使用自动细胞计数器简化基因表达研究：在Namalwa细胞的IL - 4依赖的基因表达的siRNA击倒

摘要

此过程介绍了一个快速简便的工作流程，引入困难的siRNA转染细胞系，并按照实时PCR基因表达。使用自动细胞计数器，多井的电板，全自动电泳站提供快速和可靠的结果，而不需要昂贵的机械手。

摘要

使用的siRNA介导的基因敲除继续在基因表达研究中的一个重要工具。 siRNA的研究，不仅要研究单个基因的下调的影响，但也询问信号通路和其他复杂的相互作用网络。这些途径分析需要使用有关的细胞模型和方法，导致少扰动细胞生理学。电穿孔是越来越多地被用来作为一种有效的方式引入难以siRNA和其他核酸，细胞株和原代细胞的转染而不改变正在调查中的信号转导通路。有一个成功的siRNA实验的多个关键步骤，并且有办法在几个实验阶段，同时提高数据的质量，简化工作。为了帮助您与您的siRNA介导的基因敲除项目开始，我们将演示如何执行一个途径的研究，从收集和计数细胞前通过后转实时PCR基因表达分析，以电的完整。下面的研究探讨IL - 4在Burkitt淋巴瘤细胞系（Namalwa）CCL17依赖基因表达的转录激活因子STAT6的作用。本文演示的技术是很有用的一个广泛的siRNA实验的基础上壁和悬浮细胞。我们还将展示如何精简细胞与TC10自动细胞计数计数，如何electroporate MXcell电系统同时使用多个样品，以及如何同时评估RNA的质量和数量的Experion自动电泳系统。

研究方案

1。准备和Namalwa细胞计数

1. 从培养瓶中取出的细胞和细胞离心沉淀。删除已知体积的PBS上清和悬浮细胞。在本议定书中所使用的细胞悬浮细胞。如果您使用的是贴壁细胞，你将需要trypsinize之前收集的。
2. 要确定活细胞数，染色细胞悬液等分，由0.4％台盼蓝溶液和吸管10μL混合物混合计数幻灯片上1:1，然后插入幻灯片TC10自动细胞计数器（Bio - Rad公司实验室，INC）。
3. TC10细胞计数将自动对焦，以保证最精确的计数，然后使用计数进行。它会自动确定样品中的活细胞和细胞总数的密度。
4. 选择查看图像显示viewscreen细胞。然后选择稀释计算器TC10细胞计数，自动计算金额，将需要的细胞混合。
5. 本实验使用的是共有3个siRNA的对照siRNA和两个不同的siRNA针对STAT6的基因，加上未转染对照。这就要求在终浓度为5 × 10 ⁶细胞每毫升3.6毫升。
6. 输入所需浓度稀释计算器和最终的音量值，并计算出细胞悬液，所需的量的基础上，样品的活细胞计数。另外，手动执行计算。 ，然后转移到一个新的管这些试验的细胞的混合物的要求量。
7. 旋转颗粒细胞的细胞混合物，并删除所有的PBS。重悬在3.6毫升基因脉冲电击缓冲液（Bio - Rad公司实验室）。转移到含有适当的siRNA管800μL等份，轻轻混匀。这些细胞是目前电准备。

2。电穿孔细胞在96孔板

1. 96电板允许复制所有四个一起被电治疗。
2. 一个96孔的电板适当的水井，转移到150μL的细胞悬液。
3. 插入MXcell电板腔板，并盖上盖子。
4. Electroporate使用的细胞系，并正在使用的缓冲区的优化设置。这些细胞电穿孔使用250伏的仪器设置的指数衰减波，350μF和1000Ω电阻。
5. 电完成后，吸管和每口井轻轻地混合，然后将细胞转移到组织培养板中含有预热媒体。 Namalwa细胞是生长在7.5％FCS，1％丙酮酸补充的RPMI（Life Technologies公司）。
6. 控制尚未电穿孔的样品取自剩余的细胞悬液，并加入到预热的培养基的培养皿相同的电穿孔细胞。
7. 在37℃过夜孵育细胞℃，5％的CO _2。
8. 24小时后，诱导细胞与10 ng / ml的终浓度重组IL - 4（R＆D系统）。控制细胞的第二组只收到其他媒体。所有的细胞都在37 ° C和5％的CO ₂孵育一个额外的24小时。

