Diretta instillazione tracheale di soluti in polmone mouse

Riepilogo

Instillazioni intratracheale soluti consegnare direttamente nei polmoni. Questa procedura obiettivi la consegna del instillate nelle regioni distali del polmone, ed è quindi spesso incorporati in studi volti a studiare alveoli. Forniamo un protocollo dettagliato di sopravvivenza per l'esecuzione di instillazioni intratracheale nei topi.

Abstract

Instillazioni intratracheale soluti consegnare direttamente nei polmoni. Questa procedura obiettivi la consegna del instillate nelle regioni distali del polmone, ed è quindi spesso incorporati in studi volti a studiare alveoli. Forniamo un protocollo dettagliato di sopravvivenza per l'esecuzione di instillazioni intratracheale nei topi. Usando questo approccio, si può avere come bersaglio la consegna di soluti test o solidi (come la terapia del polmone, tensioattivi, virus e oligonucleotidi piccolo) nel polmone distale. Instillazioni tracheale può essere il metodo preferito, su protocolli per inalazione, che potrebbe in primo luogo di destinazione del tratto respiratorio superiore e, eventualmente, esporre al ricercatore di sostanze potenzialmente pericolose. Inoltre, utilizzando il protocollo instillazione tracheale, gli animali possono riprendersi completamente dalla procedura non invasiva. Questo permette di fare successive misurazioni fisiologiche di test sugli animali, o reinstallazione usando lo stesso animale. La quantità di instillate introdotto nel polmone deve essere accuratamente determinato e osmoticamente bilanciata per assicurare il recupero degli animali. Tipicamente, il volume instillate 30-75 microlitri può essere introdotto in polmone del mouse.

Protocollo

1. Anestesia

1. Anestesia topi con isoflurano può facilitare la movimentazione degli animali e la moderazione prima di somministrare l'anestesia intraperitaneally. L'uso di un anestetico per via inalatoria può o può non essere adatto per uno studio particolare: innanzitutto determinare l'impatto dell'utilizzo di isoflurano, o qualsiasi altro anestetico, il polmone studio proposto.
2. Anestetizzare gli animali con isoflurano. Il video mostra l'uso di una camera vaporizzatore isofluorano al 2% isoflurano mescolato con l'ossigeno. Se non si dispone di una camera di isoflurano, in alternativa è possibile utilizzare standard aperto-drop tecniche di esposizione. Racchiudere topi in una campana di vetro (o altro appropriato non porose container) con una rete metallica montata sul fondo. Per una garza posto sotto la rete metallica, applicare una miscela di 30% v / v isoflurano in glicole propilenico. L'uso della rete fa sì che l'animale non entrare in contatto con il isoflurano intriso di pad, che potrebbe causare irritazione della pelle e sovradosaggio potenziale. Dopo la breve esposizione alla isoflurano, l'animale deve essere anestetizzato e non risponde con un riflesso di raddrizzamento, quando il vaso è capovolto e non risponde dopo pizzico piedi.
3. Ulteriori sedare i topi con una iniezione intra-peritoneale di un mix di xylazina e ketamina. (E 'buona pratica durante l'esecuzione di iniezioni intraperitoneali di tirarsi indietro per assicurarsi che le parti dell'intestino o di altri organi vitali non sono state penetrate). Mescolare 150 xylazina microlitri (100 mg / mL) con 1000 ketamina microlitri (100 mg / mL) in 8850 ml di 0,9% fosfato sterile salina tamponata (PBS). Per i topi, il dosaggio deve essere di circa 80 microlitri per 10 grammi di peso corporeo. La concentrazione finale sarà di 10 mg / Kg xylazina e 100 mg / kg ketamina. Gli animali devono essere tenuti asciutti e isolati per impedire la perdita eccessiva di calore del corpo. Pomata oftalmica può essere applicata agli occhi per evitare l'essiccazione delle cornee.

2. Preparazione di Area Chirurgica

1. Rasatura l'area in cui l'incisione chirurgica sarà effettuata impedisce la contaminazione da non prepped aree. Un rasoio elettrico da vicino può accorciare il pelo fuori l'animale. L'area rasata deve essere maggiore del sito di incisione.
2. Successiva applicazione di crema di rimozione dei capelli, come Nair, eliminerà tutte le pellicce rimanenti. Applicare uno strato abbondante di crema depilazione all'area chirurgica e lasciare agire per 3 minuti. Spazzare via la pelliccia e la rimozione creme per capelli con un asciugamano umido. Non lasciare la crema di rimozione dei capelli in oltre 10 minuti.
3. Usare alcool al 70%, oppure una soluzione alternativa scrub, per preparare in modo asettico l'area chirurgica.

