&#xC131; &#xC120;&#xD0DD; (&#xC624;&#xBA54;&#xAC00; &lt; 0.3)&#xB97C; &#xC815;&#xD654; &#xD558; &#xC5EC; &#xC720;&#xC9C0; &#xC544;&#xC9C1; &#xC911;&#xB9BD; &#xD3C9;&#xD615; &#xBAA8;&#xB378;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC608;&#xCE21; &#xBCF4;&#xB2E4; &#xD070; &#xD76C;&#xADC0; &#xCE68;&#xBB35; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774;&#xC758; &#xCD08;&#xACFC; &#xD3EC;&#xD568; &#xD55C;&#xB2E4;. &#xC2E0;&#xC740; &#xC624;&#xC5FC;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xAC15;&#xB825;&#xD55C; &#xD0D0;&#xC9C0; &#xBC29;&#xBC95;&#xC758; &#xAC1C;&#xBC1C;&#xC774; &#xB2E4;&#xB978; &#xC2E0;&#xC740; &#xAC19;&#xC740; &#xBD84;&#xC790;&#xC758; &#xC874;&#xC7AC;&#xB97C; &#xACE0;&#xB824;&#xD574; &#xC57C; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xBC0F; preproricin &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC5D0; &#xC218;&#xB9CE;&#xC740; &#xB2E8;&#xC77C; &#xB274;&#xD074;&#xB808;&#xC624;&#xD2F0;&#xB4DC; polymorphisms&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC81C;&#xACF5; &#xD558;&#xB294; &#xD2B9;&#xC774;&#xC131;&#xC744; &#xD65C;&#xC6A9; &#xD55C;&#xB2E4;.

Preproricin &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC758; &#xC778;&#xAD6C; &#xC218;&#xC900;&#xC758; &#xBCC0;&#xD654; &#xAE30;&#xB300; &#xC77C;&#xBC18; &#xC2DD;&#xBB3C; &#xBC29;&#xC5B4; &#xB3C5; &#xC18C;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC911;&#xB9BD; &#xD3C9;&#xD615;&#xC758; &#xBAA8;&#xC21C;.

El gen codifica preproricin ricina, que es altamente t&#xF3;xico, tipo II, que inactiva el ribosoma de prote&#xED;nas de semillas de ricino (Ricinus communis L.). Como un gen generalista defensa de la planta, preproricin se espera que la poblaci&#xF3;n presentan variaci&#xF3;n a nivel coherente con el modelo de equilibrio neutral y que comprenden pocos alelos diferentes funcionalmente. En primer lugar, la hip&#xF3;tesis de que la familia de genes preproricin debe comprender entre seis y ocho miembros mediante la b&#xFA;squeda de la secuencia del genoma a disposici&#xF3;n del p&#xFA;blico el proyecto de R. communis y el an&#xE1;lisis de los loci, como la ricina. A continuaci&#xF3;n, probamos la expectativa de un equilibrio neutral para el gen preproricin mediante la caracterizaci&#xF3;n de la variaci&#xF3;n al&#xE9;lica entre los 25 geogr&#xE1;ficamente diversas plantas de ricino. Confirmamos la presencia de seis ricina-como loci que comparten con la identidad gen&#xE9;tica preproricin 62.9-96.3% de nucle&#xF3;tidos y de las cadenas-intacta. Variaci&#xF3;n de la secuencia de ADN entre los haplotipos preproricin significativamente rechaza las pruebas del modelo de equilibrio neutro. Mutaciones de reemplazo preservar los 12 amino&#xE1;cidos conocidos que afectan las interacciones electrost&#xE1;ticas catal&#xED;ticos y de la toxina de la prote&#xED;na nativa, lo que sugiere una divergencia funcional entre los alelos ha sido m&#xED;nima. Polimorfismo de nucle&#xF3;tido es mantenida por la selecci&#xF3;n purificadora (omega &#x26;lt;0,3) sin embargo, incluye un exceso de raras mutaciones en silencio mayor que la predicha por el modelo de equilibrio neutro. Desarrollo de m&#xE9;todos de detecci&#xF3;n de contaminaci&#xF3;n por s&#xF3;lidos para la ricina debe dar cuenta de la presencia de estas otras mol&#xE9;culas similares a la ricina, y deber&#xED;a aprovechar la especificidad proporcionada por los numerosos polimorfismos de nucle&#xF3;tido &#xFA;nico en el gen preproricin.

Poblaci&#xF3;n a nivel de variaci&#xF3;n del gen Preproricin contradice Expectativa de equilibrio neutral para las toxinas generalistas defensa de las plantas

&#x771F;&#x6838;&#x6838;&#x7CD6;&#x4F53;&#x4E0E;&#x5DE5;&#x4F5C;&#x4EBA;&#x5458;&#x9762;&#x4E34;&#x7684;&#x4E3B;&#x8981;&#x6311;&#x6218;&#x4E4B;&#x4E00;&#x5728;&#x4E8E;&#x5176;&#x4E0D;&#x4E0E;&#x540C;&#x884C;&#x7684; eubacterial &#x548C; archael&#x3002;&#x5C24;&#x5176;&#x662F;&#xFF0C;&#x7EC6;&#x80DE;&#x88C2;&#x89E3;&#x548C;&#x7EAF;&#x5316;&#x4F20;&#x7EDF;&#x9274;&#x522B;&#x8D85;&#x901F;&#x79BB;&#x5FC3;&#x6CD5;&#x771F;&#x6838;&#x6838;&#x7CD6;&#x4F53;&#x516C;&#x5F00;&#x4ED6;&#x4EEC;&#x957F;&#x65F6;&#x95F4;&#x5BF9;&#x8303;&#x56F4;&#x5E7F;&#x6CDB;&#x7684; co-purifying &#x86CB;&#x767D;&#x9176;&#x548C;&#x6838;&#x9178;&#x9176;&#xFF0C;&#x5BF9;&#x5176;&#x7ED3;&#x6784;&#x5B8C;&#x6574;&#x6027;&#x548C;&#x529F;&#x80FD;&#x9020;&#x6210;&#x8D1F;&#x9762;&#x5F71;&#x54CD;&#x3002;&#x4F7F;&#x7528;&#x534A;&#x80F1;&#x6C28;&#x9178;&#x8272;&#x8C31;&#x6CD5;&#x6307;&#x63A7; Sulfolink &#x6811;&#x8102;&#x662F;&#x8C03;&#x6574;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x89E3;&#x51B3;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x95EE;&#x9898;&#x3002;Co-purifying &#x86CB;&#x767D;&#x6C34;&#x89E3;&#x548C; nucleolytic &#x6D3B;&#x52A8;&#xFF0C;&#x751F;&#x4EA7;&#x597D;&#x6536;&#x6210;&#x7684;&#x9AD8;&#x5EA6;&#x751F;&#x5316;&#x6D3B;&#x6027;&#x9175;&#x6BCD;&#x6838;&#x7CD6;&#x4F53;&#x4E0E;&#x5728;&#x5176; rRNAs &#x5C11;&#x7EDD;&#x7F18;&#x5C42;&#x6709;&#x65E0;&#x7834;&#x635F;&#xFF0C;&#x5927;&#x5927;&#x964D;&#x4F4E;&#x4E86;&#x8FD9;&#x79CD;&#x5FEB;&#x901F;&#x800C;&#x7B80;&#x5355;&#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3002;&#x5C24;&#x5176;&#x662F;&#xFF0C;&#x8272;&#x8C31;&#x7EAF;&#x5316;&#x534F;&#x8BAE;&#x5927;&#x5927;&#x63D0;&#x9AD8;&#x4E86;&#x8D28;&#x91CF;&#x7684;&#x6838;&#x7CD6;&#x4F53;&#x7A81;&#x53D8;&#x7EC6;&#x80DE;&#x5206;&#x79BB;&#x3002;&#x6B64;&#x65B9;&#x6CD5;&#x662F;&#x4EE5;&#x53CA;&#x53EF;&#x80FD;&#x9002;&#x7528;&#x4E8E;&#x54FA;&#x4E73;&#x52A8;&#x7269;&#x6838;&#x7CD6;&#x4F53;&#x3002;&#x7B80;&#x5355;&#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#xFF0C;&#x548C;&#x589E;&#x5F3A;&#x7684;&#x7EAF;&#x5EA6;&#x548C;&#x6D3B;&#x6027;&#x7684; chromatographically &#x7EAF;&#x51C0;&#x6838;&#x7CD6;&#x4F53;&#x8868;&#x793A;&#x771F;&#x6838;&#x6838;&#x7CD6;&#x4F53;&#x7814;&#x7A76;&#x7684;&#x91CD;&#x5927;&#x6280;&#x672F;&#x8FDB;&#x6B65;&#x3002;

