冷预处理神经保护作用的研究策略

摘要

我们寻求定义冷预处理手段确定疗法的发展新目标，以保护脑损伤发病前的神经免疫信号。我们目前所做的这些工作需要的生物系统，实验操作，加上技术能力的高度重复性和敏感的战略。

摘要

神经损伤的发病率和死亡率的常见原因，从一般的麻醉和相关手术过程中，可以有效的发展缓解，易于管理和安全的预处理治疗。我们寻求定义冷预处理手段确定疗法的发展新目标，以保护脑损伤发病前的神经免疫信号。低级亲炎症介质，信号随时间变化的冷预处理神经保护作用是必不可少的。这个信号是一致的生理调节兴奋效应的基本原理，这就需要刺激性的刺激达到足够的时间适应保护的刺激阈值的大小，才能显现。

因此，在冷预处理神经保护作用的免疫信号划分要求，生物系统和实验操作，再加上技术能力的高度重复性和敏感。我们的做法是使用作为海马脑片培养，在体外模型，密切反映他们在与多突触的神经网络，成熟的和静态的胶质细胞/小胶质细胞的影响体内同行。小胶质细胞胶质状态尤为重要，因为它们的细胞因子的主要来源，这是femtomolar范围执行。此外，切片文化，可以在体外保持几个星期，这是足够的时间来唤起激活刺激和评估的适应性反应。最后，环境条件，可以准确地控制使用切片文化，使细胞因子信号寒冷的预处理可以进行测量，模仿，并调制，剖析关键的节点方面。细胞因子信号系统的分析需要使用的敏感和可重复性复用的技术。我们使用肿瘤坏死因子-α定量PCR，实时定量PCR定量阵列筛选，评估组织范围内的细胞因子变化的小胶质细胞激活屏幕。后者是一个最敏感的和可重复性的手段来衡量多个细胞因子系统，同时信号的变化。重大变化，然后有针对性的qPCR蛋白质检测证实。我们探头组织为基础的细胞因子蛋白复微流式细胞仪检测使用Luminex公司的技术变化。确定双标免疫组化细胞特异性细胞因子的产生。两者合计，这个脑组织编制和使用的样式，再加上建议的调查战略可能是一个确定发展的新型疗法，可以模仿冷预处理的优势的潜在目标的最佳途径。

研究方案

消毒和无菌技术的准备，维护和切片文化，长期使用的关键。此外，我们使用后，才18天的体外片文化的理由是基于证据，表明兴奋和抑制性突触传递，成为最成熟，神经胶质细胞（星形胶质细胞和小胶质细胞）成为静态和符合他们的同行在体内（图1 ）。

1。海马脑片培养的制备及维修

1. 当天的培养，平衡在1.1毫升的增长由50毫升基底中等鹰，25毫升厄尔的平衡盐溶液，23毫升马血清，0.5毫升Glutamax（200 mM的股票），0.1毫升庆大霉素（媒体无菌插入10毫克/ ML股票），Fungizone 0.4毫升，1.45毫升D -葡萄糖（45％（250微克/毫升）;共42毫米）。
2. 保持在一个孵化器的6孔托盘36 ° C，5％二氧化碳和95％湿度。
3. 最大的不育，培养的理想是做一个HEPA过滤正压与自足的紫外线空气洁净的球迷也可以通过净化了空气文化室，同时穿着干净的白大褂，无菌手套在实验室大衣袖子拉长。
4. 在BSL - 1层的通风柜，包括所有需要的材料（即McIlwain组织菜刀，有关特氟隆刀片，剃须刀切片刀片，夹层冷（3-4℃）板，外科手术工具，和解剖培养皿）准备切片文化使用通配符（M8）体视显微镜。
5. 允许的冷却板（从附近的水浴运行），以达到至少30分钟3-4 ° C的温度，而在同一时间夹层材料暴露在紫外线灯光下，进一步树立无菌的清扫面积和工具。
   1. 层流罩是定期测试，以确保紫外线有足够的权力，在短波紫外线测量仪表的桌面水平。
6. 使用幼鼠（P8 - P9〜23克/ EA从出生到10扑杀的窝。）与100％的背后通风柜和洁净的无菌板凳上的小动物中的碳在100％的乙醇浸泡内二氧化碳麻醉通风柜，所有后续步骤进行。
7. 杀头幼崽在一个100毫米培养皿的一半，并放置在下半场的头，使用新鲜菜每小狗。
8. 解剖大脑和它放入一个60毫米的Petri含盘的下半部10毫升无菌冷（3-4 ° C）Gey的平衡盐溶液与D -葡萄糖补充至6.5毫克/毫升（即7.5毫升45 ％D -葡萄糖Gey的每500毫升瓶装。
9. 从每个半球解剖海马和McIlwain菜刀放到聚四氟乙烯盘。传播媒体远离使用虹膜铲，以防止从坚持到切割刀片的切割脑切片脑组织。
10. 组的海马使用McIlwain菜刀，截面厚度在350-400微米其长轴垂直。
11. 轻快地洗新鲜切割片聚四氟乙烯插入到60毫米的Petri含冷（3-4 ° C）Gey 6.5毫克/毫升，使用一毫升移液器D -葡萄糖的平衡盐溶液。盘的上半部分
12. 检查一个完整的齿状回锥体细胞层的体视显微镜下切片。
13. 轻轻插入到一个地方最大的片（每插入和12片/ PUP）和维持正常孵化器的孵化条件下，每半年清洗，并用红外二氧化碳分析仪和温度计精确到小数点后一位的校准每三个月。
14. 在培养皿中的“刷新”生长介质在体外每3-4天使用BSL - 2的引擎盖和无菌技术。
15. 经过7天​​的体外 ，1.1毫升的无血清培养基（SFM），B27的2毫升，Glutamax 0.5毫升（200毫米），0.1毫升抗坏血酸（0.5米）和0.68毫升，97毫升Neurobasal取代媒体ð葡萄糖（占45％;共42毫米）。

