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Method Article
我们证明我们的方法来寻找潜在发育调控基因的增强子元件和评估它们的功能,通过镶嵌的斑马鱼转基因。
人类基因组序列的完成,以及其他许多物种,突出了把特定功能的非编码序列的挑战。由非编码的基因组的一部分进行的一个突出功能是调节基因的转录;但是,有没有有效的方法来大致预测的主要DNA序列的顺式调控元件。我们已经开发出一种高效的协议功能评估潜在的顺式调控,通过斑马鱼转基因的元素。我们的方法提供了发育的重要基因的细胞培养为基础的技术,显着的优势,因为它提供信息的空间和时间的基因调控。相反,它是更快和更昂贵的比类似的实验,在转基因小鼠,我们经常将其应用到人类基因组序列。在这里,我们证明我们的方法来测试序列克隆序列的养护和我们的协议的基础上,显微注射到斑马鱼的胚胎中选择元素。
1。选型和测试的保守序列的克隆
2。斑马鱼的胚胎显微注射马赛克转基因分析
组件 | |
转座子质粒股票(125ng/μl) | 加入1μl |
转座子RNA股票(175ng/μl) | 加入1μl |
酚红股(H 2 O 2%) | 0.5μL |
核糖核酸酶自由水 | 2.5μl |
3。马赛克表达模式分析
4。结果
我们看到一个宽Variety模式和表达水平,取决于被分析的增强子元件。我们通常是在非常的组织特异性表达模式感兴趣,而且往往集中在骨架基因表达。往往集中在骨架基因表达。图2显示了马赛克表达模式与调节软骨和骨中的表达增强剂的例子,我们观察到,在我们注射的胚胎。最后,测试序列的很大一部分不规范组织的具体体现。对于这些,我们最常看到的非常小的荧光,也许数每胚胎细胞散。减的时候,我们可能会看到荧光,但只有在两种常见的部位为异位表达,表皮和骨骼肌肉(图3)。
图2。在注射胚胎中观察到的软骨和骨的表达模式的例子。
图3。有增强基因表达调控的相对位置之间的关联度不大。一个测试序列的很大一部分不规范的组织特异性表达。这些通常只有很少的荧光,或可能有两个常见的部位为异位表达:表皮和骨骼肌。 (上)明视图像( 下 )GFP的荧光图像。
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我们已经证明,在我们的实验室用于潜在的增强剂使用斑马鱼转基因的高效分析方法。大多数情况下,我们使用这种方法,寻找与人类基因相关的组织特异性的增强剂。尽管缺乏明显的序列同源性之间的人类和鱼类非编码序列,我们发现,这种方法通常是在成功地确定我们感兴趣的基因的增强剂。成功的关键因素,正在编制的质粒DNA和RNA的转座护理,注射和检查每个构造足够数量的胚胎。转基因?...
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我们感谢女士出色的鱼牧保罗伊,史蒂夫Ekker pDB600质粒礼物。这些研究是由来自NHGRI批到SF。
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Name | Company | Catalog Number | Comments |
Takara LA Taq | Takara Bio Inc | RR02M | |
pCR8/GW/TOPO TA Cloning Kit | Invitrogen | K2500-20 | |
Gateway LR Clonase II enzyme Mix | Invitrogen | 11791-100 | |
Library efficiency competent cells DH5α | Invitrogen | 12535-019 | |
Library efficiency competent cells DB3.1 | Invitrogen | 11782-018 | |
mMESSAGE mMACHINE Kit | Ambion | AM1340 | |
HiSpeed Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12643 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments, Inc. | SYS-PV820 |
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