&#x589E;&#x5F3A;&#x7EAF;&#x5EA6;&#x3001; &#x6D3B;&#x52A8;&#x548C;&#x7ED3;&#x6784;&#x5B8C;&#x6574;&#x6027;&#x7684;&#x9175;&#x6BCD;&#x6838;&#x7CD6;&#x4F53;&#x51C0;&#x5316;&#x4F7F;&#x7528;&#x4E00;&#x822C;&#x7684;&#x8272;&#x8C31;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3002;

One of the major challenges facing researchers working with eukaryotic ribosomes lies in their lability relative to their eubacterial and archael counterparts. In particular, lysis of cells and purification of eukaryotic ribosomes by conventional differential ultracentrifugation methods exposes them for long periods of time to a wide range of co-purifying proteases and nucleases, negatively impacting their structural integrity and functionality. A chromatographic method using a cysteine charged Sulfolink resin was adapted to address these problems. This fast and simple method significantly reduces co-purifying proteolytic and nucleolytic activities, producing good yields of highly biochemically active yeast ribosomes with fewer nicks in their rRNAs. In particular, the chromatographic purification protocol significantly improved the quality of ribosomes isolated from mutant cells. This method is likely applicable to mammalian ribosomes as well. The simplicity of the method, and the enhanced purity and activity of chromatographically purified ribosome represents a significant technical advancement for the study of eukaryotic ribosomes.

Enhanced purity, activity and structural integrity of yeast ribosomes purified using a general chromatographic method.

L&#x26;#39;un des d&#xE9;fis majeurs auxquels sont confront&#xE9;s les chercheurs qui travaillent avec des ribosomes eucaryotes r&#xE9;side dans leur labilit&#xE9; par rapport &#xE0; leurs homologues eubact&#xE9;riennes et arch&#xE9;ale. En particulier, la lyse des cellules et de purification de ribosomes eucaryotes par les m&#xE9;thodes classiques de ultracentrifugation diff&#xE9;rentielle les expose pendant de longues p&#xE9;riodes de temps pour un large &#xE9;ventail de co-purification des prot&#xE9;ases et nucl&#xE9;ases, un impact n&#xE9;gatif sur leur int&#xE9;grit&#xE9; structurelle et la fonctionnalit&#xE9;. Une m&#xE9;thode chromatographique en utilisant une cyst&#xE9;ine charg&#xE9; Sulfolink r&#xE9;sine a &#xE9;t&#xE9; adapt&#xE9;e pour r&#xE9;pondre &#xE0; ces probl&#xE8;mes. Cette m&#xE9;thode simple et rapide permet de r&#xE9;duire consid&#xE9;rablement la co-purification prot&#xE9;olytique et activit&#xE9;s nucl&#xE9;olytiques, produire de bons rendements de ribosomes de levure hautement biochimiquement actifs avec moins de coupures dans leurs ARNr. En particulier, le protocole de purification chromatographique a consid&#xE9;rablement am&#xE9;lior&#xE9; la qualit&#xE9; de ribosomes isol&#xE9;s &#xE0; partir de cellules mutantes. Cette m&#xE9;thode est susceptible applicable aux ribosomes de mammif&#xE8;res ainsi. La simplicit&#xE9; de la m&#xE9;thode, et la puret&#xE9; accrue et l&#x26;#39;activit&#xE9; des ribosomes purifi&#xE9; par chromatographie repr&#xE9;sente un progr&#xE8;s technique important pour l&#x26;#39;&#xE9;tude des ribosomes eucaryotes.

Puret&#xE9; accrue, une activit&#xE9; et de l&#x26;#39;int&#xE9;grit&#xE9; structurale des ribosomes de levure purifi&#xE9; en utilisant une m&#xE9;thode chromatographique g&#xE9;n&#xE9;ral

Eine der gro&szlig;en Herausforderungen f&uuml;r die Forscher arbeiten mit eukaryotischen Ribosomen liegt in ihrer Labilit&auml;t relativ Eubacterial und Archael Gegenst&uuml;cke. Insbesondere macht: die Lyse von Zellen und Reinigung der eukaryotischen Ribosomen von konventionellen differenzielle Ultrazentrifugation Methoden sie f&uuml;r l&auml;ngere Zeit auf eine Vielzahl von co-purifying, Proteasen und Nukleasen, negative Auswirkungen auf ihre strukturelle Integrit&auml;t und Funktionalit&auml;t. Eine Chromatographische Methode, die mithilfe einer Cystein aufgeladen war Sulfolink Harz angepasst, diese Probleme anzugehen. Diese schnelle und einfache Methode verringert erheblich co-purifying proteolytische und Nucleolytic Aktivit&auml;ten, produziert gute Ertr&auml;ge von hoch biochemisch aktive Hefe Ribosomen mit weniger Kerben in ihrer rRNAs. Insbesondere verbessert das Chromatographische Reinigung-Protokoll deutlich die Qualit&auml;t der Ribosomen von mutierten Zellen isoliert. Diese Methode ist wahrscheinlich auf S&auml;ugetier-Ribosomen auch. Die Einfachheit der Methode, und die verbesserte Reinheit und Aktivit&auml;t von chromatographisch gereinigtem Ribosom stellt eine bedeutende technische Weiterentwicklung f&uuml;r das Studium der eukaryotischen Ribosomen.