2。屏幕前切片文化活力

1. 分装Sytox绿色股票（10μL）和储存在-20 ° C
2. Sytox股票稀释到500 nm，工作无血清生长介质中的浓度（即10μL100毫升媒体）。商店Sytox媒体在4 ° C，使用长达一个星期。
3. 将1.1毫升，每孔Sytox在6孔培养皿中，温至36℃时，5％二氧化碳足够的时间（即冷凝水的培养皿上缺乏证明）。
4. 同时，允许通过一个稳压电源供电的紫外线灯（即用FITC标记的过滤器，荧光光源），以确保均匀的光线强度至少20分钟的预热温度。
5. 将切片文化（18天在体外 ）在Sytox媒体为10分钟，然后回到可持续森林管理不可逆转的CA1区锥体层损伤屏幕。
6. 上5倍的放大倍率下观察，倒置显微镜无菌表面的文化。
7. 接受少于30 Sytox CA1区阳性细胞的培养。

3。冷预处理

1. 将1.1毫升的可持续森林管理在6孔培养皿中。允许冷却介质（例如，30℃）培养箱（5％二氧化碳和95％湿度平衡）在使用前至少20分钟。无凝培养皿表示有足够的​​时间，对于平衡发生。
2. 将切片文化插入冷却介质（1.1毫升/孔）保持在30℃孵育90分钟使用无菌技术在BSL - 2通风柜托盘。
3. 返回到正常的可持续森林管理，24小时正常孵化条件下，放置切片文化再次通过BSL - 2通风柜使用无菌技术。

4。兴奋毒性损伤

1. 开始暴露20分钟Sytox媒体的片文化实验使用预审。
   1. 收购保持在预审（背景图像）所使用的类似方向的切片个别切片图像。这是通过放置到左边的标记和两个标记的权利“10”和“两个”点记号笔在每个插入。这种机动方便使用同一地区图像的每一个文化感兴趣的形状。
2. 同时，打开紫外线灯源（根据稳压电源），并为20分钟，使他们温暖的温度最低的CCD相机。
3. 然后，一个fluoroscein标准校准的CCD相机。
   1. “清除”CCD暴露50个周期，除非是用于自动校准的CCD相机光。我们建立了一个程序内MetaMorph表明了我们冷静捕捉摄像头用于损伤量化。
   2. 将10μL的fluoroscein 90毫升PBS（10 mM磷酸盐缓冲液pH值在7.3，150 mM氯化钠）和旋涡。
   3. 吸取10微升到100微米深hemacytometer fluoroscein混合。
   4. 调整完整的图像强度四千〇九十六分之一千。
4. 收集切片文化背景的图像，以验证冷预处理没有造成伤害（即丢弃≥250感兴趣的强度CA1区域的文化）。
5. 准备与NMDA受体的媒体托盘。
   1. 准备10毫米NMDA原液，每周至少。
   2. 兴奋毒性损伤，淡化NMDA受体20 50μM在可持续森林管理和平衡至少20分钟的正常孵化条件。
6. BSL - 2的引擎盖和无菌技术，地方插入到NMDA媒体使用正常孵化条件下60分钟。
7. 冲洗插入NMDA受体三次在三个独立的60 mm培养皿，每片含10毫升Neurobasal加热到36 ° C浸渍每个插入每三个60毫米洗碗，不要使用超过三个插入。
8. 返回到正常孵化条件的文化。
9. 收集后24小时暴露于N​​MDA受体的损伤图像。
   1. 如上所述，校准相机fluoroscein标准。
   2. 在20分钟的Sytox媒体广场文化。
10. 定量损伤：
    1. 使用MetaMorph软件，周围绘制的AOI，CA1区。
    2. 测量强度“的伤害。”选定的区域
    3. 复制和粘贴的AOI从“伤害”，“背景”的形象。
    4. 输入到Excel中的“伤害”和“背景”的值。
    5. 定量“分子控制和冷预处理文化背景”。
    6. 使用统计软件（例如，SigmaStat），运行适当的统计测试，以比较实验组（S）与对照组，每个实验来说，应始终与包括的损伤。
    7. 注意：如果损伤水平低，在为期一天的受伤后的图像进行的实验，以两三天。由于缺乏一个容易受伤（图2），在文化保护可能被屏蔽。
    8. 注：“保护”的问题，促使我们移动到测量的损伤水平，不是所有的比较率（图3）。

