Микроинъекция мРНК и Олигонуклеотиды морфолино антисмысловых в данио рерио эмбрионов.

Резюме

Микроинъекция является устоявшейся и эффективным методом для введения чужеродных веществ в оплодотворенных эмбрионов данио. Здесь мы демонстрируем надежной техники микроинъекции для выполнения мРНК гиперэкспрессия и морфолино олигонуклеотидных гена нокдаун исследований в данио.

Аннотация

Важным инструментом для исследования роли генов в процессе развития является способность выполнять гена нокдаун, гиперэкспрессия и misexpression исследований. В данио (

протокол

Часть 1: Подготовка микропипетки, и плиты микроинъекции камеры

1. Изготовление микропипетки при нагревании и потянув боросиликатного стекла капилляров (World Precision Instruments, Inc, 1B100-4) в устройстве микропипетки съемник (Саттер инструменты Inc, Flaming / коричневый Р-97). Хранить в чашку Петри на вершине небольшого количества глины или липкой лентой.
2. Залить 1,5% агарозы (American Bioanlytical, Inc AB00972-00500) в 1x E3 пластин среду формованные с клиновидным впадин, которые будут служить простой метод для проведения эмбрионы во время инъекции (как описано в "данио рерио книга") ^1. Пусть пластины агара камеры укрепить, прежде чем использовать и хранить при температуре 4 º С.

Часть 2: Подготовка РНК

Один мощный подход для изучения функций генов является microinject в пробирке транскрипции РНК ограничен в данио эмбрионов. Capped РНК ведет себя подобно эукариотических мРНК содержится в естественных условиях из-за присутствия CAP аналог. Данио рерио ученые обычно используют этот метод для гиперэкспрессией или misexpress их гена. В этой демонстрации, мы будем microinject EGFP с метками стенограммы и использования живых целого эмбриона GFP-выражение, как видимый индикатор для успешных инъекций.

1. Выполните в пробирке транскрипции РНК CAP реакции на стенограмму интерес. В нашей лаборатории мы обычно вставки кДНК интерес в вектор pCS2 + и выполняют в пробирке реакции синтеза больших количеств ограничен РНК с использованием mMessage mMachine SP6 комплект (Амбион, Inc AM1340).
2. Очищение образца РНК, запустив его через RNeasy комплект Mini (Qiagen, Inc, 74104), или фенол: хлороформ добычи и изопропанола осадков.
3. Тщательно определения концентрации РНК подготовки и хранить при температуре -80 ° С до готовности к использованию.
4. В день инъекции, оттепель образцов РНК, вихревые легко и со спином вниз кратко.
5. Подготовка рабочего раствора стерильной водой и конечной концентрации 0,025 - 0,050% фенола красного (Sigma-Aldrich Ко, P0290). Фенол красный служит видимым маркером для инъекции раствора в зародыше. В этой статье мы будем готовить рабочий раствор 100 нг / мкл EGFP мРНК с 0,050% фенола красного цвета.
6. Продолжайте работать образца на льду и доходности акций РНК до -80 ° C.
7. Переходите к Части 4, когда готовы внедрить этот образец.

Часть 3: Подготовка морфолино

Морфолино антисмысловых олигонуклеотидов широко используется для изменения экспрессии генов, блокируя перевод целевого белка или путем изменения пре-мРНК сплайсинга ^2,3. Morpholinos в данио служить мощным инструментом обратной генетики сбить функции гена. В этой статье мы microinject морфолино олиго направлены на поступательное сайт инициирования PKD2 (5'-AGGACGAACGCGACTGGAGCTCATC-3 '). На основе ранее созданных работ, мы ожидаем, что инъекции эмбрионов фенотипически имитировать PKD2 мутант ⁴ рыбы.

1. Мы регулярно порядка 300 нмоль морфолино олиго специально разработан для интересующего гена из генов Tools, LLC (Филомат, ИЛИ).
2. Добавить 100 мкл стерильной воды, чтобы сделать 3 мМ маточного раствора. Алиготе решение и хранить при температуре -20 ° С до готовности к использованию.
3. В день инъекции, тепловые решение морфолино при 65 ° С в течение 5 минут. Привязка прохладно на льду сразу же и спина кратко. Этот шаг денатурирует каких-либо второстепенных структур в олиго и гарантирует, что решение полностью растворяются.
4. Подготовка рабочего раствора путем разбавления раствора морфолино в стерильной воде и конечной концентрации 0,025 - 0,050% фенола красного цвета. В этой демонстрации, мы будем готовить рабочий раствор 0,50 мм PKD2 морфолино с 0,050% фенола красного цвета.
5. Держите рабочего раствора при комнатной температуре.
6. Переходите к Части 4, когда готовы внедрить этот образец .----

Часть 4: Заполнение микропипетки с вашим рабочим раствором

1. Вырезать дистального кончика микропипетки щипцами или хирургическое лезвие бритвы, чтобы создать открытие это только видимые под микроскопом рассекает (Nikon Instruments, Inc, SM2645) на 50X увеличением.
2. Место 2 мкл вашего рабочего раствора, как падение на покровное.
3. Прикрепите заднюю микропипетки на 5 мл шприца оснащен трубкой с иглой подкожно и слегка погрузиться дистального кончика микропипетки в ваши капли рабочего раствора. Будьте осторожны, чтобы не сломать кончика микропипетки.
4. Сифон рабочего раствора через дистального конца микропипетки, потянув поршень шприца.