Verbesserte Reinheit, Aktivit&auml;t und strukturelle Integrit&auml;t der Hefe Ribosomen gereinigt, mit einer allgemeine Chromatographische Methode.

Una delle sfide principali per i ricercatori che lavorano con i ribosomi eucarioti consiste nel loro labilit&agrave; rispetto alla loro controparte eubacterial e archael. In particolare, lisi delle cellule e purificazione dei ribosomi eucarioti da metodi di ultracentrifugazione differenziale convenzionale li espone per lunghi periodi di tempo per una vasta gamma di co-purifying le proteasi e le nucleasi, che incidono negativamente l&#39;integrit&agrave; strutturale e la funzionalit&agrave;. Un metodo cromatografico utilizzando una cisteina accusato Sulfolink resina &egrave; stato adattato per affrontare questi problemi. Questo metodo semplice e veloce riduce significativamente co-purifying proteolitici e nucleolytic attivit&agrave;, producendo buoni rendimenti dei ribosomi lievito altamente biochimicamente attive con Nick meno nella loro i rRNAs. In particolare, il protocollo di purificazione cromatografica notevolmente migliorato la qualit&agrave; dei ribosomi isolato da cellule mutanti. Questo metodo &egrave; probabilmente applicabili ai mammiferi ribosomi pure. La semplicit&agrave; del metodo e la maggiore purezza e attivit&agrave; del ribosoma secondo il processo cromatografico purificato rappresenta un significativo avanzamento tecnico per lo studio dei ribosomi eucarioti.

Maggiore purezza, attivit&agrave; e l&#39;integrit&agrave; strutturale del lievito ribosomi purificato usando un metodo cromatografico generale.

&#x771F;&#x6838;&#x751F;&#x7269;&#x306E;&#x30EA;&#x30DC;&#x30BD;&#x30FC;&#x30E0;&#x3067;&#x306E;&#x4F5C;&#x696D;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x8005;&#x304C;&#x76F4;&#x9762;&#x3059;&#x308B;&#x5927;&#x304D;&#x306A;&#x8AB2;&#x984C;&#x306E;&#x4E00;&#x3064;&#x306F;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x771F;&#x6B63;&#x7D30;&#x83CC;&#x3068;archael&#x5BFE;&#x5FDC;&#x3059;&#x308B;&#x76F8;&#x5BFE;&#x7684;&#x306A;&#x4E0D;&#x5B89;&#x5B9A;&#x6027;&#x306B;&#x3042;&#x308B;&#x3002;&#x7279;&#x306B;&#x3001;&#x5F93;&#x6765;&#x306E;&#x5DEE;&#x52D5;&#x9060;&#x5FC3;&#x5206;&#x96E2;&#x6CD5;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x7D30;&#x80DE;&#x3068;&#x771F;&#x6838;&#x751F;&#x7269;&#x306E;&#x30EA;&#x30DC;&#x30BD;&#x30FC;&#x30E0;&#x306E;&#x7CBE;&#x88FD;&#x306E;&#x6EB6;&#x89E3;&#x306F;&#x3001;&#x5426;&#x5B9A;&#x7684;&#x306A;&#x69CB;&#x9020;&#x7684;&#x5B8C;&#x5168;&#x6027;&#x3068;&#x6A5F;&#x80FD;&#x6027;&#x306B;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x4E0E;&#x3048;&#x3001;&#x5171;&#x540C;&#x6D44;&#x5316;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C6;&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x5E83;&#x3044;&#x7BC4;&#x56F2;&#x306B;&#x9577;&#x6642;&#x9593;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x305D;&#x308C;&#x3089;&#x3092;&#x516C;&#x958B;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30A4;&#x30F3;&#x5145;&#x96FB;Sulfolink&#x6A39;&#x8102;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x305F;&#x30AF;&#x30ED;&#x30DE;&#x30C8;&#x30B0;&#x30E9;&#x30D5;&#x6CD5;&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x554F;&#x984C;&#x306B;&#x5BFE;&#x51E6;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x9069;&#x5FDC;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x8FC5;&#x901F;&#x304B;&#x3064;&#x7C21;&#x5358;&#x306A;&#x65B9;&#x6CD5;&#x306F;&#x3001;&#x5927;&#x5E45;&#x306B;rRNAs&#x306E;&#x5C11;&#x306A;&#x3044;&#x30CB;&#x30C3;&#x30AF;&#x3068;&#x975E;&#x5E38;&#x306B;&#x751F;&#x5316;&#x5B66;&#x7684;&#x306B;&#x6D3B;&#x6027;&#x9175;&#x6BCD;&#x30EA;&#x30DC;&#x30BD;&#x30FC;&#x30E0;&#x306E;&#x826F;&#x597D;&#x306A;&#x53CE;&#x7387;&#x3092;&#x751F;&#x7523;&#x3001;&#x5171;&#x540C;&#x6D44;&#x5316;&#x5206;&#x89E3;&#x3068;&#x6838;&#x9178;&#x5206;&#x89E3;&#x6D3B;&#x52D5;&#x3092;&#x6E1B;&#x3089;&#x3059;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x7279;&#x306B;&#x3001;&#x30AF;&#x30ED;&#x30DE;&#x30C8;&#x30B0;&#x30E9;&#x30D5;&#x30A3;&#x30FC;&#x7CBE;&#x88FD;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C8;&#x30B3;&#x30EB;&#x304C;&#x5927;&#x5E45;&#x306B;&#x5909;&#x7570;&#x7D30;&#x80DE;&#x304B;&#x3089;&#x5358;&#x96E2;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30EA;&#x30DC;&#x30BD;&#x30FC;&#x30E0;&#x306E;&#x54C1;&#x8CEA;&#x3092;&#x6539;&#x5584;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x30E1;&#x30BD;&#x30C3;&#x30C9;&#x306F;&#x3001;&#x540C;&#x69D8;&#x306B;&#x3001;&#x54FA;&#x4E73;&#x52D5;&#x7269;&#x306E;&#x30EA;&#x30DC;&#x30BD;&#x30FC;&#x30E0;&#x3078;&#x306E;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x304C;&#x9069;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30AF;&#x30ED;&#x30DE;&#x30C8;&#x30B0;&#x30E9;&#x30D5;&#x30A3;&#x30FC;&#x7CBE;&#x88FD;&#x3057;&#x305F;&#x30EA;&#x30DC;&#x30BD;&#x30FC;&#x30E0;&#x306E;&#x65B9;&#x6CD5;&#x306E;&#x7C21;&#x7D20;&#x5316;&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x5F37;&#x5316;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x7D14;&#x5EA6;&#x3068;&#x6D3B;&#x6027;&#x306F;&#x3001;&#x771F;&#x6838;&#x751F;&#x7269;&#x306E;&#x30EA;&#x30DC;&#x30BD;&#x30FC;&#x30E0;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x6280;&#x8853;&#x9032;&#x6B69;&#x3092;&#x8868;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x5F37;&#x5316;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x7D14;&#x5EA6;&#x3001;&#x30A2;&#x30AF;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D3;&#x30C6;&#x30A3;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x4E00;&#x822C;&#x7684;&#x306A;&#x30AF;&#x30ED;&#x30DE;&#x30C8;&#x30B0;&#x30E9;&#x30D5;&#x30A3;&#x30FC;&#x6CD5;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x3066;&#x7CBE;&#x88FD;&#x9175;&#x6BCD;&#x30EA;&#x30DC;&#x30BD;&#x30FC;&#x30E0;&#x306E;&#x69CB;&#x9020;&#x5065;&#x5168;&#x6027;

