Eletrofiação Andaimes Polymer fibrosos para Engenharia de Tecidos e Cultura de Células

Resumo

O processo de eletrofiação polímeros para engenharia de tecidos e de cultura de células é abordada neste artigo. Especificamente, o electrospinning de macromers fotorreativas com capacidades de processamento adicional de photopatterning e multi-polímero eletrofiação é descrito.

Resumo

Como o campo da engenharia de tecidos evolui, há uma enorme demanda para a produção de materiais mais adequados e técnicas de processamento, a fim de atender aos requisitos (por exemplo, mecânica e vascularização) de órgãos e tecidos mais intrincados. Eletrofiação é uma técnica popular para criar andaimes fibroso que imitam a arquitetura ea escala de tamanho da matriz extracelular nativa. Estes andaimes fibroso também são úteis como substratos de cultura de células já que as fibras podem ser usadas para orientar o comportamento celular, incluindo a diferenciação de células-tronco (ver extensas revisões por Mauck

Protocolo

A. Único Polymer Electrospinning

1. Antes de preparar a solução de eletrofiação, faça uma solução 0,5% em peso do fotoiniciador, IRGACURE 2959 (I2959), em água deionizada, dissolvendo a 37 ° C por vários dias. Este passo não é necessário se um polímero fotorreativas não está sendo usado.
2. Combine ácido hialurônico methacrylated (MEHA, ver Burdick et al. Para a síntese), poli (óxido de etileno) (PEO, 900 kDa), e I2959 em água deionizada para preparar uma solução com uma concentração final de 2% em peso MEHA, 3% em peso PEO, e 0,05% em peso I2959. Use um vórtice para misturar a solução até que fique claro. O tipo de polímero e concentração, bem como o solvente usado pode ser modificado nesta etapa, dependendo das propriedades desejadas andaime.
3. Transferir a solução para uma seringa e anexar uma calibre 18, seis polegadas de comprimento, agulha de ponta cega até o fim.
4. Bomba de programa de uma seringa para ejetar a uma taxa de 1,2 mL / hr. Inserir a seringa ea agulha para o dispositivo.
5. Anexar a liderança fundamentada de uma fonte de alta tensão para o aparelho de coleta. Para coletar aleatoriamente distribuídos fibras usar uma placa de metal lisa, ou usar um mandril girando a ~ 10 m / s para coletar fibras alinhadas. Anexar a liderança com carga positiva para a agulha. Veja a Figura 1 para um esquema do aparelho eletrofiação.
6. Ajustar a agulha ou dispositivo de recolha, de modo que há uma distância de 15 cm entre os dois.
7. Iniciar o fluxo da bomba de seringa. Quando o fluido é visualizada na ponta da agulha, ligue a fonte de alimentação e definir a tensão de 22 kV.
8. Após a coleta é completo (a partir de vários minutos para filmes finos, com até 24 horas para um mais grosso tapete), remova o andaime do aparelho de coleta e armazená-lo sob vácuo durante a noite para garantir a remoção completa do solvente.
9. Visualizar a morfologia da fibra através de microscopia eletrônica de varredura (MEV), representante de um andaime é mostrado na Figura 1 para ambas as estruturas alinhadas e não-alinhados.

Nota: O caudal da amostra, a distância para o dispositivo de recolha e de tensão dependem da combinação de polímero e solvente e devem ser otimizados para cada sistema, normalmente por meio da observação da morfologia andaime com SEM.

B. Photocrosslinking e Photopatterning

1. Cortar amostras 5 milímetros X 5mm do tapete andaime.
2. Prepare-se para crosslinking, colocando cada um andaime em uma folha de lâmina de vidro coberta, colocando a fotomáscara diretamente no cadafalso, cobrindo com uma lâmina de vidro limpa e clipping ambas as extremidades com grampos da pasta. Nota: quatro amostras pode ser feito de uma só vez, e uma transparência sem um padrão pode ser usado para crosslinking se um padrão não é desejada.
3. Purge andaime montado em uma câmara de nitrogênio. É importante manter a construir livre de oxigênio, que pode inibir a reticulação.
4. Configuração local andaime na câmara de nitrogênio em ~ 10 mW / cm ² luz de 365 nm com um adaptador de colimação por 5 minutos. Ver esquema na Figura 2.
5. Retire cada scaffold e coloque em um prato de 12 poços.
6. Adicionar 2 mL de água deionizada em cada poço, a placa de parafilme para evitar a evaporação da água e coloque a 37 ° C por 24 horas. Troque a água três vezes.
7. Visualize formação de poros em microscópio de luz (ver exemplo na Figura 2). Os andaimes estão agora prontos para uso.

