3幼虫节段性神经的可视化 RD龄果蝇幼虫的筹备工作

摘要

果蝇幼虫提供了一个理想的模型系统调查内幼虫节段性神经轴突运输的机制。使用此过程中， ^第三龄幼虫携带各种突变可以比野生型幼虫。

摘要

果蝇作为研究的发展和神经系统的功能强大的模型系统，特别是由于其方便的遗传学和完全测序的基因组，新兴。此外，幼虫的神经系统是一个理想的模型系统研究轴突运输机制，幼虫节段性神经束包含其细胞位于大脑和身体的长度沿结束他们的神经末梢内的机构轴突。在这里，我们描述幼虫节段性神经突触囊泡蛋白的可视范围内的程序。如果做得正确，对神经系统的所有组件，连同相关的组织，如肌肉和NMJs，保持完好，无破损，并准备要可视化。 ^第三龄幼虫携带各种突变解剖，固定，与突触囊泡抗体孵育，可视化和比较野生型幼虫。此过程可适应几种不同的突触或神经抗体和多种蛋白质分布的变化，可以很容易地观察到幼虫节段性神经内。

研究方案

1。试剂的制备

1. 准备1X夹层缓冲区使用128毫米氯化钠，4MM，4MM _氯化钙氯化镁_2，2毫米氯化钾，5MM HEPES和36mm的蔗糖。 PH值至7.2的解决方案和过滤消毒。
2. 准备使用1:1稀释16％的甲醛和1个夹层缓冲固定液。
3. 准备1X PBT的使用1X的磷酸盐缓冲液（PBS），PH值在7.2和Triton X - 100的一个比例为1:100。
4. 准备5％牛血清白蛋白（BSA）的0.01％，钠叠氮化物在1X PBS。

2。解剖的准备工作

1. Sylgard菜肴用于清扫。浇Sylgard 184硅橡胶基地和固化剂混合成一个培养皿准备的菜肴。允许混合物完全巩固和使用前干。
2. 前清扫，收集＃5镊子一双干净，一双干净的直叶片vannas剪刀，和引脚。

3。剖析^第三龄幼虫

1. 收集到培养皿中徘徊^第三龄幼虫一个特定的基因型。
2. 在去离子水洗净的幼虫的食物摆脱。
3. 幼虫，背一面朝上放置一个sylgard菜。在其前部和后部两端引脚的幼虫。
4. 放置一个1X夹层缓冲寄托幼虫下降。使用NIP的罚款剪刀幼虫背中线附近后结束。使用剪刀，切断后结束前的幼虫角质层。
5. 将一个新的1X夹层缓冲区下降到解剖幼虫。使用一根针，挑一个幼虫的中间附近的角质层外侧边缘和引脚上的角质层。使用另一个引脚，引脚如下图所示的角质层第二外侧边缘。有两个引脚用于在每个侧向一边。见下图。
6. 小心地取出肠，脂肪体，和气管，只留下两个光叶腹侧神经节和附加段神经的大脑。程序的其余部分是sylgard菜。

4。固定的解剖幼虫

1. 孵育解剖幼虫在30分钟的修复，每15分钟更换修复。
2. 固定后，冲洗30分钟，每10分钟更换缓冲在1x PBT的幼虫。重要的是要注意的幼虫应始终在一个缓冲区。

5。抗体染色的解剖幼虫

1. 准备稀释至适当浓度在5％牛血清白蛋白与叠氮化钠在1X PBT的抗体。不同的抗体最佳浓度会有所不同。
2. 替换最后1X PBT准备的初级抗体溶液冲洗，并在潮湿的腔孵育4℃过夜。湿热试验箱的构造衬砌与金正日的抹布浸泡在水中的塑料盘。
3. 次日，冲洗30分钟，每10分钟更换缓冲解剖在1x PBT幼虫。
4. 准备二抗，稀释至适当浓度在5％牛血清白蛋白与叠氮化钠在1X PBT和孵化的幼虫在25 ° C的二次抗体解决了一个小时。包装箔湿热试验箱，以防止光线，作为二抗光敏感。
5. 孵化后，冲洗30分钟，每10分钟更换缓冲在1x PBT的幼虫。

6。安装和解剖幼虫的可视化

1. 在幻灯片上的安装幼虫，准备幻灯片，由散布在中间两个指甲油的垂直线，空间足够盖玻片坐（见图表）。让指甲油完全干透。
2. 之间的垂直指甲油在幻灯片上线（见图表）空间中放置一个安装缓冲下降。现在是准备用于安装的幻灯片。
   
   
3. 冲洗后，最后1X PBT，轻轻取出外侧引脚。要小心不要撕破角质层。
4. 小心地取出剩下的两个针脚，拿起镊子幼虫，幼虫水平放置在准备幻灯片。确保幼虫翻转过来，是面向腹侧。
5. 轻轻放置顶盖上滑和密封用指甲油的边缘（见图表）。幼虫荧光显微镜下可视化的准备。
   

7。代表性的成果

图1：一个从野生型larv幼虫节段性神经的形象代表使用对突触囊泡蛋白的半胱氨酸的字符串蛋白质抗体（CSP，Zinsmaier等1994） 。请注意，节段性神经顺利染色。标尺示20μm

图2：从马达蛋白突变体的突触小泡蛋白半胱氨酸字符串蛋白（CSP）对抗体的幼虫幼虫节段性神经的形象代表。注意，节段性神经表明大量的积累，染色鲜艳的CSP（箭头）。

讨论

果蝇幼虫节段性神经是一个功能强大的系统研究轴突运输的机制。如果正确执行， ^第三龄幼虫清扫的中枢神经系统，百佳，和相关的组织，如肌肉和NMJs，的所有组件都可以在一个单一的幼虫研究。我们已经适应了从赫德和萨克斯顿（1996年）出版的一本议定书。该协议还可以适应测试其他神经元抗体，但抗体的优化应该做。小学和中学的抗体孵育时间可以改变，可以添加或阻塞的?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20
Minutien Pins, Stainless Steel	Fine Science Tools	26002-10
Mcpherson-Vannas Straight Blade 8cm Scissors	Fisher Scientific	50822236
Vectashield, Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000
Sylgard 184 Silicone elastomer	Dow Corning	4026148
formaldehyde, 16%	Electron Microscopy Sciences	15710
dCSP3	Developmental Studies Hybridoma Bank
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG	Invitrogen	A-11004