&#xC5F0;&#xAD6C;&#xD300;&#xC740; &#xC9C4; &#xD575; &#xB9AC;&#xBCF4;&#xC19C; &#xC791;&#xC5C5;&#xC5D0; &#xC9C1;&#xBA74; &#xD558;&#xB294; &#xC8FC;&#xC694; &#xACFC;&#xC81C; &#xC911; &#xD558;&#xB098;&#xB294; eubacterial &#xBC0F; archael &#xB4E4;&#xC744; &#xAE30;&#xC900;&#xC73C;&#xB85C; &#xC790;&#xC2E0;&#xC758; lability&#xC5D0; &#xB193;&#xC5EC; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD2B9;&#xD788;, &#xC138;&#xD3EC; &#xC138;&#xD3EC;&#xC758; &#xC6A9; &#xD574; &#xBC0F; &#xAE30;&#xC874;&#xC758; &#xCC28;&#xB3D9; ultracentrifugation &#xBC29;&#xBC95;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC9C4; &#xD575; &#xB9AC;&#xBCF4;&#xC19C;&#xC758; &#xC815;&#xD654; &#xB178;&#xCD9C; &#xADF8;&#xB4E4; &#xD504;&#xB85C; &#xD14C;&#xC544; &#xC81C; &#xBC0F; nucleases, &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xAD6C;&#xC870;&#xC801; &#xBB34;&#xACB0;&#xC131; &#xBC0F; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC5D0; &#xBD80;&#xC815;&#xC801;&#xC778; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xBBF8;&#xCE58;&#xB294; co-purifying&#xC758; &#xB113;&#xC740; &#xBC94;&#xC704;&#xB97C; &#xC624;&#xB79C; &#xAE30;&#xAC04;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C;. &#xD06C;&#xB85C;&#xB9C8; &#xBA54;&#xC11C;&#xB4DC;&#xB294; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD14C;&#xC778;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xCCAD;&#xAD6C; Sulfolink &#xC218; &#xC9C0;&#xB294; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xBB38;&#xC81C;&#xB97C; &#xD574;&#xACB0; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xC801;&#xC751;. &#xC774; &#xBE60;&#xB974;&#xACE0; &#xAC04;&#xB2E8;&#xD55C; &#xBC29;&#xBC95;&#xC740; &#xC26C;&#xC6B0;&#xBA74;&#xC11C;&#xB3C4; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; co-purifying &#xBC0F; nucleolytic &#xD65C;&#xB3D9;, &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; Rrnas&#xC5D0;&#xC11C; &#xC801;&#xC740; &#xB2C9;&#xC2A4;&#xC640; &#xB192;&#xC740; &#xD654;&#xD559;&#xC801; &#xD65C;&#xC131; &#xD6A8; &#xBAA8; &#xB9AC;&#xBCF4;&#xC19C;&#xC758; &#xC88B;&#xC740; &#xC218;&#xD655;&#xB7C9;&#xC744; &#xC0DD;&#xC0B0;. &#xD2B9;&#xD788;, &#xD06C;&#xB85C;&#xB9C8; &#xC815;&#xD654; &#xD504;&#xB85C;&#xD1A0;&#xCF5C; &#xB9AC;&#xBCF4;&#xC19C; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBD84;&#xB9AC;&#xC758; &#xD488;&#xC9C8;&#xC744; &#xD06C;&#xAC8C; &#xAC1C;&#xC120;. &#xC774; &#xBC29;&#xBC95;&#xC740; &#xAC00;&#xB2A5;&#xC131;&#xC774; &#xD3EC;&#xC720;&#xB958;&#xC5D0; &#xC801;&#xC6A9; &#xAC00;&#xB2A5;&#xD55C; &#xB9AC;&#xBCF4;&#xC19C; &#xBFD0;&#xB9CC;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xBA54;&#xC11C;&#xB4DC;, &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0; &#xD5A5;&#xC0C1; &#xB41C; &#xC21C;&#xB3C4;&#xC758; &#xB2E8;&#xC21C; &#xD558; &#xACE0; chromatographically &#xC815;&#xD654; &#xB9AC;&#xBCF4;&#xC19C;&#xC758; &#xD65C;&#xB3D9; &#xC9C4; &#xD575; &#xB9AC;&#xBCF4;&#xC19C;&#xC758; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xAE30;&#xC220;&#xC801; &#xC9C4;&#xBCF4;&#xB97C; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0C5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xD5A5;&#xC0C1; &#xB41C; &#xC21C;&#xB3C4;, &#xD65C;&#xB3D9; &#xBC0F; &#xC77C;&#xBC18; &#xD06C;&#xB85C;&#xB9C8; &#xBA54;&#xC11C;&#xB4DC;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC815;&#xD654; &#xD558;&#xB294; &#xD6A8; &#xBAA8; &#xB9AC;&#xBCF4;&#xC19C;&#xC758; &#xAD6C;&#xC870;&#xC801; &#xBB34;&#xACB0;&#xC131;.

