溶质直接气管滴入小鼠肺

摘要

气管内灌注，直接传送到肺部的溶质。此过程中的目标进入肺远端地区instillate交付，因此，往往在研究旨在研究肺泡中。我们提供一个详细的生存协议执行在老鼠的气管内灌注。

摘要

气管内灌注，直接传送到肺部的溶质。此过程中的目标进入肺远端地区instillate交付，因此，往往在研究旨在研究肺泡中。我们提供一个详细的生存协议执行在老鼠的气管内灌注。使用这种方法，可以进入远端肺目标提供测试溶质或固体（如肺癌治疗，表面活性剂，病毒，和小寡核苷酸）。气管灌注可能是首选的方法，对吸入协议可能主要目标和上呼吸道有可能使潜在的有害物质的调查。此外，在使用气管滴入协议中，动物可以完全恢复从非侵入性的程序。这使得随后的实验动物，或重新安装使用相同的动物的生理测量。进入肺部介绍instillate必须审慎考虑后，决定和渗透平衡，以确保动物恢复。通常情况下，30-75μL的instillate体积可以被引入到小鼠肺。

研究方案

1。麻醉

1. 麻醉与异氟醚的小鼠，可促进动物的处理和约束管理麻醉intraperitaneally前。使用吸入麻醉剂可能会或可能不适合特定研究：确定首先使用异氟醚的影响，或任何其他麻醉建议肺癌研究。
2. 与异氟醚麻醉动物。视频显示设置在2％异氟醚异氟醚蒸发器室与氧气混合使用。如果你没有一个异氟醚室，你也可以使用标准的开放式下降曝光技术。并附底部装有一个丝网大鼠在钟罩（或其他相应的非多孔容器）。纱布垫置于下方的网线，适用于30％V / V丙二醇异氟醚的混合物。网格的使用，确保该动物没有接触到，这可能会引起皮肤刺激和潜在的过量的异氟醚浸泡垫。短的曝光，以异氟醚后，动物麻醉后，JAR时是倾斜的，并不会响应后脚趾捏不会与翻正反射响应。
3. 进一步稳重的小鼠腹腔注射甲苯噻嗪和氯胺酮的混合。 （执行腹腔注射拉回，以保证肠道或其他重要器官的部分尚未侵入时，它是很好的做法）。 1000μL，氯胺酮在8850微升0.9％无菌磷酸盐（100毫克/毫升）混合使用150μL的甲苯噻嗪（100毫克/毫升）缓冲液（PBS）。剂量对小鼠，将约10克体重的80％微升。终浓度10毫克/公斤甲苯噻嗪和100毫克/公斤氯胺酮。动物应保持干燥，隔热层，以防止身体热量的过度流失。眼药膏可应用于对眼睛防止角膜干燥。

2。手术区的制备

1. 剃须面积将手术切口，防止非prepped地区的污染。电动剃须刀可以密切剃去动物的皮毛。剃光面积应大于切口部位。
2. 脱毛膏，如奈尔，其后的申请，将删除所有剩余的皮毛。一层厚厚的脱毛膏手术区和离开3分钟。用湿毛巾擦去毛皮和脱毛膏。不要离开超过10分钟脱毛膏。
3. 使用70％的酒精，或一种替代擦洗解决方案，手术区的无菌准备。

3。外科手术

1. 定位到一个倾斜的手术板，或角度的制约立场麻醉的动物。
2. 让颈部的前方（喉咙地区）附近的一个小切口。
3. 解剖了颈阔肌和前气管肌肉，以可视化和访问气管环。
4. 通常情况下，气管内注射量3μL的重量每克（约30-75μL终体积）。管理的instillate适量使用1毫升皮下（子Q）的30号的注射器，5/16-inch针。注射器锥侧与气管平行，并注入进气管全卷的instillate。
5. 动物可能会进入肺部滴入溶质回应喘气。介绍通过注射器内的空气和观察肺部是否扩大，也将确认成功的插管技术。
6. 从气管中取出注射器。

4。缝合。

1. 把握一个持针针的收压（最厚部分的针连接缝合材料）。
2. 在90 °角约1-3毫米的尖的针距伤口边缘皮肤厚度不同，穿透皮肤。通过组织通过抓住后退出针。简单的针，单独打结，将有效地关闭伤口。

5。动物恢复

1. 动物从麻醉和外科手术后3-24小时内完全恢复。

6。代表性的成果

气管内滴入荧光化合物，Cy5.5结合右旋糖酐，显示成功灌注B6小鼠肺中的荧光化合物（图1）。荧光染料主要是针对肺和是均匀分布的。在胃肠道的荧光信号紧随过程表明，食道无意中在手术过程中（图2）插管。调查人员可能也验证了有针对性的化合物进入肺部，并检查instillate分布，以下程序或固定histolo膨胀的肺和准备肺组织切片（2 3）gical样本。

图1。荧光Cy5.5与合作的X射线图像在成功地注入小鼠肺注册的信号。 1.4毫克Cy5.5右旋糖酐（浓度为10微克/μL）注入气管B6小鼠肺。 Cy5.5信号检测，使用675 nm激发过滤器和695 nm发射过滤器。

图2。联合登记与X射线在灌输鼠标不佳叠加显示的荧光信号。插管不当食道在气管滴入Cy5.5交付的肠子协议的结果。

讨论

已在几个不同的研究的气管内灌注用于评估的测试化合物（6）的毒性，诱导肺泡性肺损伤（4 7），通过提供小寡核苷酸取代表面活性剂（8），以及改变基因的表达直接进入（5）肺。目前，我们正在探索使用灌输1）荧光进入肺的氧化还原反应敏感的材料，以衡量体内正常和病理条件下的氧化应激，以及2）灌输与药理作用的化合物，DNA载体，病毒，荧光指标/或小分子RNA，以评估每个instillate肺癌流...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Webster Veterinary	14043-220-05
Xylazine	Lloyd, Inc.		New Animal Drug Application #139-236
Ketamine	Bioniche Pharma	67457-001-10
Nair			Available at drug stores
1mL SubQ Syringe	BD Biosciences	309597	26 5/8 G
4-0 Nylon Suture	Ethicon Inc.	1894G.S30