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Method Article
Mama é uma proteína Magnetosome único associado que foi mostrado para ser envolvido na ativação magnetosome. Aqui apresentamos o protocolo de purificação da Mama exclusão mutante (MamAΔ41) de M. magneticum AMB-1.
Bactérias magnetotáticas compreendem um grupo diverso de microorganismos aquáticos que são capazes de se orientar ao longo campos geomagnético. Este comportamento é acreditado para ajudar sua busca por ambientes adequados
1. Clonagem e expressão de Mama no Gene E. coli
O mutante do gene foi amplificado mamAΔ41 usando a reação em cadeia da polimerase (PCR) de DNA genômico de Magnetospirillum magneticum AMB-1, com primers: 5'-GCATTACGCATATGGACGACATCCGCCAGGTG-3 'e 5'-GCGCGGCAGCCATA-TGGCATACG-3'. Nos fragmentos de DNA amplificado, um site NcoI foi introduzido no códon de iniciação ATG eo códon de terminação foi substituído por um site SCOI. Os fragmentos foram digeridos com NcoI e SacI e clonados no respectivos sites de pET52b (+), dando origem a pET52bMamAΔ41-AMB1. Nesta construção, o gene mamAΔ41 foi fundida em-frame com o 10-Sua tag no C-terminal. O plasmídeo foi electroporated em E. coli estirpe BL21. E. coli estirpe BL21 abrigar pET52bMamAΔ41 foi cultivado em auto-indução (15) meio contendo ampicilina (50 mg / ml) 310 ° K por 3 horas. A temperatura de cultivo foi então deslocada de 310 ° a 300 ° K e mantido por um adicional de 48 h, a 300 ° K. As células foram colhidas por centrifugação a 5465g por 10 minutos a 277 ° K. 8 cultura de litros produzidos 60 gramas de pellet celular molhado.
2. Os cálculos de bioinformática
Cálculos de peso molecular (MW), de acordo com a seqüência de aminoácidos ea absorção previsto de 1mg/1ml de proteína em 280nm, utilizando o servidor ProtParam (http://www.expasy.ch/tools/protparam.html). Para 10His-Tag-MamAΔ41 o MW é 22529 Da (240 aminoácidos) e para MamAΔ41 (com 9 aminoácidos esquerda após sua remoção por tag-trombina) o Mw é 20596.5Da (187 aminoácidos). A absorção previsto de 1mg/1ml de proteína em 280nm para 10His-Tag-MamAΔ41 é 0,595 e para MamAΔ41 é 0,579. Além disso, a seqüência de aminoácidos não contém resíduos de cisteína. Portanto, agentes redutores não são necessários durante o processo de purificação.
3. Purificação da MamAΔ41
4. Resultados representante
Quando este protocolo é feito corretamente deve-se altamente purificado, tamanho amostras de proteína homogênea e concentrada. Estas amostras de proteínas são, então, pronto para ensaios de cristalização, bem como estudos bioquímicos, tais como cinética enzimática, afinidade de ligação e muito mais. Aqui descritos são resultados representativos dos principais passos no protocolo de purificação. SDS-PAGE análise do perfil de eluição de Ni-NTA coluna de afinidade deve revelar muito mais proteína expressa na fração solúvel em MW apropriado de ~ 22kDa (Figura 1). Esta análise SDS-PAGE deve também revelar mínimo, se qualquer proteína nas proteínas ilimitada de fluxo, lavagem de fluxo e ultra-centrifugação da amostra de sedimento. Se grandes bandas da proteína apropriada aparecem nestas amostras deve-se considerar a preparação de buffer errado, problemas no rompimento celular ou problemas na cultura de auto-indução condições e crescimento.