5。联合治疗冷预处理中的应用

片文化的一个重要的优势是环境条件S可以准确地控制。这意味着细胞因子信号从寒冷的预处理可以进行测量，模仿，并调制，剖析关键的节点方面。

1. 重组（例如，激动剂）蛋白质中和（如抗体或可溶性受体）的蛋白质，可以用来模仿和调制，分别，细胞因子信号。
2. 在一般情况下，这些蛋白质是改组，并储存在-20 ° C等分6个月内使用，以确保足够的生物活性。
3. 在这里，我们描述模范使用TNF -α信号使用可溶性肿瘤坏死因子受体1（sTNFR1）的废除。
   1. 重组sTNFR1在0.1％的牛血清白蛋白的PBS股票的50微克/毫升，在20-50微升金额等份，并储存在-20 ° C
   2. 如需使用，稀释sTNFR1，以200毫微克/毫升片文化的生长介质加热到36 ° C和sTNFR1媒体切片冷预处理前20分钟的文化。
      1. 注意：为了减少方差，最好是在生长介质的大量稀释200毫微克/毫升sTNFR1（即1:250稀释，从50微克/毫升10毫升培养基中sTNFR1股票需要40微升sTNFR1）加入sTNFR1直接在盘，每孔（4.4μL每1.1毫升媒体）。
   3. 稀sTNFR1，以200毫微克/毫升媒体和地方以及在每个插入的1.1毫升。允许媒体平衡至30℃，至少20分钟才暴露90分钟片文化冷预处理如上所述。
   4. 广场切片文化早在36 °与sTNFR1目前在媒体。
   5. 24小时后，揭露文化Sytox媒体为20分钟如前所述，收集验证冷预处理没有伤害文化背景图像。
4. 定量如上所述的数据。
5. 刷新媒体与组件的每一个在体外培养3-4天。

6。直接和延迟冷预处理后的兴奋毒性损伤

1. 立即用冷水预处理损伤。
   1. 执行冷预处理如上所述。
      1. 冷预处理后，文化回归到正常的潜伏期为20分钟。
      2. 然后，让文化为20-50微米的NMDA损伤为一小时。
      3. 冲洗文化三个以上所述，并返回到正常孵化。
      4. 24小时后，收购受伤的照片，如上面所述。
2. 冷预处理的延迟效应。
   1. 执行冷预处理如上所述。
   2. 使文化NMDA损伤24小时后，如上所述。
   3. 继续收购损伤图像三天后最初的冷预处理监测保护。

7。 RNA分离

以下的基因表达程序缩小为一个片文化。

1. 从生长介质和正常孵化转移切片文化于6孔培养皿3毫升RNAlater RNA的稳定。在4 ° C储存长达三天，直到如下方式进行处理。
2. 轻轻抬离插入罚款尖刷油漆和1毫升冷切片文化（4℃），PBS在1.5毫升（脱氧核糖核酸酶，核糖核酸酶和DNA的自由）的离心管。
3. 离心样品30秒和删除PBS上清。
4. 商店的样品在-80 ° C
5. 为了隔离片文化（〜250毫微克/ EA），冰解冻样品的RNA。
6. 分离的RNA，进一步详细描述和改编的RNeasy微型手册（QIAGEN）通过下列程序使用Qiagen公司MicroRNeasy套件。
   1. 广场350μL缓冲RLT（含10μL，每毫升的β-巯基乙醇）到每个离心管包含一个片文化。
   2. 均质样品30秒震荡。磨碎的组织，如果有必要（例如，组织颗粒仍清晰可见）使用一次性杵，直到完全缓冲的RLT匀浆。
   3. 将350μL，70％的乙醇混合裂解液混合和吸管。
   4. 匀浆液转移到一个旋转列和集合管的地方（Qiagen公司提供的离心柱和收集管）。
   5. 离心机最大速度为15秒的样本。保留之列。
   6. 加入350μL缓冲液RW1加上15秒的最大速度离心清洗离心柱。丢弃的缓冲区。
   7. 稀释10μLDNA酶我RDD的收益率80μL总体积70μL缓冲存量。移液器轻轻地混合，不要旋涡振荡。准备80μL稀释的DNA酶，每样本股。在室温下孵育30分钟。
   8. 加入350μL缓冲液RW1样品离心柱和离心15秒。倒掉收集管中。
   9. 使用一个新的收集管，加入500μl缓冲的RPE样品离心15秒，并丢弃缓冲区。
   10. 将500μL的样品离心2分钟，80％的乙醇。倒掉收集管中。
   11. 干燥离心5分钟，最大速度与管盖打开，丢弃收集管，离心柱转移到1.5 mL收集管套件提供的离心柱。
   12. 要搜集的离心柱膜的中心分离出的RNA，14μL，无RNase水。 1分钟，离心，收集液。
   13. 添加2μL，RNasin（1 U /μLTE缓冲液稀释），并储存在-80 ° C TE缓冲液pH值在8.0，为1mM EDTA（乙二胺四乙酸二钠水合物）10毫米三（三[羟甲基]氨基甲烷）。