Uno de los grandes retos que enfrentan los investigadores que trabajan con los ribosomas eucariotas se encuentra en su labilidad en comparaci&#xF3;n con sus hom&#xF3;logos eubacterial y archael. En particular, la lisis de las c&#xE9;lulas y la purificaci&#xF3;n de los ribosomas eucariotas por m&#xE9;todos convencionales de diferenciales ultracentrifugaci&#xF3;n les expone durante largos per&#xED;odos de tiempo para una amplia gama de proteasas purificadores de co-y nucleasas, afectando negativamente a su integridad estructural y la funcionalidad. Un m&#xE9;todo cromatogr&#xE1;fico utilizando una resina de ciste&#xED;na cargada Sulfolink fue adaptado para hacer frente a estos problemas. Este m&#xE9;todo r&#xE1;pido y sencillo reduce significativamente co-purificaci&#xF3;n proteol&#xED;tica y actividades nucleol&#xED;ticos, producir buenos rendimientos de los ribosomas de levadura altamente bioqu&#xED;micamente activos con un menor n&#xFA;mero de muescas en sus rRNAs. En particular, el protocolo de purificaci&#xF3;n cromatogr&#xE1;fica mejorado significativamente la calidad de los ribosomas aislados de c&#xE9;lulas mutantes. Este m&#xE9;todo es probable aplicable a los ribosomas de mam&#xED;feros tambi&#xE9;n. La simplicidad del m&#xE9;todo, y la pureza mejorada y actividad de ribosoma cromatogr&#xE1;ficamente purificados representa un avance t&#xE9;cnico importante para el estudio de los ribosomas eucariotas.

Pureza mejorada, la actividad y la integridad estructural de los ribosomas de levadura purificada mediante un m&#xE9;todo de cromatograf&#xED;a de general

&#x5168;&#x7403;&#x6D4B;&#x7ED8; rRNA &#x7ED3;&#x6784;&#x7684;&#x4F20;&#x7EDF;&#x65B9;&#x6CD5;&#x662F;&#x5728;&#x65F6;&#x95F4;&#x3001; &#x4EBA;&#x529B;&#x548C;&#x8D39;&#x7528;&#x9AD8;&#x6602;&#x3002;&#x9AD8;&#x541E;&#x5410;&#x91CF;&#x9009;&#x62E9;&#x6027; 2&#39; &#x7F9F;&#x57FA;&#x9170;&#x57FA;&#x5316;&#x6269;&#x5C55;&#x5E95;&#x6F06; (hSHAPE) &#x7684;&#x5206;&#x6790;&#x901A;&#x8FC7;&#x4F7F;&#x7528;&#x5FFD;&#x7565;&#x4E86;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x95EE;&#x9898;&#xFF0C;&#x9057;&#x4F20;&#x7269;&#x8D28;&#x6807;&#x8BB0;&#x5F15;&#x7269;&#x6765;&#x6267;&#x884C;&#x5E95;&#x6F06;&#x5EF6;&#x957F;&#x53CD;&#x5E94;&#xFF0C;&#x5176;&#x4E2D;&#x4EA7;&#x54C1;&#x53EF;&#x4EE5;&#x5206;&#x9694;&#x6BDB;&#x7EC6;&#x7BA1;&#x7535;&#x6CF3;&#x6CD5;&#xFF0C;&#x4ECE;&#x800C;&#x4F7F;&#x957F;&#x65F6;&#x95F4;&#x8BFB;&#x53D6;&#x7684;&#x957F;&#x5EA6;&#x4EE5;&#x6210;&#x672C;&#x6709;&#x6548;&#x7684;&#x65B9;&#x5F0F;&#x3002;&#x6240;&#x4EE5;&#x751F;&#x6210;&#x7684;&#x6570;&#x636E;&#x8FDB;&#x884C;&#x5206;&#x6790;&#x4EE5;&#x5B9A;&#x91CF;&#x7684;&#x65B9;&#x5F0F;&#x4F7F;&#x7528; SHAPEFinder&#x3002;&#x8FD9;&#x79CD;&#x65B9;&#x6CD5;&#x88AB;&#x7528;&#x4E8E;&#x6620;&#x5C04;&#x7684;&#x51E0;&#x4E4E;&#x6574;&#x4E2A;&#x5E8F;&#x5217;&#x4ECE;&#x5B8C;&#x597D;&#xFF0C;&#x7A7A;&#x9175;&#x6BCD;&#x6838;&#x7CD6;&#x4F53;&#x7684; 3 &#x5927; rRNAs &#x7684;&#x7075;&#x6D3B;&#x6027;&#x3002;&#x6620;&#x5C04;&#x5230;&#x9644;&#x8FD1;&#x539F;&#x5B50;&#x5206;&#x8FA8;&#x7387;&#x9175;&#x6BCD;&#x6838;&#x7CD6;&#x4F53;&#x7ED3;&#x6784;&#x4E0A;&#x7684;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x6570;&#x636E;&#x663E;&#x793A;&#x5DF2;&#x77E5;&#x7684;&#x53CD;&#x5F0F;&#x4F5C;&#x7528;&#x56E0;&#x5B50;&#x7684;&#x7ED3;&#x5408;&#x70B9;&#x548C;&#x4EE5;&#x524D;&#x672A;&#x77E5;&#x9AD8;&#x5EA6;&#x7075;&#x6D3B;&#x533A;&#x57DF;&#x7684;&#x9175;&#x6BCD; rRNA&#x3002;&#x8FD9;&#x9879;&#x6280;&#x672F;&#x7684;&#x6539;&#x8FDB;&#x5C06;&#x4F7F;&#x7279;&#x5B9A;&#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x7684;&#x6620;&#x5C04;&#x7684; rRNA &#x7ED3;&#x6784;&#x6839;&#x636E; tRNA &#x5360;&#x7528;&#x3001; &#x5B58;&#x5728;&#x5176;&#x4ED6;&#x53CD;&#x5F0F;&#x4F5C;&#x7528;&#x56E0;&#x5B50;&#xFF0C;&#x7531;&#x4E8E;&#x7A81;&#x53D8;&#x7684;&#x5185;&#x5728;&#x6838;&#x7CD6;&#x4F53;&#x7EC4;&#x4EF6;&#x6216;&#x5176;&#x4ED6;&#x5916;&#x5728;&#x56E0;&#x7D20;&#x5F71;&#x54CD;&#x6838;&#x7CD6;&#x4F53;&#x7684;&#x751F;&#x7269;&#x53D1;&#x751F;&#xFF0C;&#x6216;&#x5E73;&#x79FB;&#x7684;&#x6291;&#x5236;&#x5242;&#x7684;&#x72B6;&#x6001;&#x7684;&#x53D8;&#x5316;&#x3002;

&#x9AD8;&#x541E;&#x5410;&#x91CF;&#x7684;&#x4F7F;&#x7528; hSHAPE &#x7684;&#x9175;&#x6BCD;&#x6838;&#x7CD6;&#x4F53;&#x7684;&#x7ED3;&#x6784;&#x5206;&#x6790;&#x3002;