3. Procedura chirurgica

1. Posizionare l'animale anestetizzato su una tavola inclinata chirurgico, o stand contenimento angolato.
2. Fai una piccola incisione vicino alla faccia anteriore del collo (regione della gola).
3. Sezionare via il platisma e dei muscoli anteriori tracheale per visualizzare e accedere gli anelli tracheali.
4. Tipicamente, i volumi di iniezione intratracheale sono 3 grammi microlitri capite di peso (circa 30-75 microlitri di volume finale). Somministrare la giusta quantità di instillate con un 1 ml per via sottocutanea (sotto-Q) siringa con un calibro 30, l'ago 5/16-inch. Tenere premuto il lato smusso siringa e parallelo con la trachea, e iniettare l'intero volume del instillate nella trachea.
5. L'animale può rispondere senza fiato dopo l'instillazione di soluto nei polmoni. L'introduzione di aria attraverso la siringa e osservando se i polmoni si espandono anche le tecniche di confermare l'intubazione di successo.
6. Rimuovere la siringa dalla trachea.

4. Suture.

1. Afferrare pressare dell'ago (parte più spessa dell'ago cui è collegato il materiale di sutura) con un porta aghi.
2. Penetrano nella pelle con la punta dell'ago a 90 ° angolo di circa 1-3 millimetri dal bordo della ferita, a seconda dello spessore della pelle. Afferrare l'ago in uscita dopo un passaggio attraverso il tessuto. Punti semplici, annodata individualmente, in modo efficiente chiudere la ferita.

5. Recupero animali

1. Gli animali devono riprendersi completamente dalla anestesia e intervento chirurgico dopo 3-24 ore.

6. Rappresentante Risultati

Instillazione di composti fluorescenti, coniugato con destrano Cy5.5, mostra l'instillazione di successo di composti fluorescenti in B6 polmone del mouse (Figura 1). Il colorante fluorescente è principalmente mirato al polmone ed è distribuito uniformemente. Segnale fluorescente nel tratto gastrointestinale immediatamente dopo la procedura indica che l'esofago è stata inavvertitamente intubato durante la procedura (Figura 2). Gli inquirenti possono anche verificare somministrazione mirata di sostanze nei polmoni, e controllare la distribuzione del instillate, seguendo la procedura gonfiando i polmoni e la preparazione di fette di tessuto polmonare (2, 3) o fissa histolocampioni chirurgici.

Figura 1. Fluorescente Cy5.5 segnale co-registrati con immagine a raggi X nel polmone del mouse con successo instillato. 1,4 mg Cy5.5 Destrano (a una concentrazione di 10 mg / mL) è stato instillato nella trachea di B6 polmone mouse. Cy5.5 segnale è stato rilevato utilizzando un filtro di eccitazione 675 nm e 695 nm filtro per le emissioni.

Figura 2. Co-registrazione del segnale fluorescente mostrato con raggi X sovrapposizione nel topo poco instillato. Intubazione inappropriato dell'esofago durante risultati protocollo instillazione tracheale in Cy5.5 consegna agli intestini.

Discussione

Instillazioni intratracheale sono stati utilizzati in diversi studi diversi per valutare la tossicità dei composti di prova (6), indurre lesioni alveolare polmonare (4, 7), sostituire tensioattivi (8), così come alterare l'espressione genica tramite la consegna di piccoli oligonucleotidi direttamente nel polmone (5). Attualmente stiamo esplorando l'uso di infondere 1) fluorescente redox-sensibili materiale nei polmoni per misurare lo stress ossidativo in vivo in condizioni normali e fisiopatologiche, come pure...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Webster Veterinary	14043-220-05
Xylazine	Lloyd, Inc.		New Animal Drug Application #139-236
Ketamine	Bioniche Pharma	67457-001-10
Nair			Available at drug stores
1mL SubQ Syringe	BD Biosciences	309597	26 5/8 G
4-0 Nylon Suture	Ethicon Inc.	1894G.S30