8。 RNA定量

1. 注意：RNasin不干预RiboGreen检测。
2. 在无RNase的TE缓冲液稀释RiboGreen 1:200如下。
   1. TE（毫升）：1; Ribogreen（微升）：5;
   2. TE（ML）：4; Ribogreen（μL）：20;
   3. TE（ML）：6; Ribogreen（μL）：30。
3. RNA标准如下准备。
   1. 酵母tRNA作为RNA的标准。 tRNA的是保存（-20℃）为1毫克/毫升TE缓冲液中。
   2. 在TE缓冲液稀释1毫克/毫升股票1:100，使用（脱氧核糖核酸酶，核糖核酸酶和DNA的自由）1.5毫升离心管中产生1μg/ mL的标准工作。
   3. 加入TE缓冲液稀释液第一，然后加入适量1μg/ mL的标准已经在板井的TE缓冲液中，在相邻的表格所示，准备直接在96孔荧光检测板的标准曲线。复制井，每个标准如下。
      1. 卷性病。 （微升）：100;卷。 TE（uL）：0;在良好的RNA（NG）：100;
      2. 卷性病。 （微升）：80。 TE（μL）：20;在良好的RNA（NG）：80;
      3. 卷性病。 （微升）：60。 TE（μL）：40;在良好的RNA（NG）：60;
      4. 卷性病。 （微升）：40;卷。 TE（μL）：60;在良好的RNA（NG）：40;
      5. 卷性病。 （微升）：20;。 TE（μL）：80;在良好的RNA（NG）：20;
      6. 卷性病。 （微升）：0;卷。 TE（uL）：0;在良好的RNA（NG）：0。
4. 该试剂盒是准备如下。
   1. 99μLTE缓冲液中加入96孔板的样品孔。做到这一点，最有效的方法是使用多通道移液器。
   2. 加入1μL的RNA实验样品井。
   3. 加入100μL稀释RiboGreen每口井用多通道移液器和磨碎与一个或两个招移液器。
   4. 阅读上的荧光酶标仪，在480 nm激发和520 nm发射板。
   5. 构造一个使用Microsoft Excel中的RNA标准测定荧光强度标准曲线。
   6. 产生的线性方程组样品的标准曲线计算RNA浓度。

9。 SYBR GREEN定量PCR

1. PCR程序，最好在专门工作与RNA（图4）保留一个干净的面积。
   1. 除污区及相关实验室设备从潜在的DNA污染和紫外线，10％的漂白粉或核糖核酸酶客队前使用RNase活性。
   2. 穿境的所有程序手套。
   3. 核糖核酸酶自由水与试剂盒提供的所有程序。不要使用用DEPC（焦碳酸二乙酯）处理过的水。
   4. 关闭所有PCR相关管后立即使用，以延缓外源DNA的气溶胶污染。
2. 制定和表征利益的目标（S）的mRNA的引物。这些方法的详细补充方法赫尔斯等，神经科学杂志^，2008 13 。
3. 是从30-200纳克的总RNA使用iScript通过反向转录的cDNA。
   1. RNA的数量开始的选择是由RNA的总额与执行RT - PCR分析一个样品的部分（即总数的10％-20％）的目标。
   2. 其余的较大部分的RNA保存，供日后分析。
   3. iScript试剂盒采用的随机六聚体和寡聚DT引物混合，而修改后的MMLV逆转录酶在20μL总体积。
   4. 反向转录收益为25 ° C下30分钟，42℃50分钟，和逆转录随后变性85 ° C 5分钟。
   5. 在TE缓冲液稀释的cDNA的终浓度为0.4纳克/μL相对起始RNA的数量。
4. SYBR绿色PCR技术为基础的策略是用于扩增的cDNA。
   1. PCR反应的实时监测，通过监测SYBR GREEN纳入。
   2. 50μL的反应包含3毫米氯化镁_{2，200μMdNTPs，}正向和反向引物各15 pmol，1微米的荧光SYBR绿色染料，1，10μL（4纳克）切片文化的cDNA，和1.25 ü白金的Taq聚合酶反应50毫米KCl和10毫米三，8.3 pH值的缓冲区组成。
   3. PCR是使用iCycler热循环仪，可以实时地收集数据。
   4. 骑自行车的参数包括15秒30秒退火/延伸（60℃），重复45次变性（95℃）。
   5. 在退火/延伸光学测量和CT值测定使用iCycler系统软件。
   6. 因子的兴趣和β-肌动蛋白目标的cDNA用于构建标准曲线。
      1. 确定分子量和质量的质粒基因的拷贝数。
      2. 拷贝数/质量的标准曲线的构造，其中包括在每个检测。
      3. 每个基因稀释的CT值用于确定复制数量诉CT曲线。
   7. 细胞因子和β-肌动蛋白的拷贝数水平确定使用标准曲线的样品。

10。定量PCR微阵列

实时定量PCR定量阵列筛选是一个高度敏感和重复性的手段来探测低层次的炎症介质表达的变化。

1. RT2的探查PCR SABiosciences阵列用于炎症介质基因表达的变化，与制造商进一步详细描述以下步骤。
2. 该试剂盒采用0.1-1.0微克的RNA。我们用当地片地区（例如，CA1区，提供从两个样品汇集〜250 ng的总RNA）或整个包含一个类似数额的总RNA的单片。
3. 使用第一链套件（例如，＃C - 03），样品和控制的RNA反转录成cDNA。
   1. 由此产生的基因是与基于SYBR GREEN - PCR混合物（＃PA - 011）和25μL到每个PCR阵列板（测量84种独特的实验性基因和16个管家基因）的96口井aliquotted混合。
   2. 准备一个阵列板为实验样品，第二个板块是控制编制。
   3. 注：SYBR GREEN主制造商提供的混合是具体的热循环。
4. 热循环使用40周期的一个15秒的变性步骤组成的协议，在95 ° C ° 60一分钟的延伸C.一个iCycler光学数据被收集在延长步骤。其次是扫描55-95 ° C温度范围在0.5 ° C增量的熔解曲线分析热循环。
5. 相对表达基因治疗组和对照板使用2 - ^ΔΔCT方法，使用所提供的基于Excel软件，并表示作为倍相对于对照组的增加或减少。
6. 与2倍的增加或表达减小基因被认为是为进一步的评估。
7. 确定PCR阵列筛选（例如，使用冷预处理＃PARN - 011A）的基因是进一步confirmeD使用的qPCR。
   1. PCR阵列确定哪些基因在对刺激监管。
   2. 在寒冷预处理的例子，我们发现IL - 11基因，为积极响应冷预处理监管。
   3. 在分析的下一步是，以确认新发现的基因是在使用上面详细的定量PCR检测的切片文化的监管。