Часть 5: Калибровка объема микропипетки инъекции

1. Место каплю минерального масла (American Биоаналитическая, Inc AB00921-00025) на микрометр слайд (FiШер, 12-561-SM1).
2. Включите питание и подачу воздуха к давлению импульсного микро инжектор аппарата (Всемирный точных приборов Inc, PV830).
3. Прикрепите к микропипетки микропипетки обладатель аппарата микро форсунки. Микро форсунки давление регулируется и сбросов приводятся в действие нажатием педали.
4. Под микроскопом вскрытие, тест объемом впрыска с помощью микро-форсунка на место падения вашего рабочего раствора на микрометр нефти. Измерьте диаметр капли, как он плавает, как сфера поверх масла.
5. Отрегулируйте продолжительность и давление инъекции тщательно выверять вашу объема инъекции. Этот шаг помогает в воспроизводимости микроинъекции эксперимента. В этой демонстрации все микроинъекций будет сделано с каплей диаметром 0,15 мм (примерно 1,76 нл по объему).
6. Как только Ваш объемом впрыска был откалиброван, используйте "Hold" ручку на микро-форсунка для предотвращения обратной засыпки и утечки микропипетки.

Часть 6: Подготовка оплодотворенных эмбрионов данио для микроинъекции

1. Данио рерио будет случайным образом мат в первые несколько часов каждое утро. Сбор эмбрионов на 1-клеточной стадии и поместите их в 1x E3 среды.
2. Использование 3 мл передачи пипетки (Becton Dickinson Лабораторное оборудование, 357524), организовать эмбрионы вместе клиновидных корыта в пластинах микроинъекции камеры.
3. Удалить среду так, чтобы эмбрионы неглубоко погруженные и не затопило. Этот шаг помогает в решении эмбрионов на дно желоба, а также в проникновении хориона по микропипетки.

Часть 7: Микроинъекция через хориона

1. Манипулирование эмбрионов с микропипетки, так что цитоплазма 1-клеточной стадии эмбриона видимые под микроскопом вскрытии. Будьте осторожны, чтобы не сломать кончика микропипетки.
2. Проникнуть хориона, а затем желток с микропипетки для того, чтобы ввести в эмбрион. В этой демонстрации, мы будем первые microinjecting в желтке непосредственно под клетку, и позволяют цитоплазматических потока и диффузии для приведения рабочего раствора в клетку. Этот поток видна из-за фенола красного добавлены в рабочий раствор.
3. Мы также продемонстрирует непосредственным впрыском в цитоплазме клетки. Прямая микроинъекции в клетку является более надежной, но трудоемким, поскольку правильную ориентацию эмбриона и микроинъекции техника не требуется. Как клеточной мембраны является более строгим, чем мембраны желтком, часто быстрее ввести микропипетки через желток достичь цитоплазме клетки. Ориентируемся животных полюс в нижней части желоба и работы с твердой рукой может помочь в таком способе введения.
4. После микроинъекции, место эмбрионов в чашке Петри с E3 средних и инкубировать их в 28,5 ° С для нормального развития.
5. В течение нескольких последующих часов и дней развития эмбриона, наблюдать эмбрионов для вашего фенотипы интерес.

Часть 8: Представитель результаты

EGFP мРНК гиперэкспрессия: Чтобы убедиться в успехе микроинъекции, мы будем контролировать экспрессию GFP в развивающихся эмбрионов, начиная с этапа щита (~ 6 HPF) путем в естественных условиях целого эмбриона флуоресцентной микроскопии (Leica Microsystems Gmbh, MZFLIII). Выражение построить наиболее сильным в начале событий эмбрионального развития и часто уменьшаются в процессе разработки, как вводили ограничен РНК постепенно разрушается и зависит от стабильности выразил белка.

PKD2 поступательного блокировки морфолино: на основе ранее опубликованных результатов, мы ожидаем, PKD2 morphants имитировать спинной кривизны оси тела, которые содержатся в PKD2 мутанта данио и настоящего кист почек примерно в 2 - 3 DPF ^4.

Рисунок 1: представитель результате микроинъекции EGFP мРНК и PKD2 августа морфолино. () TAB эмбрионов microinjected на 1-клеточной стадии с 0,17 нг EGFP мРНК и визуализируется на 1 денье для выражения в естественных условиях GFP. (Б, в) TAB эмбрионов microinjected на 1-клеточной стадии с ~ 1,7 п от PKD2 поступательного блокирование морфолино на 0,50 мм и забил на спинной кривизны тела в 4 денье.

Обсуждение

Микроинъекция в данио эмбрионов устоявшиеся и надежные методики изучения роли конкретного гена в развитии. Приложения включают гиперэкспрессия, misexpression и нокдаун анализы вашего интересующего гена, а также анализ эпистатических между несколькими генами. Микроинъекция в данио широко ?...

Материалы