纯化 M。 magneticum应变AMB - 1磁小体相关蛋白MamAΔ41

摘要

妈妈是一个独特的磁相关蛋白被证明是参与磁激活。在这里，我们从目前的妈妈缺失突变体的净化协议（MamAΔ41） M。 magneticum AMB - 1。

摘要

磁细菌组成的水生微生物，能够沿着地磁场的方向不同群体。这种行为被认为是帮助他们寻找合适的环境

研究方案

1。 妈妈在大肠杆菌中的基因的克隆和表达大肠杆菌

突变基因mamAΔ41Magnetospirillum magneticum AMB - 1的基因组DNA扩增的聚合酶链反应（PCR）引物：5' - GCATTACGCATATGGACGACATCCGCCAGGTG 3'和5' - GCGCGGCAGCCATA - TGGCATACG - 3“ 。在扩增的DNA片段，NcoI网站介绍，在起始密码子ATG和终止密码子与ScoI网站所取代。片段，NcoI和SACI消化和克隆到pET52b（+），在各自的网站，从而引发pET52bMamAΔ41- AMB1。在这种构造，mamAΔ41基因融合在帧与10他在C -末端的标记。质粒电穿孔转化大肠杆菌菌株BL21。大肠杆菌菌株BL21窝藏pET52bMamAΔ41自动感应（15）生长在培养基中含有氨苄青霉素（50毫克/毫升）310 ° K时为3小时。然后转向培养温度从310 °到300 ° K的和额外的48小时保持在300 ° K。收获细胞，在5465克离心10分钟在277 ° K。 8升文化生产的60克湿细胞沉淀。

2。生物信息学的计算

分子量（MW），根据氨基酸序列预测蛋白质在280nm处1mg/1ml吸收计算，使用ProtParam服务器（http://www.expasy.ch/tools/protparam.html）。对于10His标签MamAΔ41兆瓦22529大（240个氨基酸）和MamAΔ41（His - tag的凝血酶搬迁后留下的9个氨基酸）兆瓦20596.5Da（187个氨基酸）。 1mg/1ml预测10His标签MamAΔ41的蛋白质在280nm处的吸收是0.595和MamAΔ41是0.579。此外，氨基酸序列不包含任何半胱氨酸残基。因此不需要在净化过程中，还原剂。