Global mapping of rRNA structure by traditional methods is prohibitive in terms of time, labor and expense. High throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension (hSHAPE) bypasses these problems by using fluorescently labeled primers to perform primer extension reactions, the products of which can be separated by capillary electrophoresis, thus enabling long read lengths in a cost effective manner. The data so generated is analyzed in a quantitative fashion using SHAPEFinder. This approach was used to map the flexibility of nearly the entire sequences of the 3 largest rRNAs from intact, empty yeast ribosomes. Mapping of these data onto near-atomic resolution yeast ribosome structures revealed the binding sites of known trans-acting factors, as well as previously unknown highly flexible regions of yeast rRNA. Refinement of this technology will enable nucleotide-specific mapping of changes in rRNA structure depending on the status of tRNA occupancy, the presence or absence of other trans-acting factors, due to mutations of intrinsic ribosome components or extrinsic factors affecting ribosome biogenesis, or in the presence of translational inhibitors.

High throughput structural analysis of yeast ribosomes using hSHAPE.

La cartographie mondiale ARNr structure par les m&eacute;thodes traditionnelles est prohibitive en termes de temps, du travail et les d&eacute;penses. Haut d&eacute;bit s&eacute;lectif 2&#39; hydroxyle acylation analys&eacute;e par extension d&#39;amorce (hSHAPE) permet de contourner ces probl&egrave;mes en utilisant fluorescent &eacute;tiquet&eacute; amorces pour effectuer des r&eacute;actions d&#39;extension amorce, dont les produits peuvent &ecirc;tre s&eacute;par&eacute;es par &eacute;lectrophor&egrave;se capillaire, permettant ainsi &agrave; longueurs de temps de lecture d&#39;une mani&egrave;re rentable. Les donn&eacute;es ainsi g&eacute;n&eacute;r&eacute;es sont analys&eacute;es de fa&ccedil;on quantitative &agrave; l&#39;aide de SHAPEFinder. Cette approche a &eacute;t&eacute; utilis&eacute;e pour mapper la flexibilit&eacute; des presque toute s&eacute;quences de l&#39;ARNr plus grand 3 de ribosomes levure intact, vide. La cartographie de ces donn&eacute;es sur les structures de r&eacute;solution atomique pr&egrave;s de levure ribosome r&eacute;v&egrave;le les sites de fixation de facteurs trans connus, ainsi que des r&eacute;gions hautement flexibles jusqu&#39;alors inconnues de levure ARNr. Raffinement de cette technologie permettra aux nucl&eacute;otides sp&eacute;cifiques cartographie des changements dans la structure selon le statut d&#39;occupation de l&#39;ARNt, la pr&eacute;sence ou l&#39;absence d&#39;autres facteurs trans, due &agrave; des mutations de composants de ribosome intrins&egrave;ques ou extrins&egrave;ques facteurs affectant la biog&eacute;n&egrave;se des ribosomes, ou en pr&eacute;sence d&#39;inhibiteurs translationnelles ARNr.

Analyse structurale &agrave; haut d&eacute;bit des ribosomes de levure &agrave; l&#39;aide de hSHAPE.

Global Mapping rRNA Struktur nach traditionellen Methoden ist unerschwinglich in Bezug auf Zeit, Arbeit und Kosten. Hoher Durchsatz selektiv 2&#39; Hydroxyl Acylierung von Z&uuml;ndkapselextension (hSHAPE) analysiert umgeht diese Probleme mit fluorescently beschriftete Primer Grundierung Erweiterung Reaktionen, durchf&uuml;hren von Kapillarelektrophorese, wodurch lange Lese L&auml;ngen auf kosteng&uuml;nstige Weise die Produkte von denen getrennt werden k&ouml;nnen. Die so generierten Daten werden in einer quantitativen Weise mit SHAPEFinder analysiert. Dieser Ansatz wurde verwendet, um die Flexibilit&auml;t der fast die ganzen Sequenzen von den 3 gr&ouml;&szlig;ten rRNAs von intakt, leere Hefe Ribosomen zuzuordnen. Zuordnung dieser Daten auf in der N&auml;he von atomarer Aufl&ouml;sung Hefe Ribosom Strukturen offenbart die Bindungsstellen des bekannten Trans wirkende Faktoren, sowie bisher unbekannte hochflexible Regionen Hefe rRNA. Verfeinerung dieser Technik wird Nukleotid-spezifische Zuordnung von &Auml;nderungen der rRNA Struktur abh&auml;ngig vom Status der tRNA-Belegung, der Anwesenheit oder Abwesenheit anderer Trans wirkende Faktoren, durch Mutationen der systeminterne Ribosom Komponenten oder extrinsischen Faktoren, die die Ribosom Biogenese oder in Anwesenheit von translational-Inhibitoren aktivieren.

Hochdurchsatz-Strukturanalyse der Hefe Ribosomen mit hSHAPE.

Mappatura globale della struttura rRNA dai metodi tradizionali &egrave; proibitivo in termini di tempo, manodopera e spese. High throughput selettivo 2&#39; idrossile acilazione analizzati dall&#39;estensione dell&#39;iniettore (hSHAPE) ignora questi problemi utilizzando fluorescente etichettato gli iniettori per eseguire reazioni di estensione dell&#39;iniettore, i cui prodotti possono essere separati tramite elettroforesi capillare, consentendo in tal modo lungo leggere lunghezze in modo redditizio. I dati cos&igrave; generati viene analizzati in maniera quantitativa tramite SHAPEFinder. Questo approccio &egrave; stato utilizzato per mappare la flessibilit&agrave; delle sequenze quasi intere dei di rRNAs pi&ugrave; grandi 3 da ribosomi lievito intatte, vuota. Mappatura di questi dati su strutture di risoluzione atomica vicino lievito ribosoma ha rivelato che i siti di legame dei fattori noti trans-recitazione, cos&igrave; come precedentemente sconosciute regioni altamente flessibile del lievito rRNA. Perfezionamento di questa tecnologia consentir&agrave; di specifici nucleotidi mappatura dei cambiamenti nella struttura di rRNA a seconda dello stato di occupazione del tRNA, la presenza o l&#39;assenza di altri fattori trans-recitazione, dovuta a mutazioni di componenti intrinseche ribosoma o fattori estrinseci che influenzano la biogenesi del ribosoma, o in presenza di inibitori traslazionali.

Analisi strutturale di high throughput dei ribosomi di lievito utilizzando hSHAPE.

