静电纤维聚合物支架用于组织工程和细胞培养

摘要

静电聚合物组织工程和细胞培养的过程中，在这篇文章中解决。具体来说，静电photopatterning多聚合物静电额外的处理能力的光反应macromers描述。

摘要

作为组织工程领域的的发展，是一个巨大的需求，生产更合适的材料和加工技术，以解决更复杂的器官和组织的要求（如机械和血管）。静电是一种流行的技术来创造，模仿原生细胞外基质的结构和大小规模的纤维支架。这些纤维支架也有用的，因为细胞培养基质的纤维可以被用来直接细胞的行为，包括干细胞的分化（见广泛的审查由莫克

研究方案

答：单聚合物静电

1. 准备电的解决方案之前，在光引发剂0.5％的溶液，Irgacure 2959（I2959），去离子水溶解在37 ° C几天。这一步是没有必要的，如果光反应的聚合物不被使用。
2. 结合methacrylated透明质酸（梅阿，看到伯迪克合成等 ），聚（环氧乙烷）（PEO，900 kDa的），在去离子水I2959准备与终浓度为2％，3％梅阿的解决方案私立教育机构，和0.05 wt％的I2959。使用一个旋涡混合解决方案，直到它被清除。聚合物的类型和浓度，以及使用的溶剂可以修改的，这取决于所需的脚手架属性的步骤。
3. 转移到一个注射器的解决方案，并附加18号，6英寸长，钝端针到底。
4. 计划注射泵在1.2毫升/小时的速度弹出。插入设备的注射器和针头。
5. 将一个高压电源的接地导致的收集装置。为了收集随机分布的纤维使用一个平面的金属板，或使用〜10米/秒旋转的芯棒收集对齐纤维。将带正电的铅针。静电仪器的原理 ， 参见图1。
6. 调整针或收集装置，有两者之间的15厘米的距离。
7. 启动注射泵的流量。当流体可视化的针尖上，打开电源，22千伏的电压设置。
8. 收集完成后（从几分钟薄膜，较厚的垫长达24小时），删除从收集设备的支架，并存储在真空条件下过夜，以确保完全去除的溶剂。
9. 可视化的纤维形态，利用扫描电子显微镜（SEM），有代表性的支架对齐和不结盟的结构如图1所示。

注：样品流速，收集装置的距离，和电压依赖于聚合物和溶剂的组合，并为每个系统，通常是通过扫描电镜观测支架形态，必须优化。

B.光交联和Photopatterning

1. 从支架垫，切出5mm x 5mm的样品。
2. 交联准备通过配售每个支架上覆盖玻片陪衬，直接放在支架上光罩，用干净的玻片上覆盖长尾夹夹闭两端。注：四个样本，可一次完成，并没有一个模式的透明度，可用于交联，如果不想要一个模式。
3. 清除脚手架在氮气室成立。重要的是要保持氧气，它可以抑制交联的构造。
4. 放置支架安装在氮气室下〜10毫瓦/厘米² 365纳米的光，用5分钟的准直适配器。参见原理图如图 2 。
5. 删除每个支架，并在12孔板地点。
6. 添加到每口井，封口膜板式蒸发的水和地点，以防止在37 ° C 24小时2 mL去离子水。换水三次。
7. 光学显微镜下可视化孔形成（参见图2中的例子） 。现在准备使用的支架。

注：聚合物的种类很多，但是photopatterning只能用于光反应的聚合物，光交联是没有必要的。

C.双聚合物静电荧光纤维可视化

1. 准备在90％乙醇的私立教育机构（200 kDa的）5 wt％的解决方案。在搅拌700转50 ° C时至少2个小时之前，以静电。
2. PEO的解决方案转移到一个注射器和添加电液中的终浓度为10 mg / ml浓度的DAPI。用铝箔保护光注射器。
3. 准备除也为电液中25微米的终浓度添加methacryloxyethyl thiocarbamoyl罗丹明B（MeRho 683.24克/摩尔），在步骤A2相同的解决方案。用铝箔保护光注射器。
4. 小心地用透明胶带，以确保methacrylated盖玻片（见Khademhosseini等 。）芯棒表面。注：纤维将成为束缚methacrylated盖玻片。
5. 一个5毫米的长片硅胶管，带Luer锁附件注射器的一端连接和附加针的另一端。插入注射泵的注射器和针头通过孔的电风扇。重复与其他注射器和芯棒对面站点的电风扇。 fanners翻译的L芯棒ength和使用，以确保双方聚合物的平等分配造成脚手架。参见原理图如图 3 。
6. 在一个适当的按表1部分所述的调整参数。确保针尖芯棒为中心。
   
   表1。双聚合物静电参数
   

   注射器	电风扇针尖（厘米）	针尖芯棒（厘米）	流量（毫升/小时）	应用电压（kV）
   梅阿	6	15	1.2	22
   私立教育机构	6	10	1.2	15