3。纯化的MamAΔ41

1. 储备液的制备，掂量出，并准备在下面的浓度（每200毫升）：咪唑（兆瓦228.2克/摩尔）4M的解决方案，氯化钠（MW 58.44克/摩尔）5M解决方案的Tris - HCl（分子量121.3克/摩尔）1M溶液，调节pH = 8。加入双蒸水（DDW）和混合使用的解决方案是一个旋涡，直到清晰。过滤0.22μm的过滤器，并保持在室温解决方案。
2. 准备和筛选股票的解决方案（表1）新鲜缓冲区。
3. 稀释和缓冲暂停一个1:2的比例，细胞克缓冲体积（ml）的细胞。
4. 每个细菌的DNA酶I（1毫克/毫升）10gr新增加入10μl为了打破样品中的DNA片段。添加为每个20gr细菌无EDTA的蛋白酶抑制剂的鸡尾酒1毫升。孵育20分钟冰。
5. 打乱了两个周期的法国记者在25,000 psi的细胞。与超声不同的是，法国媒体的目的是通过薄的喷嘴在高压下，迫使细胞在高音量（> 10毫升）细胞挤压。活塞应在冰上冷却10分钟前，其使用和装配，由于温度建设。
6. 转移到25毫升超速离心机管裂解细胞并平衡他们正是用缓冲液A（50毫克），直到样品达到管的脖子线。
7. 由1小时270,000克的超离心分离细胞碎片在277 ° K。
8. 准备一个自制的重力镍NTA柱（2.5厘米直径）4毫升镍NTA树脂，保留20％的乙醇，添加到列。完全让流体下降，然后用40毫升DDW，完全让流体下降。预平衡的树脂，用40毫升缓冲液A列
9. 应用重力镍NTA柱的超离心管中的可溶部分。让液体滴，收集流量（未结合的蛋白质），并保持在277K。
10. 通过使用一个小技巧废料颗粒颗粒样品，收集从超离心管。在50μL的5％β-巯基乙醇在2X SDS - PAGE样品缓冲液混合小费。
11. 100毫升缓冲B.清洗列，让液体滴，收集流通过，并保持在277K。
12. 准备15标记Eppendorf管（1.5毫升）。
13. 洗脱 - 关闭阀门，然后列列装载到缓冲液C1毫升; 3分钟流过阀门的开度和收集孵化。重复此步骤三次。
14. 洗脱其余悬浮于1 ml缓冲液C为增量和关闭阀门。
15. 测量的分数为280nm OD和评估的蛋白峰的位置;如果外径> 0.3，需要额外的样品。
16. SDS - PAGE分析收集馏分。应该进行这样的分析还与以下的样品，未结合的蛋白质流过，洗流和ULTRA离心沉淀样品。 10μL5％的2X SDS - PAGE样品缓冲液中的β-巯基乙醇混合从每个样品中加入10μl。负荷15％的SDS - PAGE的样品和运行在180伏特，45分钟。
17. 凝胶染色InstantBlue解决方案在15毫升，摇匀1小时。确保塑料盒覆盖避光。
18. 评估凝胶;如果蛋白表达的是高的和具体的指示带，合并选定的洗脱组分。
19. 为了消除10 - His - tag的，加入牛凝血酶（10单位/μL），加入10μl凝血酶每1毫克的蛋白质，根据制造商的建议合并范例。
20. 透析用于咪唑去除多余的，在离子交换绑定需要的水平，以减少NaCl浓度。透析，切成所需长度7 kD的分子量（MWCO）透析管切断。与DDW清洗，并在一端（或剪辑盖章）打了一个结。转移到合并后的蛋白质溶液袋，而在顶部留下一定的空间和遏止。
21. 淹没在4升的冷冻透析缓冲的透析管（缓冲液D）。搅拌的解决方案，在277 ° K.缓慢的夜晚
22. 透析管出烧杯，使一小截的蛋白质转移至50ml管。
23. 离子交换色谱：组装快速高效液相色谱仪（FPLC）预先包装MonoQ 4.6/100 PE列。 DDW过滤后的水用5倍柱体积（CV）的清洗之列。平衡5 CV的缓冲区D.列
24. 注射液循环与消化疾病周（两个循环卷）洗净，并用缓冲液D.重复负载在注射循环中的蛋白质。
25. 注入的蛋白质样品（流速为1毫升/分钟），并开始收集馏分无限蛋白进行SDS - PAGE检测。
26. 如果最初的蛋白量（步长3.23）大于注射循环，重复步骤3.25-3.26，不洗循环，直到整个样本列装载。
27. 为了消除无限的蛋白质，洗净后用缓冲液C CV 3列。
28. 60分钟线性梯度之间的缓冲区D，E（100％缓冲液E是渐变结束时），流速为1毫升/分钟（40 2000MM氯化钠洗脱的蛋白质，虽然可以在成本较高的流速更大的卷，但不太集中，蛋白质峰）。收集蛋白峰在280nm处的色谱图中出现的。
29. 清洁的预包装列，根据生产的建议。
30. SDS - PAGE分析收集馏分。这种分析应执行下列范例，无限的蛋白质流和蛋白峰流过。运行的SDS - PAGE和染色提步骤3.17-3.18。
31. 评估预测兆瓦凝胶对蛋白条带的存在，根据预染蛋白质标记。合并选定的洗脱组分包含有关的蛋白质。
32. 透析合并后的样品，以较低的体积排阻色谱所需的NaCl浓度。执行对缓冲区F.步骤3.21-3.23提到透析
33. 浓缩的蛋白质样品使用一个Vivaspin 15万截留分子量为8毫克/毫升表中的离心机，4000转。验证愿望浓度石英比色皿在280nm处测量外径。如果过于集中的蛋白质与缓冲F稀释和测量一次。
34. 装配尺寸排阻预填充柱，HiLoad 26/60 Superdex 200，上FPLC;用3 DDW过滤水的简历列。平衡列缓冲区楼与3简历
35. 其次是与相同体积的缓冲楼（两个循环卷）用5ml DDW清洗注射液循环的蛋白质样品注入回路中负载不超过4毫升。
36. 注入蛋白质样品（流速为3.5毫升/分钟），并开始收集蛋白峰分数，因为它们出现在280nm处的色谱。让缓冲区的流量，直至达到柱体积。
37. 如果最初的蛋白量（步长3.23）大于注射循环，重复步骤3.25-3.26，不洗循环，直到整个样本列装载。
38. 清洁的预包装列，根据生产的建议。
39. SDS - PAGE分析收集馏分。这种分析应与蛋白质峰的样品。运行的SDS - PAGE和染色提步骤3.17-3.18。
40. 评估凝胶：如果蛋白峰是具体的，在正确预测兆瓦的根据预染蛋白质标记和只有一个乐队可见合并选定的相关蛋白的洗脱组分。
41. 浓缩蛋白样品使用一个Vivaspin 15万截留分子量大于20毫克/毫升表离心机，4000转。验证欲望的浓度，在280nm处测量外径。纯化MamAΔ41，然后集中到26.5毫克/毫升的结晶。
<李>确认样品纯度和蛋白质鉴定，使用基质辅助激光解吸/电离（MALDI - TOF）。
42. 如果根据质谱仪和SDS - PAGE纯化的蛋白质，划分前显着的Eppendorf管集中MamAΔ41; 25 -50μL每个蛋白质。
43. 闪光冷冻在液氮和存储在193 ° K。

