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Method Article
我々は、分化段階の遺伝子から潜在的なエンハンサー要素を発見し、モザイクのゼブラフィッシュのトランスジェネシスを通じてその機能を評価するために我々のアプローチを示しています。
ヒトゲノム配列の完成は、他の多くの種のそれとともに、非コード配列に特定の機能をascribingの課題を浮き彫りにしました。ゲノムの非コード化割合で実施つの著名な機能は、遺伝子の転写を調節することですが、広く主要なDNA配列からのシス調節エレメントを予測する有効な方法はありません。我々は機能的にはゼブラフィッシュの遺伝子導入を通じて、潜在的なシス調節エレメントを評価するための効率的なプロトコルを開発した。それは空間的、時間的な遺伝子調節に関する情報を提供するため、我々のアプローチは、発達の重要な遺伝子の細胞培養ベースの技術上の重要な利点があります。逆に、それはより速く、より安価なトランスジェニックマウスで同様の実験よりも、我々は日常的に人間のゲノムから単離されたシーケンスに適用します。ここでは、クローニングシーケンスのシーケンスの保全と我々のプロトコルに基づいており、ゼブラフィッシュ胚にそれらをマイクロインジェクションをテストするための要素を選択するために我々のアプローチを示しています。
1。選択してテストするための保存された配列のクローニング
2。モザイクトランスジェニック解析のためのゼブラフィッシュ胚のマイクロインジェクション
コンポーネント | |
トランスポゾンプラスミド株式(125ng/μl) | 1μlの |
トランスポゼースRNA株式(175ng/μl) | 1μlの |
フェノールレッドの株式(H 2 Oで2%) | 0.5μl |
RNaseフリーの水 | 2.5μl |
3。モザイクの発現パターンの解析
4。結果
我々は広いvを参照してください分析中のエンハンサー要素に応じてパターンと発現のレベルのariety、。我々は通常、非常に組織特異的発現パターンに興味がある、と多くの場合、スケルトンに発現する遺伝子に注目しています。そして多くの場合、スケルトンに発現する遺伝子に注目しています。図2は、我々は軟骨と骨での発現を調節するエンハンサーと、私たちの注入胚で観察されているモザイクの発現パターンの例を示します。最後に、テストシーケンスのかなりの部分は、組織特異的発現を調節しないでください。これらの場合、我々は、ほとんどの場合、おそらく非常に少ない蛍光、胚あたり散在セルを参照してください。あまり、我々は、しかし唯一の異所性発現、表皮と骨格筋(図3)の2つの一般的なサイトでは、蛍光表示される場合があります。
図2。注入胚で観察される軟骨と骨の発現パターンの例。
図3。遺伝子と発現調節にエンハンサーの相対的な位置の間にはほとんど相関関係があります。テストシーケンスのかなりの部分は、組織特異的発現を調節しないでください。これらは多くの場合、ほとんど蛍光を持っている、または異所性発現には2つの一般的なサイトがあります:表皮と骨格筋を。 ( トップ )明視野像( 下 )GFP蛍光像。
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我々は、ゼブラフィッシュ遺伝子組み換えを使用して潜在的なエンハンサーの効率的な分析のために我々の研究室で使用されるアプローチを示している。ほとんどの場合、我々は、ヒト遺伝子に関連付けられている組織特異的エンハンサーを探すためにこのアプローチを使用してください。人間と魚の非コード配列との間の時間の最も明白な配列相同性の欠如にもかかわらず、我々はこのア?...
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我々はpDB600プラスミドの種類のプレゼントのために優れた魚の飼育用さんポーラロイ、そしてスティーブEkkerさんに感謝。これらの研究は、NHGRIからSFへの助成金によって賄われた。
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Name | Company | Catalog Number | Comments |
Takara LA Taq | Takara Bio Inc | RR02M | |
pCR8/GW/TOPO TA Cloning Kit | Invitrogen | K2500-20 | |
Gateway LR Clonase II enzyme Mix | Invitrogen | 11791-100 | |
Library efficiency competent cells DH5α | Invitrogen | 12535-019 | |
Library efficiency competent cells DB3.1 | Invitrogen | 11782-018 | |
mMESSAGE mMACHINE Kit | Ambion | AM1340 | |
HiSpeed Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12643 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments, Inc. | SYS-PV820 |
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