11。复用微球的流式细胞仪蛋白质组学含量

1. 公开切片文化冷预处理如上所述。
2. 总蛋白测定的收获片文化。
   1. 轻轻抬起关闭插入片使用1毫升冷罚款尖刷和地点（4℃），PBS。
   2. 离心管和删除PBS断片文化。干冰的地方，直到收获完毕。
   3. 店管在-80 ° C。
3. 均质执行总蛋白测定的切片培养标本。
   1. 准备同质化的细胞裂解液。
      1. 按照制造商的指示（BIO - RAD），至5 mL裂解缓冲液中添加蛋白酶抑制剂和冰预留。
   2. 广场100μL裂解缓冲片上的文化和搅拌片向上和向下与100μL枪头吹打五倍剖开到1毫米。
   3. 摇板振动筛上的样品，在4 ° C 20分钟。
   4. 在15分钟13000转离心样品在4 ° C。
   5. 上清转移到一个干净的试管和冰预留。
4. 执行总蛋白测定。
   1. 准备BSA（牛血清白蛋白）的蛋白质标准。
      1. 重组与超纯水股票BSA的根据制造商的指示。
      2. 准备蛋白质标准范围0-1000微克/毫升，在裂解液稀释。
   2. 计算的工作需要根据试剂盒说明书的试剂量。
      1. 例如，（八个标准+ 18未知样品）×（两个重复）×（200μL的工作每个样品所需的试剂）= 10.4毫升的总量的工作需要加载到一个96孔（例如，微流式细胞仪测定试剂，见下文）。
      2. 当混合试剂与试剂B，一些浊度可能发生，但应该会消失不久。
   3. 加载到微孔板10μL标准品和样品。
   4. 装入井工作试剂0.2毫升。
   5. 盖封箱胶带微孔板和摇板振动筛为30秒。
   6. 微孔板孵育在37 ° C为30分钟。
   7. 酷微孔板室温（约10分钟），然后在595 nm波长酶标仪上读取。
   8. 构造一个使用Microsoft Excel中的BSA标准测得的吸光度的标准曲线。
   9. 产生的线性方程组样品的标准曲线计算蛋白质浓度。
      1. 所有样品稀释裂解液和储存在-80 ° C测量的最低浓度
5. 执行单丛和复用因子组织（或液体）的检测，在引用＃12和16的完整详细的概述。

