显微注射mRNA和斑马鱼的胚胎吗啉反义寡核苷酸。

摘要

显微注射是外来物质引入斑马鱼胚胎受精的完善而有效的方法。在这里，我们展示了一个强大的执行mRNA表达显微注射技术，和吗啉代寡核苷酸在斑马鱼的基因敲除研究。

摘要

调查在开发过程中的一个基因的作用的一个必不可少的工具，来进行基因敲除，的过度表达，和错误表达研究的能力。在斑马鱼（

研究方案

第1部分：微量制备，显微注射室板

1. 编造加热和拉​​在微量拉拔设备的高硼硅玻璃毛细管（世界精密仪器公司，1B100 - 4）（萨特仪器公司，火焰山/布朗的P - 97）的微量。在培养皿中少量的粘土或胶带上的商店。
2. 1X E3媒体与楔形槽，将成为一个简单的方法（如“斑马鱼书”中描述的）在注射胚胎成型板，倒在1.5％琼脂糖（美国Bioanlytical公司，AB00972 - 00500）让琼脂室板之前，使用和储存在4℃固化。

第2部分：RNA的制备

基因功能研究的一个强大的方法是microinject在体外转录的斑马鱼胚胎的上限RNA。有回报上限的RNA的行为同样由于存在第模拟体内发现的真核细胞的mRNA。斑马鱼的研究人员经常利用这种方法，他们感兴趣的基因过表达或misexpress。在这个演示中，我们将microinject EGFP标记的成绩单和使用作为一个成功的注射可见读数的活全胚胎GFP的表达。

1. 执行体外转录反应第RNA对您感兴趣的成绩单。在我们的实验室中，我们经常插入一个pCS2 +矢量利益的cDNA，并执行在体外大量使用mMessage mMachine SP6套件（Ambion公司，股份有限公司，AM1340）的上限核糖核酸的合成反应。
2. 纯化的RNA样品通过的RNeasy试剂​​盒（QIAGEN公司，74104）运行它，或由苯酚：氯仿抽提，异丙醇沉淀。
3. 仔细确定，直到准备使用于-80 º C浓度的RNA制备和存储。
4. 注射当天，解冻的RNA样品，涡掉以轻心，并简要降速。
5. 准备工作液与无菌水，终浓度为0.025 - 0.050％酚红（Sigma - Aldrich公司有限公司，P0290）。酚红作为一个可见的溶液注射到胚胎标记。在这篇文章中，我们将准备与0.050％酚红的100毫微克/ UL EGFP的表达的工作解决方案。
6. 冰和返回RNA的股票保持至-80 ° C的工作示例
7. 继续执行第4部分准备就绪后，注入样品。

第3部分：吗啉的制备

吗啉反义寡核苷酸被广泛用于修改有针对性的蛋白质通过阻断翻译或修改前体mRNA剪接^2,3基因的表达。在斑马鱼Morpholinos撞倒基因的功能，作为一个强大的反向遗传学工具。在这篇文章中，我们将microinject一个吗啉代寡核苷酸有针对性地PKD2翻译起始位点（5' - AGGACGAACGCGACTGGAGCTCATC - 3'）。基于先前建立的工作，我们预计注入的胚胎表型模仿 PKD2突变^的鱼4。

1. 我们经常为了一个吗啉代寡核苷酸300 nmol专门设计一个基因从基因工具的兴趣，LLC（Philomath，或）。
2. 添加100微升无菌水，使一个3毫米的原液。分装的解决方案，并在-20 ° C储存，直到准备使用。
3. 注射当天，热啉的解决方案在65 ° C为5分钟。立即对齐冰酷和自旋简要。这一步变性任何寡核苷酸二级结构，并确保该解决方案是完全溶解。
4. 准备稀释在无菌水和终浓度为0.025啉解决方案的一个可行的解决方案 - 0.050％酚红。在这个演示中，我们将准备与0.050％酚红的0.50毫米PKD2啉的工作解决方案。
5. 保持在室温下工作的解决方案。
6. 继续执行第4部分准备注入样品时.----