Nota: Photocrosslinking não é necessário para muitos tipos de polímeros, no entanto photopatterning só pode ser usado com polímeros fotorreativas.

C. Dupla Polymer Electrospinning com Fluorescente Visualization Fiber

1. Prepare uma solução 5% em peso de PEO (200 kDa) em etanol 90%. Mexa a 700 rpm a 50 ° C por pelo menos 2 horas antes da eletrofiação.
2. Transferir a solução PEO a uma seringa e adicionar DAPI para uma concentração final de 10 concentração mg / mL na solução eletrofiação. Enrole a seringa na folha de alumínio para proteger da luz.
3. Prepare a mesma solução descrita na etapa A2, com exceção também adicionar methacryloxyethyl thiocarbamoyl rodamina B (MeRho, 683,24 g / mol) para uma concentração final de 25 mM na solução eletrofiação. Enrole a seringa na folha de alumínio para proteger da luz.
4. Com cuidado, use fita adesiva para garantir lamínulas de vidro methacrylated (ver Khademhosseini et al.) Para a superfície do mandril. Nota: as fibras ficarão amarrados em lamínulas de vidro methacrylated.
5. Conecte uma extremidade de um pedaço 5 mm de comprimento de tubo de silicone com anexos luer lock para uma das seringas e anexar a outra extremidade a uma agulha. Inserir a seringa na bomba de seringa e colocar a agulha através do orifício na fazendeiro. Repita com a outra seringa e fazendeiro no lado oposto do mandril. Os lavradores traduzir o llength do mandril e são usados ​​para garantir uma distribuição igual dos dois polímeros no andaime resultante. Ver esquema na Figura 3.
6. Ajustar os parâmetros descritos na secção A forma adequada de acordo com a Tabela 1. Garantir que as pontas de agulha são centradas no mandril.
   
   Tabela 1. Dupla Polymer Parâmetros Electrospinning
   

   Seringa	Fazendeiro a ponta da agulha (cm)	Dica agulha para Mandril (cm)	Vazão (mL / hr)	Tensão aplicada (kV)
   MEHA	6	15	1,2	22
   PEO	6	10	1,2	15

   
   
7. Depois que tudo estiver alinhado corretamente, desligue as luzes e ligar o mandril e as bombas de seringa. Remova o papel alumínio do seringas. Quando o fluido é visível nas pontas de ambas as agulhas, simultaneamente ligar as fontes de alimentação e conecte os fazendeiros.
8. Quando a coleta for concluída, desligue a fontes de alimentação e desconecte o mandril e lavradores. Remova cuidadosamente as lamelas e fita usando uma lâmina de barbear.
9. Visualize as fibras utilizando um microscópio de fluorescência equipado com filtros para rodamina e DAPI. Veja o exemplo na Figura 3. Nota: fibras fluorescentes são mais claros para ver quando electrospun por curtos períodos de tempo (<3 minutos), no entanto, este processo pode ser prorrogado por uma quantidade ilimitada de tempo para criar construções mais espesso, especialmente sem o uso do lamínulas de vidro .