12。免疫组织化学

1. 修复PLP固定液为24小时，10毫升16％多聚甲醛组成的文化，1.096克赖氨酸磷酸钠，0.42克和0.17克的高碘酸钠，填补了80毫升的总量，用超纯水（固定液6.2 pH值）。
   1. 我们发现，PLP固定液是一个温柔的固定液，允许低水平的免疫，否则不会明显使用其他固定剂检测。
   2. 文化是固定的24小时，然后用细刷用含叠氮化钠（100毫克/升）的转移。
2. 浮动一整片文化的明场免疫完成耦合摇晃〜50 RPM的所有步骤如下。
   1. 3毫升PBS洗3次10分钟洗净切片文化。
   2. 淬火0.3％H _{2 O 2}片文化。
      1. 稀PBS中30％的H ₂ O _2的原液。
   3. PBS洗3次，每次10分钟洗净切片文化。
   4. 座片在室温下培养3毫升堵在6孔钢板组成的山羊血清10毫升，0.75毫升TRITON X - 100，和89.25 mL的PBS溶液中一小时。
      1. 血清封闭液应来自同一品种在二级抗体提出。
   5. 孵育切片培养初级抗体过夜封闭液稀释后在4 ° C
      1. 初级抗体溶液的最大音量小玻璃耐热盘井应为0.3 mL更高的产量往往运行在板块的边缘。
      2. 在加湿的密闭容器中放置的菜。我们不盖的碟壁膜，可能是因为部分纺上覆薄膜和进一步workup丢失。
      3. 调整摇板摇床速度，只是不够高，在抗体溶液分发片。
   6. 从玻璃板取出切片和在PBS洗三次，每洗10分钟。
   7. 孵育一小时的片二级抗体在室温下一阵晃动。
      1. 使用小玻璃耐热菜负荷为0.3 mL二次抗体溶液。
   8. 在PBS清洗，每洗10分钟三次。
   9. 可视化与3' -二氨基联苯胺（DAB）染色。
      1. 在3 mL二甲基亚砜溶解30毫克民建联。
      2. 民建联过滤器使用54毫升PBS 2＃1滤纸和洗。
      3. 使用前，加入20μL30％H _{2 O 2。}
      4. 民建联在室温下5-7分钟的解决方案，孵育文化。
      5. 注：民建联是一种致癌物，必须妥善处理。所有民建联的解决方案在处理存储在通风橱中的一个显着的容器，漂白剂溶液中的所有地方菜停用民建联。丢弃所有民建联的解决方案最终应通过机构的安全办公室。
   10. PBS洗3次，每次10分钟，洗净切片文化。
   11. 湿贴装片文化明胶（或硅烷）溶解于蒸馏水中，用100μL菜肥皂涂幻灯片。在室温下干燥过夜。
       1. 避免使用幻灯片加热器过热，可能会导致在安装到幻灯片的文化开裂。
   12. 通过梯度乙醇脱水系列（50，75，95，95，100，100％）为每个30秒的幻灯片。
   13. 清除幻灯片用二甲苯4次，每次十个分。
   14. 使用玻璃巴斯德吸管，0.1毫升的幻灯片上安装的媒体，轻轻盖玻片，以避免气泡形成。在室温下干燥过夜。
3. 荧光免疫。
   1. 片文化节20微米厚的使用一个低温恒温器。
      1. 低温恒温器的设置调整到-16 ° C的内部温度和-12 ° C的物体的温度。
      2. 将少量的水对金属夹头使用巴斯德吸管和干冰冻结。
      3. 应用组织冷冻夹头的顶部TEK媒体的薄盘层。
      4. 允许夹头冻结和低温恒温室的温度平衡。
      5. 节组织TEK媒体创建一个扁平的表面适合铺设片文化平坦。
      6. 注意夹头的方向，而切片，切片，以防止脱落夹头的安装媒体提供一个一致的角度。
      7. 冻结时，夹头，并放置在一个持有人。使用金​​属锅铲和一个细尖的油漆刷，滑入锅铲一片文化和转移到夹头组织TEK媒体的平面层中间。
      8. 放置至少10分钟的安装切片文化和冷冻室的温度比一层薄薄的组织TEK媒体。
      9. 随着“修剪”按钮被激活，部分直到组织切片文化TEK媒体的上层是可见的。
      10. 切换到“节”预设在20微米，“微调”。
      11. 明胶涂层的幻灯片，室温和干燥的幻灯片过夜20微米的部分。
      12. 组织TEK媒体将在幻灯片上看到，但在PBS洗涤溶解。
   2. 免疫染色。
      1. PBS洗3次，每次10分钟，洗净幻灯片。
      2. 淬火在0.3％H _{2 O 2}在室温为15分钟，摇。
      3. PBS洗3次，每次10分钟，洗净幻灯片。
      4. 使用SFX信号增强器，适用于直接在组件在加湿室内温度在室温30分钟的幻灯片和孵化的部分路段上几滴。
         • 与组件孵育取代10％山羊血清，在明亮的领域免疫组织化学进行的解决方案阻止一步。
      5. 初级抗体的孵育幻灯片在0.75％稀释海卫PBS中的X - 100为两个小时，在37 ° C。
         • 初级抗体溶液直接应用到幻灯片的顶部和湿盒中孵育，以防止水分蒸发。
         • 不要只用PBS和Triton X - 100的，包括在任何抗体的解决方案血清。
      6. PBS洗3次，每次10分钟，洗净幻灯片。
      7. 在二抗孵育一小时，在室温下，由轻保护的幻灯片。
         • 离心20分钟进入的抗体解决方案，以防止任何聚集所有的荧光抗体。
         • 使用0.75％海卫在PBS X - 100的准备抗体稀释。
      8. PBS洗3次，每次10分钟，洗净幻灯片。
      9. 浸入蒸馏水一次幻灯片，从PBS洗盐。
      10. 在室温下过夜，干幻灯片覆盖避光。
      11. 盖玻片幻灯片延长抗淬灭媒体。
          • 在5-10秒微波解冻组件A和加入约1毫升小瓶的组件B.混合在一起使用Pastuer吸管，小心解决方案引入气泡。
          • 最大速度为5分钟，离心去除气泡。
          • 延长媒体应用的一层薄薄的幻灯片使用一个Pastuer吸管，小心，以避免产生任何气泡。
          • 轻轻将盖玻片，在上面的幻灯片和干通宵，涵盖了从避光。
      12. 双标荧光免疫染色（图5）。
          1. 如上所述，除稀小学的抗体，在相同的孵化解决方案，进行荧光免疫染色。
          2. 稀释同一解决方案中的所有二级抗体孵育如上所述。
          3. 串行的潜伏期，使用两种抗体导致削弱免疫。

13。代表性的成果

图1。海马脑片培养和小胶质细胞的外观 。左手图像显示了一个典型的成熟（ 即，在体外培养21天）的海马脑片培养与NeuN（绿色）染色来说明主要的神经元细胞结构。锥体神经元在地区CA1和CA3和凹痕吃回（DG）神经元的左边。比例尺为250微米。右手图像是来自CA1区，并显示在更高的功率，来说明在成熟的切片文化静态的小胶质细胞的分支质量。细胞标记的小胶质细胞的表面标志，CD11b的。比例尺为50μm。

图2。冷预处理海马脑片培养的神经保护作用。文化孵育Sytox绿，荧光标记的死细胞标记。最上面一行显示深水控制文化和底行显示暴露至28℃，90分钟的片。左手，前屏幕上的图像显示没有CA1区损伤。相对损伤的色彩校准规模是在左上的形象。中间一排的图像显示24小时后，接触到20微米的NMDA相对切片文化损伤。请注意，假控制伤害大于暴露于冷预处理（CP）的文化。传统，文化，然后接触到20微米的NMDA过夜，以最大限度地提高CA1区神经元损伤的水平和相对损伤CP诉深水，伤害/最大伤害的比例注意到。然而，暴露的最大伤害刺激可能不足以克服预处理的神经保护作用。因此，使用伤害/最大伤害的比率可能无法准确反映预处理神经保护作用。在图像显示CP的最大水平低于深水控制的右手，这是显而易见的的。