Cromatografia de troca iônica é pré-formados a fim de separar entre o nosso proteína desejável outras proteínas E.coli que estavam vinculados à resina de níquel (devido a interações eletrostáticas ou histidina / negativo aminoácidos loops ricos em proteínas) e proteína His-Tagged uncut desejável. Esta coluna separa proteínas de acordo com a afinidade de ligação à resina com carga positiva no aumento da concentração de NaCl. Proteína altamente carregadas negativamente vai eluir em maiores concentrações de NaCl appose para moderar os com carga negativa. As vantagens desta coluna são de alta vazão e capacidade de ligação. O cromatograma de troca iônica (Figura 2) revela uma boa separação entre 3 populações proteínas no aumento da concentração de NaCl. SDS-PAGE análise é necessária a fim de determinar MW de cada população, isolando a uma desejável e avaliar se as etapas de purificação que são necessários mais. A primeira população é MamAΔ41 (~ 20 kDa), enquanto a segunda população é MamAΔ41 + Tag His (~ 22kDa) que não foi clivada pela trombina bovina e à terceira população é indetectável no SDS-PAGE, devido à baixa concentração. Se os picos de proteínas não são claramente separados deve-se considerar a preparação de buffer errado ou alterar a inclinação do gradiente de NaCl.
Cromatografia por exclusão de tamanho é pré-formados a fim de separar entre o nosso proteína desejável a outras proteínas de células E. coli que foram ligados à resina Ni-NTA e não foram separados durante a cromatografia de troca iônica. Esta coluna separa proteínas de acordo com seu tamanho. Grandes proteínas vai eluir em menores volumes de eluição oposição a pequenos que serão eluídos em volumes maiores. O cromatograma coluna (Figura 3) revela uma boa separação da proteína desejável como uma população principal. A população parece eluir no tamanho apropriado com um monômero MW de ~ 20 kDa. A presença de ~ 80 kDa banda (E.coli proteína típica que se liga Ni-NTA) é detectado em SDS-PAGE antes de carregá-coluna e desaparece durante essa rodada. Desde que a concentração desta proteína kDa ~ 80 é baixo, para começar, a sua população não aparece no cromatograma, devido à sua diluição e SDS-PAGE análise é necessária para determinar a eficiência de purificação. Recomendamos o carregamento de uma amostra diluída e concentrada do pico principal do SDS-PAGE para um certamente poderia determinar a presença de uma proteína pura no MW apropriado. Por esta fase, a proteína é purificada e sua homogeneidade deve ser avaliada por MALDI-TOF. Esta análise revelou uma proteína de 20.347 MW e outra em Da Mw de 10176 Da (Figura 4). O ~ proteína de 10 kDa é o ~ proteína kDa 20 dobrou cobrado. O MW previsto de MamAΔ41 com os 9 aminoácidos esquerda após sua Tag-remoção foi 20596,5 Da. Comparando-o com o obtido MALDI-TOF MW descobrimos que eles são 248 Da distante. Essa diferença pode ser resultado de erros MALDI-TOF medição e / ou devido à degradação comum do metionina primeiro eo segundo glicina. Para concluir, a proteína é altamente purificada e pode ser utilizado nos experimentos posteriores.
Tabela 1. Formulações Buffer.
Figura 1. Representante análise SDS-PAGE de Ni-NTA purificação coluna Da direita para a esquerda;. P-ultra-centrifugação pellet (3.11 passo protocol), W-lavagem (3,12 etapa protocol), U-unbounded proteínas (3.10 passo protocol), E- cinco pistas de eluição samples (3,14 etapa protocol), M - marcador de proteína (números indicam MW). Seta indica MamAΔ41.
Figura 2. Análise de cromatografia de troca iônica etapa (a) de troca iónica cromatograma (coluna MonoQ); Blue - 280nm absorção, representa a concentração de proteína, Green-concentração de NaCl, Vermelho - indicação das frações coletadas. (B) Representante análise SDS-PAGE da etapa de purificação de troca iônica. Da esquerda para a direita; M - marcador de proteína (números indicam Mw), A6 - fração primeiro pico, segundo A8-fração de pico.