Células Seeding D. em Andaimes

1. Coloque cada lamela com electrospun polímero anexado em um indivíduo bem de uma placa de tamanho adequado também. Nota: interações celulares com as fibras são facilmente visíveis por eletrofiação em lamínulas de vidro methacrylated. Além disso, MeRho pode ser novamente utilizado para a visualização de fibra.
2. Incubar os andaimes em PBS durante a noite para garantir a remoção completa do solvente e qualquer lixiviável possíveis subprodutos.
3. Remover o PBS dos poços.
4. Para esterilizar os andaimes, colocá-los sob uma lâmpada germicida de uma capela de fluxo laminar por 30 minutos. Se um andaime completo está sendo semeada, flip do andaime e coloque sob uma lâmpada germicida por mais 30 minutos.
5. Realizar cultura de células padrão e preparar uma suspensão de células concentradas na densidade de célula desejada (por exemplo, 6.000 células cm ^-2). Por exemplo, usar um 100 mL de suspensão celular por um 22 mm X 22 mm lamela. Lugar na incubadora por 1 hora.
6. Adicionar a quantidade adequada de meios de cultura de células em cada poço. Coloque o andaimes de volta para a incubadora.
7. Mancha as células usando um kit comercialmente disponível Live / Dead. Nota: outros tipos de coloração de células, tais como DAPI (núcleos celulares) e phalloidin fluorescente etiquetado (fibras de actina estresse) pode ser aplicado para visualizar as células.
8. Visualize as células e fibras usando um microscópio de fluorescência equipado com filtros para TRITC e FITC. Veja o exemplo na Figura 4.

Resultados representativos:

Figura 1. Esquemático ilustrando a configuração do dispositivo para não-alinhados formação andaime (superior) e formação alinhada andaime (parte inferior). Exemplo, imagens de microscopia eletrônica de varredura de cada tipo de andaime são mostrados. Barra de escala = 5m. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura 1.

Figura 2. Esquemática do método de padronização. Padrões são formadas pela colocação de um fotomáscara entre a fonte de luz e andaimes durante photocrosslinking e depois lavar polímero não reagiu. Fotomáscara e SEM imagem de andaimes após a formação dos poros e liofilização. Barra de escala = 100 mm. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura 2.

Figura 3 Esquema da configuração electrospinning multi-polímero e parâmetros de processamento necessários, bem como uma imagem representativa fluorescentes de uma mistura de duas populações de fibra (exemplo: vermelho e azul MEHA PEO). Qual foram simultaneamente electrospun para formar um andaime multi-polímero . Barra de escala = 100 mm. Por favor, clique aqui para ver um maior version da figura 3.

Figura 4. Um exemplo de imagem coloração Live / Dead of células-tronco mesenquimais e suas interações com as fibras electrospun. Barra de escala = 100 mm. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura 4.

Discussão

Eletrofiação foi usado para preparar andaimes fibroso a partir de polímeros. Photocrosslinkable andaimes à base de ácido hialurônico foram usadas como um exemplo ilustrativo, onde a exposição à luz é necessário para a reticulação. Com o uso de macromers reativa, como MEHA, canais que já demonstrou melhor distribuição celular foram incorporados ao andaimes com o uso de uma máscara durante photocrosslinking andaimes para formar macro e micro-porosa. Além disso, dois polímeros distintos foram simultaneam...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DAPI	Reagent	Invitrogen	D1306
I2959	Reagent	Ciba Specialty Chemicals
PEO 200 kDa		Polysciences, Inc.	17503
PEO 900 kDa	Reagent	Sigma-Aldrich	189456
Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B	Reagent	Polysciences, Inc.	23591-100	Prepare stock solution in DMSO
Live/Dead Stain Kit	Reagent	Invitrogen	L3224	Contains Calcein (stains live cells green) and ethidium homodime (stains red dead cells)
Syringe Pump	Equipment	KD Scientific	KDS100	Two are needed for dual polymer spinning
Power Source	Equipment	Gamma High Voltage	ES30P-5W	Two are needed for dual polymer spinning
Motor	Equipment	Triem Electric Motors, Inc	0132022-15	Must attach to a custom built mandrel
Tachometer	Equipment	Network Tool Warehouse	ESI-330	Use to monitor mandrel speed
Omnicure UV Spot Cure System with collimating adapter	Equipment	EXFO	S1000
Silicone Tubing	Equipment	McMaster-Carr	51135K151
Luer Lock Female Adapter	Equipment	McMaster-Carr	51525K293
Luer Lock Male Adapter	Equipment	McMaster-Carr	51525K143
Needles	Equipment	Fisher Scientific	14-825-16H
Coverslips	Equipment	Corning	2875-22