&#x5F93;&#x6765;&#x306E;&#x65B9;&#x6CD5;&#x306B;&#x3088;&#x308B; rRNA &#x306E;&#x69CB;&#x9020;&#x306E;&#x30B0;&#x30ED;&#x30FC;&#x30D0;&#x30EB; &#x30DE;&#x30C3;&#x30D4;&#x30F3;&#x30B0;&#x306F;&#x3001;&#x6642;&#x9593;&#x3001;&#x52B4;&#x50CD;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x8CBB;&#x7528;&#x306E;&#x70B9;&#x3067;&#x6CD5;&#x5916;&#x306A;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x30D7;&#x30E9;&#x30A4;&#x30DE;&#x30FC;&#x62E1;&#x5F35; (hSHAPE) &#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5206;&#x6790;&#x30CF;&#x30A4;&#x30B9;&#x30EB;&#x30FC;&#x30D7;&#x30C3;&#x30C8;&#x9078;&#x629E;&#x7684; 2&#39; &#x30D2;&#x30C9;&#x30ED;&#x30AD;&#x30B7;&#x30EB; &#x30A2;&#x30B7;&#x30EB;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x554F;&#x984C;&#x3092;&#x30D0;&#x30A4;&#x30D1;&#x30B9;&#x86CD;&#x5149;&#x30E9;&#x30D9;&#x30EB;&#x88FD;&#x54C1;&#x304C;&#x6700;&#x65B0;&#x306E; attribute-name &#x9577;&#x3044;&#x8AAD;&#x307F;&#x53D6;&#x308A;&#x306E;&#x9577;&#x3055;&#x3001;&#x30B3;&#x30B9;&#x30C8;&#x52B9;&#x679C;&#x7684;&#x306A;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3067;&#x306E;&#x30AD;&#x30E3;&#x30D4;&#x30E9;&#x30EA;&#x30FC;&#x96FB;&#x6C17;&#x6CF3;&#x52D5;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5206;&#x96E2;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306F;&#x3001;&#x30D7;&#x30E9;&#x30A4;&#x30DE;&#x30FC;&#x62E1;&#x5F35;&#x53CD;&#x5FDC;&#x3092;&#x5B9F;&#x884C;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x30D7;&#x30E9;&#x30A4;&#x30DE;&#x30FC;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3060;&#x304B;&#x3089;&#x751F;&#x6210;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x306F; SHAPEFinder &#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x305F;&#x5B9A;&#x91CF;&#x7684;&#x306A;&#x30D5;&#x30A1;&#x30C3;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3067;&#x5206;&#x6790;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x306F;&#x67D4;&#x8EDF;&#x6027;&#x306E;&#x307B;&#x307C;&#x5168;&#x4F53;&#x306E;&#x30B7;&#x30FC;&#x30B1;&#x30F3;&#x30B9;&#x305D;&#x306E;&#x307E;&#x307E;&#x3001;&#x7A7A;&#x9175;&#x6BCD;&#x30EA;&#x30DC;&#x30BE;&#x30FC;&#x30E0;&#x304B;&#x3089; 3 &#x6700;&#x5927; Rrna &#x306E;&#x30DE;&#x30C3;&#x30D7;&#x306B;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x8FD1;&#x304F;&#x539F;&#x5B50;&#x5206;&#x89E3;&#x80FD;&#x306E;&#x9175;&#x6BCD;&#x306E;&#x30EA;&#x30DC;&#x30BD;&#x30FC;&#x30E0;&#x306E;&#x69CB;&#x9020;&#x306E;&#x4E0A;&#x306B;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x306E;&#x30DE;&#x30C3;&#x30D4;&#x30F3;&#x30B0;&#x3092;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x3057;&#x305F;&#x65E2;&#x77E5;&#x306E;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x306B;&#x4F5C;&#x7528;&#x3059;&#x308B;&#x56E0;&#x5B50;&#x306E;&#x7D50;&#x5408;&#x90E8;&#x4F4D;&#x3060;&#x3051;&#x3067;&#x306A;&#x304F;&#x3001;&#x4EE5;&#x524D;&#x306F;&#x672A;&#x77E5;&#x306E;&#x67D4;&#x8EDF;&#x6027;&#x306E;&#x9AD8;&#x3044;&#x5730;&#x57DF;&#x9175;&#x6BCD;&#x306E; rRNA&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x6280;&#x8853;&#x306E;&#x6D17;&#x7DF4; tRNA &#x5360;&#x6709;&#x3001;&#x30D7;&#x30EC;&#x30BC;&#x30F3;&#x30B9;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x4ED6;&#x306E;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x306B;&#x4F5C;&#x7528;&#x3059;&#x308B;&#x8981;&#x56E0;&#x306E;&#x7D44;&#x307F;&#x8FBC;&#x307F;&#x30EA;&#x30DC;&#x30BD;&#x30FC;&#x30E0; &#x30B3;&#x30F3;&#x30DD;&#x30FC;&#x30CD;&#x30F3;&#x30C8;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x5916;&#x56E0;&#x30EA;&#x30DC;&#x30BD;&#x30FC;&#x30E0;&#x306E;&#x751F;&#x5408;&#x6210;&#x306B;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x4E0E;&#x3048;&#x308B;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x4E26;&#x9032;&#x963B;&#x5BB3;&#x5264;&#x306E;&#x5B58;&#x5728;&#x4E0B;&#x3067;&#x306E;&#x5909;&#x7570;&#x304C;&#x539F;&#x56E0;&#x306E;&#x4E0D;&#x5728;&#x306E;&#x72B6;&#x614B;&#x306B;&#x5FDC;&#x3058;&#x3066; rRNA &#x306E;&#x69CB;&#x9020;&#x5909;&#x5316;&#x306E;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C9;&#x56FA;&#x6709;&#x306E;&#x30DE;&#x30C3;&#x30D4;&#x30F3;&#x30B0;&#x304C;&#x53EF;&#x80FD;&#x306B;&#x306A;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x9AD8;&#x30B9;&#x30EB;&#x30FC;&#x30D7;&#x30C3;&#x30C8; hSHAPE &#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x305F;&#x9175;&#x6BCD;&#x30EA;&#x30DC;&#x30BE;&#x30FC;&#x30E0;&#x306E;&#x69CB;&#x9020;&#x89E3;&#x6790;&#x3002;