3。提取和检查的RNA

1. 共增长了48小时后，每孔计数细胞，并转移到每口井之一等份为RNA提取的离心管，并冻结了免疫印迹或其他蛋白质分析的第二个等份。
2. 样品离心沉淀细胞，然后取出并丢弃上清液从每管。
3. 继续与RNA的提取。我们通常使用的奥罗总RNA试剂盒（Bio - Rad公司）根据所包含的协议。
4. 当监视的siRNA介导的基因敲除，以验证RNA的质量显得尤为重要，因为降解的RNA会产生误导的结果。 260/280的比例并不表明RNA的完整性，因此重要的是要运行的样品，凝胶或微流体装置，以确认RNA的不退化。
5. 为了评估在一个步骤的质量和数量，分析这些样本将被使用的Experion自动电泳系统（BIO - RAD）。
6. 首先，热的样品。然后，总理，负载和旋涡的Experion RNA芯片。芯片插入的Experion电泳站，并开始运行。
7. 运行完成后，将显示的Experion软件电泳，结果表的形式（即显示RNA浓度，核糖体的比例，和RNA的质量指标数量），和虚拟凝胶结果自动（看起来类似传统的RNA凝胶）。高质量的总RNA样本，通常会有8-10 RQI。

4。实时PCR

1. RNA质量核实后，进行cDNA的反应。本实验所用的iScript一步法RT - PCR混合物（BIO - RAD）组合在一个反应​​合成cDNA和实时PCR。
2. 设为主结构，包含每个引物RNA模板以外的所有反应组件，并分发到PCR板。
3. 一个统一的浓度稀释后的RNA，RNA样品添加适当的水井。每一个反应是成立一式三份。
4. 封板，并放入的CFX384实时PCR系统（BIO - RAD）。选择合适的协议，并开始运行。
5. 一旦运行完成后，基因表达是通过比较基因表达的基因归参照基因在细胞电穿孔与实验的siRNA细胞电穿孔与对照siRNA正常化的利息确定。

5。的siRNA敲除分析

1. 使用实时定量PCR监测调查中IL - 4 CCL17依赖诱导转录激活因子的作用STAT6的表达CCL17。在这个实验中，被用作参考基因GAPDH的。备用参考基因​​或多个参考基因可以用相同的方式。
2. CFX Manager软件会自动归CCL17表达从同一样品的参考基因表达，并自动比较造成的标准化值，以控制通过简单的选择GAPDH作为“参考”和控制治疗（IL - 4诱导的无控制的siRNA）的治疗CFX Manager软件在实验中设置窗口的“控制”。
3. 无IL - 4诱导CCL17的转录低，构水平保持在控制治疗相媲美。
4. 诱导的IL - 4和保留正常STAT6通路（即，对照siRNA或未转染对照处理）的细胞表现出8-10倍CCL17表达诱导。
5. 与IL - 4，但与STAT6的表达，通过引进任STAT6的siRNA抑制细胞显示，只有约2倍高于非诱导细胞在IL - 4诱导表达的CCL17确认的STAT6作用CCL17表达。

6。代表性的成果

图1。 IL - 4信号转导通路的概述 。
的IL - 4及其受体）结合，导致二聚和STAT6的活化。激活STAT6区转移到细胞核，并激活其靶基因，如CC17，转录。
b）在不IL - 4诱导CCL17的转录将保持在低，构水平。
c）在STAT6基因的siRNA介导的沉默，与IL - 4的治疗应该导致很少或根本没有增加CCL17表达。

图2。由IL - 4诱导CCL17测量不同条件下，通过定量实时PCR 。
一）种植无IL - 4的样本低构的表达水平，不论基因的表达。
B）在绿色和蓝色所示，对照样品的反应通常与IL - 4治疗; 8-10倍CCL17诱导。然而，针对STAT6的，在红色和粉色的siRNA转染的细胞，减少了CCL17表达IL - 4，支持这个想法，STAT6起着作用的IL - 4诱导表达的CCL17。

讨论

本文演示了如何electroporate陷入困境的siRNA转染悬浮细胞系，如何遵循这些细胞的基因表达。执行此过程时，重要的是要记得保持尽可能一致的，所有样品的事情。