4。代表性的成果

当这个协议是正确完成的，应该得到高度纯化，大小一致和集中的蛋白质样品。这些蛋白质样品，然后准备进行结晶试验以及生化研究，如酶动力学，亲和力和更多。这里描述的是在净化协议的主要步骤代表性的结果。 NI - NTA亲和层析柱洗脱概况的SDS - PAGE分析，揭示过度表达蛋白可溶部分高度在适当兆瓦〜22kDa（图1）。这个SDS - PAGE分析也揭示最低，如果任何在流通过无界蛋白的蛋白质，洗流和超离心沉淀样品。如果适当的蛋白质的大型乐队出现在这些样品中，应该考虑错误的缓冲液配制，细胞破碎或文化的自动感应的条件和发展中的问题的问题。

离子交换层析是预制的，为了我们的理想蛋白质之间的单独其他大肠杆菌的蛋白质，势必镍树脂（由于静电相互作用或组氨酸/负富含氨基酸的蛋白质循环）和他的标签完整无缺的理想蛋白质。此列根据自己的亲和力增加NaCl浓度下正电的树脂分离蛋白。高度带负电荷的蛋白质会在较高浓度的NaCl洗脱放在附近，以温和的带负电荷的。本专栏的优点是高流速和有约束力的能力。离子交换色谱图（图2）揭示了3蛋白在NaCl浓度增加的人口之间的分离效果好。 SDS - PAGE分析，以确定每个人口兆瓦，隔离的理想之一，评估是否需要进一步的纯化步骤。第一人口MamAΔ41（〜20 kDa的），而第二人口MamAΔ41+他的标记（〜22kDa），这是没有牛凝血酶裂解和三分之一的人口是由于低浓度的SDS - PAGE检测不到。如果蛋白质峰没有分开，显然应该考虑错误的缓冲液配制或改变的NaCl梯度的斜率。

体积排阻色谱预制以之间的理想其他的大肠杆菌细胞，势必镍- NTA树脂，并没有在离子交换色谱分离蛋白的蛋白质分离。此柱分离蛋白质根据它们的大小。大的蛋白质会在较小的洗脱反对将在更大的卷洗脱小卷洗脱。柱色谱图（图3）揭示了一个理想的蛋白质作为一个主要的人口的分离效果好。一个兆瓦〜20 kDa的人口出现在适当的单体规模洗脱。 〜80 kDa的乐队（典型大肠杆菌的蛋白质结合Ni - NTA树脂的）的存在是在SDS - PAGE检测列装载之前和在此期间运行消失。由于本〜80 kDa的蛋白浓度低开始，它的人口不会出现在色谱由于其稀释和SDS - PAGE分析，以确定净化效率。我们建议主峰一个装载稀释和浓缩样品的SDS - PAGE，所以肯定可以决定在适当的兆瓦的纯蛋白质的存在。到了这个阶段，蛋白质纯化和其同质化应用MALDI - TOF评估。这分析显示，在20347达和其他10176大（图4）MW MW蛋白质。 〜10 kDa的蛋白〜20 kDa的蛋白一倍收取。 MamAΔ41预测兆瓦他的标签去除后留下的9个氨基酸为20596.5大。通过比较所获得的MALDI - TOF兆瓦，我们发现，他们是248大除。这种差异性可能导致的MALDI - TOF的测量误差和/或由于常见的退化的第一蛋氨酸和第二甘氨酸。总括而言，蛋白质是高度纯化的，可用于进一步的实验。