图3。示意图说明使用初期，第一天测量定量损伤水平的效用冷预处理实验 。如上所述，我们发现，使用比率（伤/最大伤害）可能掩盖冷预调节神经保护作用。这可以看出，从原理图到假伤以红色显示的左边和后，以蓝色冷预处理。一天后，NMDA受体暴露冷预处理，显示了一个相对的“3”伤害诉深水（“5”）控制的水平，与40％的神经保护作用是一致的。但是，如果使用传统的格式，使用比率（即伤害/最大伤害），起不到保护作用是显而易见的[即（5 / 10）= 50％为假诉（3 / 6）= 50％冷预处理]。

图4。 Typial定量PCR结果显示，上曲线的RNA拷贝数进行PCR放大显示控制（蓝色）和实验样品（红色）诉循环阈值。较低的图像显示了典型的四个样本（黑色，绿色，黄色和紫色）​​放大型材。请注意后者的CT阈值周期（橙色线标出）发生在26.0，29.5，31.0和32.5。

图5。使用双标记免疫定量PCR和定量PCR阵列结果证实切片文化IL - 11（红色）和NeuN（绿色标记神经元）处理。探测细胞表达的IL - 11的基因位点。请注意，一些锥体神经元（箭头）显示IL - 11和NeuN染色（黄色），而一些较小的细胞（箭头），推定为星形胶质细胞，显示只增加IL - 11染色（红色）。

讨论

两个极其重要的概念，重要的是参与冷预处理神经保护作用的细胞因子信号系统的划分是在图6和7所示。首先，细胞因子的浓度极低，在正常脑组织中的信号分子。然而，生理细胞因子浓度的变化有一个巨大的可能改变大脑结构和功能（即表型），因为他们有能力改变基因的表达（图6）。此外，细胞因子是高度冗余和多效性，多种细胞因子，可以有类似的效果，和一个单一的细胞因子可以变量的影响（图7）。因此，要准确地建立先天的神经保护作用的细胞因子冷预处理（或其他生理预处理刺激），必须确定相关的信令变量的综合分析基地。这是通过复用检测策略。这将建立的“签名”冷预处理神经保护作用的细胞因子。

图6。脑细胞因子信号的电源 。插图传达巨大的信号的脑细胞因子的生理浓度的力量，相比其他公认同行的浓度。浓度表示为距离的倒数，作为参考点的单猫须开始。钠（10 ^-1 m的一粒胡椒说明）和钾（10 ^{-3 M}说明了一个西红柿）是在约150个和3毫米，分别的水平间质性脑空间，并有公认角色神经细胞的电生理功能。同样，pH值（即〜10 ^-7 m层的氢离子和780米沿芝加哥的湖畔所示）和钙（即〜10 ^-8看到7.8公里，从谷歌卫星图像沿着芝加哥的麦考密克湖畔看到的水平地点在海德公园附近的芝加哥大学岬点）。此外，这些浓度间质空间释放的神经递质影响当地的大脑区域的活动。与此相反，细胞因子（从地球到火星的距离显示），可以改变浓度的脑功能少十几万次。

图7。互动信号与生俱来的细胞因子的途径。细胞因子是高度冗余，多种细胞因子多效可以有类似的效果，可以有一个单一的细胞因子变量的影响。这种多样性源于复杂的交互信号配体，受体和磷酸化水平发生。事实上，大脑的不同类型的细胞，每个先天细胞特异的细胞因子，受体，和相关的磷酸化变化的能力，组成更加复杂源于。这里说明的目的，只有天生的细胞因子信号转导通路（从免疫细胞研究中派生）所示。为了简便起见，绘制大脑是作为一个单一的细胞显示出与生俱来的细胞因子的潜在的相互作用（白线）（IL -1α和IL -1β（这里​​称为IL -1α/β），肿瘤坏死因子-α，IL - 6，干扰素γ和IL - 10），受体（IL - 1R1，TNFR1，IL-6/gp130，IFNγR，和IL - 10R）和磷酸化（即，P38（P38 - MAPK）和JNK激酶ERK1 / 2）和转录因子（ATF - 2，NFκB，和STAT3）。例如，TNF -α信号通过TNFR1 JNK，P38 MAPK和ERK1 / 2，从而引发通过ATF - 2基因的表达。 TNF -α也可直接通过改变基因表达NFκB的激活。总之，这些转录因子的激活唤起增加（箭头）和下降（钝端）所示的细胞因子及其受体的表达。更重要的是，这些途径表明，在一个细胞因子的变化（如TNF -α）的影响其他细胞因子（如IL -1β）的生产。因此，建立准确的冷预处理，必须确定相关的信令变量的综合分析的细胞因子神经保护基地。这将建立先天的“签名”冷预处理的细胞因子。 （图片编制的数据参考＃25。）