第4部分：与你的工作解决方案灌装的微量

1. 切一个与微管钳的远端提示或外科razorblade创建一个开放，这只是在50X放大倍率（尼康仪器公司，SM2645）在解剖显微镜下可见。
2. 放置2 UL你的工作解决方案，下降到盖玻片。
3. 将微量的背面装有皮下注射针管和轻微淹没远端尖端的微到您的工作液下降至5 mL注射器。小心不要打破的微尖。
4. 拉动注射器的柱塞，通过末端的微虹吸式的工作方案。

第5部分：校准微量注射量

1. 将下降一个千分尺幻灯片矿物油（美国生物分析公司，AB00921 - 00025）（FISHER，12 - 561 - SM1）。
2. 打开电源和空气供应的压力脉冲的微量进样装置（世界精密仪器公司，PV830）。
3. 将微量微量微量进样装置的持有人。微量进样器和放电按脚踏激活监管的压力。
4. 解剖显微镜下，测试使用微量进样器放置到你的工作解决方案微米油下降的注射量。测量液滴的直径，因为它作为一个石油顶部的球体浮。
5. 调整的时间和仔细校准你的注射量，注射压力。这一步艾滋病的显微注射实验的可重复性。在这个演示中，所有microinjections会做一个直径0.15毫米（约1.76 NL量）下降。
6. 一旦你的注射量已经校准，使用微量进样器上的“保留”旋钮，以防止回填和泄漏的微。

第6部分：准备受精卵显微注射的斑马鱼胚胎

1. 斑马鱼将在每天早上的头几个小时随机交配。收集1 - 细胞阶段的胚胎和它们放置在1X E3的介质。
2. 使用3毫升转移的吸管（碧迪医学实验，357524），安排沿显微注射室板的楔形槽胚胎。
3. 取出介质，使胚胎浅淹没，不淹。这一步，​​艾滋病，以及由微绒毛的渗透，解决胚胎槽的底部。

第7部分：通过蛋壳显微注射

1. 操作与微管，使1 - 细胞期胚胎的细胞质解剖显微镜下可见的胚胎。小心不要打破的微尖。
2. 渗透与微绒毛膜，然后蛋黄，以注入胚胎。在这个演示中，我们将首次直接进入下面的单元格蛋黄显微注射，使细胞质的流动和扩散，使进入细胞的工作液。这种流动是可见的，由于加入到工作液的酚红。
3. 我们也将展示直接注射到细胞的细胞质。直接进入细胞内显微注射的是更强大，但耗时适当的胚胎的方向和显微注射技术是必需的。由于细胞膜比蛋黄膜更严格，它往往是快速进入蛋黄的微量达到细胞质。对槽的底部定向动物极和稳定手中的工作，可能有助于在这种注射方法。
4. 显微注射后，放入一个培养皿的胚胎带有E3介质，并培育他们在28.5 ° C的正常发展。
5. 在接下来的几个小时，天的胚胎发育观察您感兴趣的表型的胚胎。

第8部分：代表结果

EGFP的mRNA表达：要验证显微注射的成功，我们会密切监察在盾构阶段（〜6 HPF） 开始，在体内的全胚胎荧光显微镜的发展胚胎中的表达绿色荧光蛋白（莱卡微系统公司， MZFLIII）。构建的表达在胚胎发育的早期事件，是最强大的的，往往会在发展过程中减少注入上限RNA逐渐退化，取决于所表达的蛋白质的稳定性。

PKD2翻译阻断啉：根据先前公布的结果，我们预计PKD2 morphants模仿背侧体轴曲率PKD2突变的斑马鱼和目前的肾囊肿，如发现在大约2 - ³ DPF 4。

图1：注射EGFP的mRNA和PKD2八月啉代表性的结果。 （一）制表胚胎显微注射的1 -细胞阶段与0.17 EGFP的表达吴，并在1 DPF可视化在体内GFP的表达。 （B，C）制表胚胎显微注射的1 -细胞期在0.50毫米〜1.7 NL一个PKD2翻译阻塞啉和背身体曲率拿下4 DPF。

讨论

微量注射到斑马鱼的胚胎是一个探索发展的一个特定基因的作用以及建立和强大的技术。应用范围包括过度表达，错误表达，和您的利益，以及多个基因之间的互作分析的基因敲除实验。微量注射在斑马鱼已被广泛用于产生转基因动物，和映射^在 5,6,7,8,9囊胚早期胚胎细胞的命运。此外，这项技术的应用作为一个细胞移植^方法 10种系嵌合体的关键一步。

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