Figura 3. Tamanho análise de cromatografia de exclusão (a) a exclusão Tamanho (Superdex coluna 200) cromatograma; Blue - 280nm absorção, representa a concentração de proteína, a indicação Red das frações coletadas. (B) Representante análise SDS-PAGE do tamanho do passo de purificação de exclusão. Da esquerda para a direita; proteína M-marcador (números indicam MW), Prei pré-injeção de amostra, A4-6 fração combinada coletados a partir do primeiro pico, A4-6D-diluído fracção recolhida, a partir do pico.
Figura 4. Matrix-assisted laser de dessorção / ionização (MALDI-TOF) espectro de massa de purificada MamAΔ41. A matriz é o ácido Sinapic (SA). MamAΔ41 mostrado em 20347 Da, também mostrado é a espécie dobrou acusado de MamAΔ41 em 10176 Da.
Purificação de proteínas é o passo principal em todas as proteínas estruturais ou estudos bioquímicos. Uma vez que cada proteína é o único com seu próprio comportamento, é preciso definir suas propriedades e modificar sua purificação de acordo. Proteína-alvo deve ser analisado como um primeiro passo para a purificação utilizando ferramentas de bioinformática. Eles são usados para calcular o objectivo ponto iso-elétrico, avaliar a sua necessidade de redução / oxidação ambiente e sua necessida...
Reconhecemos Dr. Amir Aharoni por seu apoio e Davidov Geula, Noam Grimberg e Chen Guttman para os seus conselhos e comentários.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Name | Company | Catalog Number | Comments | |
French Press | Equipment | Thermo scientific | FA-078A | |
Pressure cell | Equipment | Thermo scientific | FA-032 | |
Ultra-centrifuge | Equipment | Sorvall | Discovery 90SE | |
Rottor | Equipment | Beckman | Ti60 | |
Ultra-centrifuge tubes; PC-Bottle+Cap Assay 26.3ml | Equipment | Beckman | BC-355618 | |
2.5cm diameter, Glass Econo-Column Chromatography Columns | Equipment | BioRad | 737-2521 | |
Ni-NTA His Bind resin | Equipment | Novagen | M0063428 | |
Spectrophotometer | Equipment | Amersham Biosiences | Ultraspec 2100 pro | |
Quartz cuvette | Equipment | Hellma | 104-QS | |
Fast Performance Liquid Chromatography- AKTA purifier 10 | Equipment | GE Healthcare Biosciences | 28-4062-64 | |
Ion exchange column – MonoQ 4.6/100 PE | Equipment | GE Healthcare Biosciences | 10025543 | |
Size exclusion pre-packed column-HiLoad 26/60 Superdex 200 | Equipment | GE Healthcare Biosciences | 17-1071-01 | |
Centricon - Vivaspin15 – 10,000 MWCO | Equipment | Sartorius Stedim Biotech GmbH | VS1501 | |
Table centrifuge | Equipment | Thermo scientific | IEC CL30R | |
MALDI-TOF | Equipment | Bruker Daltonics | Reflex IV | |
Tris-HCl (hydrotymethyl) aminomethane | Reagent | BioLab | 20092391 | |
Sodium Chloride | Reagent | FRUTROM | 235553470 | |
Imidazole | Reagent | Alfa Aesar | 288-32-4 | |
EDTA free protease inhibitors cocktail | Reagent | Sigma | P-8849 | |
Dnase I (Deoxyribonuclease I) | Reagent | Sigma | DN-25 | |
Bovine Thrombin | Reagent | Fisher BioReagents | BP25432 | |
Glycine | Reagent | BioLab | 07132391 | |
Soudim Dodecyl Sulfate (SDS) | Reagent | BioLab | 19822391 | |
Beta-mercaptoethanol | Reagent | Sigma | M-3148 | |
InstantBlue | Reagent | Expedeon | 1SB01L | |
PageRuler Prestained Protein Ladder | Reagent | Fermentas | SM0671 |
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