   
   
7. 一旦一切都正确对齐，关灯和芯棒和注射器泵打开。取下注射器铝箔。当流体是两针的技巧上可见，同时打开电源插头在fanners。
8. 当收集完成后，关闭电源和芯棒和拔掉fanners。小心地取出使用刀片的盖玻片和磁带。
9. 可视化的纤维，使用配备过滤罗丹明和DAPI荧光显微镜。看到图3的例子。注：荧光纤维是最清楚，以查看时短一段时间（<3分钟）静电，但是，这个过程可以延长时间的无限量，以创造较厚的结构，尤其是不使用盖玻片， 。

D.在棚架的种子细胞

1. 将每个盖玻片连接到个人，以及一个适当大小的孔板与静电聚合物。注：与纤维细胞相互作用到methacrylated玻片上电，很容易可见。此外，MeRho可以再次用于光纤可视。
2. 孵育过夜，以确保完全去除溶剂和副产品的任何可能浸在PBS的棚架。
3. 从井中取出的PBS。
4. 消毒支架，放置在一个30分钟的层流罩下的杀菌灯。如果一个完整的支架正在播种，下一个30分钟的杀菌灯翻转的脚手架和地方。
5. 执行标准细胞培养，并准备在需要的细胞密度集中的细胞悬液（例如^，6000细胞-2厘米）。例如，使用22毫米x 22毫米盖玻片的细胞悬液100毫升。在孵化器中放置1小时。
6. 细胞培养基中添加适量的每口井。进入孵化器放置的支架。
7. 使用市售的活/死套件染色的细胞。注：如DAPI（细胞核）和荧光标记的鬼笔环肽（肌动蛋白压力纤维），其他类型的细胞染色，可用于可视化的细胞。
8. 可视化细胞和纤维用荧光显微镜配备过滤TRITC和FITC。参见图4的例子。

代表性的成果：

图1。不结盟脚手架形成（上）和对齐支架形成（底部）的设备安装示意图说明。示例扫描电子显微镜图像，每种类型棚架所示。比例尺=5μm的。请点击这里看到图1的放大版本。

图2。图案方法的原理。放置在光交联之间的光源光掩膜和支架，然后洗去未反应的聚合物所形成的模式。光罩和扫描电镜图像的孔隙的形成和冻干后支架。比例尺= 100微米。请点击这里看大图图2。

图3多聚合物静电设置和必要的加工参数的原理图，以及一个代表了两种纤维的人群（例如：红梅阿和蓝色PEO）混合物的荧光图像，同时静电，形成多聚合物支架。比例尺= 100微米。请点击这里 ，看到一个较大的version的图3。

图4。一个例子活/死人类间质干细胞和它们之间的相互作用与静电纤维染色的形象。比例尺= 100微米。图4看到一个更大的版本， 请点击这里。

讨论

静电是用来准备从聚合物纤维支架。 Photocrosslinkable支架的基础上被用来作为一个例证，在光线照射是需要交联透明质酸。随着反应macromers的使用，如梅阿，先前已证明增强细胞分布的通道被纳入棚架光交联过程中使用口罩，以形成宏观和微观多孔支架。此外，两个不同的聚合物，同时静电使用我们自定义的仪器。两种截然不同的纤维人口的存在，验证与荧光染料除了每个静电解决方案，后来用荧...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DAPI	Reagent	Invitrogen	D1306
I2959	Reagent	Ciba Specialty Chemicals
PEO 200 kDa		Polysciences, Inc.	17503
PEO 900 kDa	Reagent	Sigma-Aldrich	189456
Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B	Reagent	Polysciences, Inc.	23591-100	Prepare stock solution in DMSO
Live/Dead Stain Kit	Reagent	Invitrogen	L3224	Contains Calcein (stains live cells green) and ethidium homodime (stains red dead cells)
Syringe Pump	Equipment	KD Scientific	KDS100	Two are needed for dual polymer spinning
Power Source	Equipment	Gamma High Voltage	ES30P-5W	Two are needed for dual polymer spinning
Motor	Equipment	Triem Electric Motors, Inc	0132022-15	Must attach to a custom built mandrel
Tachometer	Equipment	Network Tool Warehouse	ESI-330	Use to monitor mandrel speed
Omnicure UV Spot Cure System with collimating adapter	Equipment	EXFO	S1000
Silicone Tubing	Equipment	McMaster-Carr	51135K151
Luer Lock Female Adapter	Equipment	McMaster-Carr	51525K293
Luer Lock Male Adapter	Equipment	McMaster-Carr	51525K143
Needles	Equipment	Fisher Scientific	14-825-16H
Coverslips	Equipment	Corning	2875-22