表1。缓冲液配方。

图1。代表SDS - PAGE分析NI - NTA柱纯化由右至左;的P -超速离心沉淀（3.11协议的步骤），W -洗（3.12协议的步骤），U -无限的蛋白质（3.10协议的步骤），E -五车道洗脱桑普LES（3.14协议的步骤），M - 蛋白标记（数字显示兆瓦）。箭头指示MamAΔ41。

图2。离子交换层析步骤 （一）离子交换（MonoQ柱）色谱分析 ;蓝色-吸收为280nm，蛋白浓度，红，绿NaCl浓度-收集分数的指示。 （b）代表SDS - PAGE分析的离子交换纯化步骤。从左至右依次为，M - 蛋白标记（数字表明MW），A6 - 第一峰的一小部分，A8的第二个高峰期的一小部分。

图3。体积排阻色谱分析 （一）排阻（Superdex 200柱）色谱图，蓝色-吸收为280nm，蛋白浓度，红色指示收集馏分。 （b）代表SDS - PAGE分析的体积排阻纯化步骤。从左至右依次为M蛋白标记（数字显示兆瓦），PreI预进样，A4 - 6组合的一小部分，从收集到的第一个高峰，A4 - 6D摊薄分数收集从高峰。

图4。基质辅助激光解吸/电离（MALDI - TOF）大规模纯化MamAΔ41频谱。矩阵是芥子酸（SA）。 MamAΔ4120347大，也显示一倍收取物种MamAΔ4110176大。

讨论

蛋白质纯化的生化或在任何蛋白质结构研究的主要步骤。由于每个蛋白质独特的是与自己的行为，需要定义其属性，并相应修改其净化。分析蛋白质的目标应该是，作为对使用净化生物信息学工具的第一步。它们被用来计算目标ISO电点，评估其需要减少/氧化环境，它需要特殊的离子/配体。我们的协议中有几个关键的修改反映了目标的独特性。这些修改包括缓冲区，工作温度和列调整。

材料

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
French Press	Equipment	Thermo scientific	FA-078A
Pressure cell	Equipment	Thermo scientific	FA-032
Ultra-centrifuge	Equipment	Sorvall	Discovery 90SE
Rottor	Equipment	Beckman	Ti60
Ultra-centrifuge tubes; PC-Bottle+Cap Assay 26.3ml	Equipment	Beckman	BC-355618
2.5cm diameter, Glass Econo-Column Chromatography Columns	Equipment	BioRad	737-2521
Ni-NTA His Bind resin	Equipment	Novagen	M0063428
Spectrophotometer	Equipment	Amersham Biosiences	Ultraspec 2100 pro
Quartz cuvette	Equipment	Hellma	104-QS
Fast Performance Liquid Chromatography- AKTA purifier 10	Equipment	GE Healthcare Biosciences	28-4062-64
Ion exchange column – MonoQ 4.6/100 PE	Equipment	GE Healthcare Biosciences	10025543
Size exclusion pre-packed column-HiLoad 26/60 Superdex 200	Equipment	GE Healthcare Biosciences	17-1071-01
Centricon - Vivaspin15 – 10,000 MWCO	Equipment	Sartorius Stedim Biotech GmbH	VS1501
Table centrifuge	Equipment	Thermo scientific	IEC CL30R
MALDI-TOF	Equipment	Bruker Daltonics	Reflex IV
Tris-HCl (hydrotymethyl) aminomethane	Reagent	BioLab	20092391
Sodium Chloride	Reagent	FRUTROM	235553470
Imidazole	Reagent	Alfa Aesar	288-32-4
EDTA free protease inhibitors cocktail	Reagent	Sigma	P-8849
Dnase I (Deoxyribonuclease I)	Reagent	Sigma	DN-25
Bovine Thrombin	Reagent	Fisher BioReagents	BP25432
Glycine	Reagent	BioLab	07132391
Soudim Dodecyl Sulfate (SDS)	Reagent	BioLab	19822391
Beta-mercaptoethanol	Reagent	Sigma	M-3148
InstantBlue	Reagent	Expedeon	1SB01L
PageRuler Prestained Protein Ladder	Reagent	Fermentas	SM0671