3の幼虫分節神経の可視化 RD齢ショウジョウバエ幼虫準備

要約

キイロショウジョウバエの幼虫は、幼虫の分節神経内軸索輸送のメカニズムを調べるために理想的なモデルシステムを提供しています。この手順を使用して、様々な変異を有する第³齢幼虫は、野生型の幼虫と比較することができます。

要約

キイロショウジョウバエのため、特に便利な遺伝学と完全に配列ゲノムの神経系の発達と機能を研究するための強力なモデル系として浮上している。さらに、幼虫の神経系は、幼虫の体節神経が体の長さに沿って終点の脳とその神経終末内にあるそれらの細胞体と軸索の束が含まれているように軸索輸送のメカニズムを研究する理想的なモデルシステムです。ここでは、幼虫の分節神経内シナプス小胞タンパク質の可視化のための手順を説明します。正しく行えば、神経系のすべてのコンポーネントは、そのような筋肉やNMJsなどの関連組織と一緒に、、そのまま無傷、および可視化する準備が残ります。様々な変異を有する第³齢幼虫は、解剖固定、シナプス小胞の抗体と共にインキュベートし、可視化と野生型の幼虫と比較されます。この手順は、簡単に幼虫分節神経内で観察することができる様々なタンパク質の分布にいくつかの異なるシナプスや神経細胞の抗体と変化に適応することができます。

プロトコル

1。試薬の調製

1. 、4MMのCaCl _2、4mmののMgCl _2、2mMの塩化カリウム、5mMのHEPESおよび36mmのスクロース、128 mMのNaClを用いて1 ×解離バッファーを準備します。 7.2〜ソリューションと殺菌フィルターPH。
2. 16％ホルムアルデヒドおよび1x解離バッファーの1:1希釈を使用して固定液を準備します。
3. 1Xリン酸を用いて1 × PBTを準備する生理食塩水（PBS）は1:100の比率では7.2とトリトンX - 100のPHでバッファ。
4. 1X PBSでアジ化Naは0.01％（BSA）牛血清アルブミン5％を準備します。

2。解剖のための準備

1. Sylgardの料理は、解剖のために使用されます。シャーレにSylgard 184シリコーンエラストマーベースと硬化剤の混合物を注ぐことで料理を準備します。混合物が完全に使用する前に固化し、乾燥することができます。
2. 解剖する前に、第5位鉗子、ストレートブレードのvannasのはさみのクリーンペア、およびピンのきれいなペアを集める。

3。第³齢幼虫の解剖

1. ペトリ皿の上に特定の遺伝子型の第³齢幼虫をさまよう収集する。
2. 食べ物を取り除くために脱イオン水に幼虫を洗ってください。
3. 背側の上で、sylgard皿上に幼虫を置きます。その前部と後部両端の幼虫をピン。
4. ピン幼虫で1 ×解離バッファのドロップを置きます。細かいハサミのニップの後端に近い背側正中線上に幼虫を使用した。はさみを使用して、後端から前端まで幼虫のクチクラをカット。
5. 解剖幼虫の上に新たな1 ×解離緩衝液のドロップを置きます。ピンを使用して、幼虫の中央付近にキューティクルの一側縁部を選択し、キューティクルをピン。図に示すように、別のピンを使用して、キューティクルの第二の側縁部を固定。 2本のピンをそれぞれの側面で使用されています。下の図を参照してください。
6. 慎重に接続されている分節の神経を持つ2つの光のローブと腹側神経節だけで脳を残して、腸、脂肪体、および気管を取り外します。手順の残りの部分はsylgard皿上で行われます。

4。ディテールに秘められた幼虫の固定

1. 15分ごとに修正を置き換えることで、30分の修正で切除した幼虫をインキュベートする。
2. 固定後、10分ごとにバッファを置き換えることにより、30分間× 1 PBTの幼虫をすすいでください。幼虫は、常にバッファ内でなければならないことに注意することは重要です。

5。ディテールに秘められた幼虫の抗体染色

1. 1X PBTのNaアジドと、5％BSAで適切な濃度に希釈して一次抗体を準備する。最適な濃度は、種々の抗体に異なります。
2. 最後の1X PBTは、準備一次抗体溶液で洗浄し、4℃で一晩湿気チャンバー内でインキュベート交換してください。湿気の多い室は水に浸した金 - ワイプとプラスチック皿を並べることによって構築されています。
3. 翌日、10分ごとにバッファを置き換えることにより、30分間× 1 PBTで切除した幼虫をすすいでください。
4. 1X PBTのNaアジドと、5％BSAで適切な濃度に希釈することにより、二次抗体を準備し、時間25℃で二次抗体溶液との幼虫をインキュベートする。二次抗体が敏感な光であるため、光を防止するために箔で湿度の高い室を包みます。
5. インキュベーション後、10分ごとにバッファを置き換えることにより、30分間× 1 PBTの幼虫をすすいでください。

6。マウントとディテールに秘められた幼虫の可視化

1. スライド上に幼虫をマウントする前に、（図を参照）上に座るためにカバースリップのための十分なスペースと、途中でマニキュアの縦の二重線を分散することでスライドを準備。完全に爪がマニキュア乾かします。
2. スライド上の縦のマニキュアの線（図を参照）との間のスペースに取付バッファのドロップを置きます。スライドは、現在マウントするための準備ができています。
   
   
3. 最後の1X PBTはリンスした後、静かに横方向のピンをはなします。キューティクルを引き裂くしないように注意してください。
4. 慎重に残りの2つのピンを削除し、ピンセットで幼虫をピックアップし、プレパラート上に水平に幼虫を置く。幼虫が裏返しと指向腹側が上されていないことを確認します。
5. ゆっくりと上にカバースリップを置き、マニキュア液（図を参照）でエッジを封印。幼虫は蛍光顕微鏡下で可視化するための準備ができています。
   

7。代表的な結果

図1：野生型larvから幼虫の分節神経の代表画像（CSP、Zinsmaier ら、1994）シナプス小胞のタンパク質のシステインの文字列の蛋白質に対する抗体を用いた。分節性神経がスムーズに染色されることに注意してください。バー=20μmの

図2：シナプス小胞のタンパク質のシステインの文字列の蛋白質 （CSP） に対する抗体を用いたモータータンパク質変異体の幼虫から幼虫の分節神経の代表的な画像 。分節性神経は、CSP（矢印）のために明るく染色大規模な集積を示すことに注意してください。

ディスカッション

ショウジョウバエ幼虫の分節の神経は軸索輸送のメカニズムを研究する強力なシステムです。第³齢幼虫の解剖が正しく行われている場合、このような筋肉やNMJsなどのCNS、PNS、および関連組織のすべてのコンポーネントは、単一の幼虫の中で調べることができます。我々はハードとサクストン（1996）によって発行されたものから、このプロトコルを適応している。このプロト?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20
Minutien Pins, Stainless Steel	Fine Science Tools	26002-10
Mcpherson-Vannas Straight Blade 8cm Scissors	Fisher Scientific	50822236
Vectashield, Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000
Sylgard 184 Silicone elastomer	Dow Corning	4026148
formaldehyde, 16%	Electron Microscopy Sciences	15710
dCSP3	Developmental Studies Hybridoma Bank
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG	Invitrogen	A-11004