&#xC804;&#xD1B5;&#xC801;&#xC778; &#xBC29;&#xBC95;&#xC73C;&#xB85C; rRNA &#xAD6C;&#xC870;&#xC758; &#xAE00;&#xB85C;&#xBC8C; &#xB9E4;&#xD551; &#xB178;&#xB3D9; &#xC2DC;&#xAC04;&#xACFC; &#xBE44;&#xC6A9; &#xAE08;&#xC9C0;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB192;&#xC740; &#xCC98;&#xB9AC;&#xB7C9; &#xC120;&#xD0DD;&#xC801; 2&#39; &#xC218; &#xC0B0; &#xAE30; acylation &#xB1CC;&#xAD00; &#xC5F0;&#xC7A5; (hSHAPE)&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xBD84;&#xC11D; &#xB193;&#xC5EC;&#xC788;&#xB294;&#xC9C0; &#xD45C;&#xC2DC;&#xB294; &#xC81C;&#xD488; &#xBE44;&#xC6A9; &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC778; &#xBC29;&#xBC95;&#xC73C;&#xB85C; &#xAE34; &#xC77D;&#xAE30; &#xAE38;&#xC774; &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xBAA8; &#xC138;&#xAD00; &#xC804;&#xAE30; &#xC774;&#xB3D9; &#xBC95;&#xC73C;&#xB85C; &#xBD84;&#xB9AC; &#xB420; &#xC218; &#xC788;&#xB2E4; &#xB1CC;&#xAD00; &#xD655;&#xC7A5; &#xBC18;&#xC751;&#xC744; &#xC218;&#xD589; &#xD558;&#xB294; &#xB1CC;&#xAD00;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xBB38;&#xC81C;&#xB97C; &#xBB34;&#xC2DC; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774;&#xB807;&#xAC8C; &#xC0DD;&#xC131; &#xB41C; &#xB370;&#xC774;&#xD130;&#xB294; &#xC591;&#xC801; &#xBC29;&#xC2DD;&#xC73C;&#xB85C; Shapefinder&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xBD84;&#xC11D; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xC774;&#xB807;&#xAC8C;&#xB294; &#xAC70;&#xC758; &#xADF8;&#xB300;&#xB85C;, &#xBE48; &#xD6A8; &#xBAA8; &#xB9AC;&#xBCF4;&#xC19C;&#xC5D0;&#xC11C; 3 &#xBC88;&#xC9F8;&#xB85C; &#xD070; Rrnas&#xC758; &#xC804;&#xCCB4; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4;&#xC758; &#xC720;&#xC5F0;&#xC131;&#xC744; &#xB9E4;&#xD551;&#xD558;&#xB294; &#xB370; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xADFC;&#xCC98; &#xC6D0;&#xC790; &#xD574;&#xC0C1;&#xB3C4; &#xD6A8; &#xBAA8; &#xB9AC;&#xBCF4;&#xC19C; &#xAD6C;&#xC870;&#xC5D0; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xB370;&#xC774;&#xD130;&#xC758; &#xB9E4;&#xD551; &#xACF5;&#xAC1C; &#xC54C;&#xB824;&#xC9C4; &#xD2B8;&#xB79C;&#xC2A4; &#xC5F0;&#xAE30; &#xC694;&#xC18C;&#xC758; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8; &#xBFD0;&#xB9CC; &#xC544;&#xB2C8;&#xB77C; &#xD6A8; &#xC774;&#xC804;&#xC5D0; &#xC54C;&#xB824;&#xC9C0;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC740; &#xB9E4;&#xC6B0; &#xC720;&#xC5F0;&#xD55C; &#xC601;&#xC5ED; rRNA. &#xC774; &#xAE30;&#xC220;&#xC758; &#xAD6C;&#xCCB4;&#xD654; tRNA &#xC778;, &#xC874;&#xC7AC; &#xB610;&#xB294; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774;&#xC758; &#xBCF8;&#xC9C8;&#xC801;&#xC778; &#xB9AC;&#xBCF4;&#xC19C; &#xAD6C;&#xC131; &#xC694;&#xC18C; &#xB610;&#xB294; &#xB9AC;&#xBCF4;&#xC19C; &#xC18D;&#xC5D0; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xBBF8;&#xCE58;&#xB294; extrinsic &#xC694;&#xC778; &#xB610;&#xB294; &#xBCC0;&#xD658; &#xC5B5;&#xC81C;&#xC81C;&#xC758; &#xC874;&#xC7AC;&#xB85C; &#xC778;&#xD574; &#xB2E4;&#xB978; &#xD2B8;&#xB79C;&#xC2A4; &#xD589;&#xB3D9; &#xC694;&#xC778;&#xC758; &#xBD80;&#xC7AC; &#xC0C1;&#xD0DC;&#xC5D0; &#xB530;&#xB77C; &#xAD6C;&#xC870; Rrna&#xC758; &#xC5FC;&#xAE30; &#xD2B9;&#xC815; &#xB9E4;&#xD551; &#xC218; &#xC788;&#xAC8C; &#xB41C;&#xB2E4;.

&#xB192;&#xC740; &#xCC98;&#xB9AC;&#xB7C9; Hshape&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xD6A8; &#xBAA8; &#xB9AC;&#xBCF4;&#xC19C;&#xC758; &#xAD6C;&#xC870; &#xBD84;&#xC11D;.

Cartograf&iacute;a mundial de estructura de rRNA por m&eacute;todos tradicionales es prohibitivo en t&eacute;rminos de tiempo, mano de obra y los gastos. Alto rendimiento selectivo 2&#39; hidroxilo acilaci&oacute;n analizado por la extensi&oacute;n de la cartilla (hSHAPE) pasa por alto estos problemas mediante el uso de fluorescencia etiquetada cartillas para llevar a cabo reacciones de extensi&oacute;n de la cartilla, los productos de los cuales pueden ser separados por electroforesis capilar, permitiendo longitudes largas leer de una manera rentable. Los datos generados por lo tanto se analizan de manera cuantitativa utilizando SHAPEFinder. Este enfoque fue utilizado para asignar la flexibilidad de casi las secuencias enteras de los 3 rRNAs m&aacute;s grandes de los ribosomas intactos, vac&iacute;a de la levadura. Asignaci&oacute;n de estos datos sobre estructuras de resoluci&oacute;n at&oacute;mica cerca de levadura ribosoma revel&oacute; los sitios de uni&oacute;n de factores de acci&oacute;n trans conocidos, as&iacute; como regiones altamente flexibles previamente desconocidas de levadura rRNA. Refinamiento de esta tecnolog&iacute;a permitir&aacute; nucle&oacute;tidos espec&iacute;ficos mapeo de cambios en la estructura del rRNA dependiendo del estado de ocupaci&oacute;n de tRNA, la presencia o ausencia de otros factores de acci&oacute;n trans, debido a las mutaciones de ribosoma intr&iacute;nseca componentes o factores extr&iacute;nsecos que influyen en la biog&eacute;nesis de ribosomas, o en presencia de inhibidores de la traslaci&oacute;n.

Jonathan A. Leshin

Department of Cell Biology and Molecular Genetics

University of Maryland

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Jonathan A. Leshin

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University of Maryland

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Department of Cell Biology and Molecular Genetics