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂/设备名称	公司	目录/型号	评论
Millicell小CM组织培养插入（30毫米）	赛默飞世尔	PICM0 - 3050
基础培养基鹰	Invitrogen公司	21010
厄尔s平衡盐溶液	西格玛	E2888
马血清	Invitrogen公司	26050-088
Glutamax	Invitrogen公司	35050
庆大霉素	Invitrogen公司	15710-064
Fungizone	Invitrogen公司	15295
D -葡萄糖	西格玛	G8769
BSL - 1通风柜	面包师傅
McIlwain组织菜刀	布林克曼
特氟隆磁盘	布林克曼	023-49-310-1
抹刀	赛默飞世尔	14 - 373 - 25A
弧形光圈剪刀	精细科学的工具	14091-09
长直剪	精细科学的工具	14002-14
长钳	赛默飞世尔	13-812-40
斜角钳	精细科学的工具	11808-02
短钳	赛默飞世尔	13-812-38
＃5 Inox公司钳	精细科学的工具	11254-20
2虹膜铲刀	精细科学的工具	10094-13
150 × 15毫米培养皿	赛默飞世尔	08-757-148
60 × 15毫米培养皿	赛默飞世尔	08 - 757 - 100B
野生M8的体视显微镜	野生Heerbrugg
Gey的平衡盐溶液	西格玛	G9779
Blak -射线短波紫外线测量仪	UVP	J - 225
6猎鹰培养皿	赛默飞世尔	08 - 772 - 1B
Neurobasal	Invitrogen公司	21103
B27的补充	Invitrogen公司	17504
Gem21 Neuroplex	双子座生物制品	400-160-010
抗坏血酸	西格玛	A4544
CO 2分析仪	巴哈拉赫	＃2820

试剂/设备名称	公司	目录/型号	评论
Sytox绿	Invitrogen公司	S7020
DMIBRE倒置显微镜	徕卡

试剂/设备名称	公司	目录/型号	评论
BSL - 2通风柜	NuAire

试剂/设备名称	公司	目录/型号	评论
CoolSnap FX CCD相机	Photometrics
Fluoroscein	Invitrogen公司	F36915
MetaMorph软件	分子器件	五，04年7月5日
100微米深hemacytometer	Hausser科学
N -甲基- D -天冬氨酸	Calbiochem	454575
SigmaStat软件	SYSTAT软件公司	诉3.5

试剂/设备名称	公司	目录/型号	评论
sTNFR1	R＆D系统	425 - R1 - 050
牛血清白蛋白	西格玛	A - 4503

试剂/设备名称	公司	目录/型号	评论
RNAL ATER	Ambion公司	AM7021
微的RNeasy试剂​​盒	Qiagen公司	74004
β-巯基乙醇	费舍尔	03446-100
Diposable 1.5 RNase的免费杵	南泽西精密工具和模具公司	749521-1590
RNasin	Promega公司	N261A
三羟甲基]氨基甲烷	西格玛	T3069
EDTA（乙二胺四乙酸二钠水合物	西格玛	＃E7889

试剂/设备名称	公司	目录/型号	评论
RiboGreen含量	Invitrogen公司	R11491
酵母tRNA	Invitrogen公司	15401-011
1.5 mL离心管	美国科学	16155500
96荧光检测板	NUNC	DK - 4000
96孔荧光酶标仪	TECAN	沙费尔二

试剂/设备名称	公司	目录/型号	评论
iScript反向转录试剂盒	Bio - Rad公司	170-8891
SYBR GREEN	Invitrogen公司	S7563
白金Taq聚合酶	Invitrogen公司	RNA的Ultrasense 11732-927
iCycler热循环仪	Bio - Rad公司	iCycler光模块
iCycler系统软件	Bio - Rad公司	诉3.1

试剂/设备名称	公司	目录/型号	评论
核糖核酸酶客队	分子生物产品	＃7000
RT 2第一链套件	SABiosciences	C - 03
基于SYBR GREEN - PCR混合物	SABiosciences	PA - 011	特定iCycler
RT 2探查PCR阵列	SABiosciences	PARN - 011A

试剂/设备名称	公司	目录/型号	评论
细胞裂解试剂盒	Bio - Rad公司	171-304011
离心	Fisher Scientific则	微型7
BSA的蛋白质股票	Bio - Rad公司	500-0007
BCA蛋白检测试剂盒	Thermo Scientific的	23225
免疫96微孔板	NUNC	449824
密封胶带	Bio - Rad公司	2239444
96孔板读者	Perkin Elmer公司	1420 - mulilabel柜台
Bioplex大鼠肿瘤坏死因子-α细胞因子的测定	Bio - Rad公司	X0000001T

试剂/设备名称	公司	目录/型号	评论
16％多聚甲醛	阿法埃莎	43368
赖氨酸	西格玛	L - 6001
磷酸钠	Fisher Scientific则	S374 - 1
高碘酸钠	西格玛	S - 1878年
叠氮化钠	西格玛	S - 2002
过氧化氢（30％）	西格玛	H1009
山羊血清	科罗拉多州的血清公司	CS 0920
TRITON X - 100	西格玛	T - 8787
染色菜	特德佩拉公司	14511
板振动筛	实验室线仪器公司	3520
＃1滤纸（185毫米）	瓦特曼	1001-185
3,3 - 二氨基	西格玛	D8001
二甲基亚砜	西格玛	D8418
乙醇	Pharmco - AAPER	111000200
二甲苯	Fisher Scientific则	X3S - 4
Permount安装媒体	Fisher Scientific则	SP15 - 100
低温恒温器	徕卡	厘米3 050小号
组织Tek的	特德佩拉公司	2705​​0
细尖的油漆刷	特德佩拉	11806
人民行动党堵笔	特德佩拉公司	22309
SFX信号增强器	Invitrogen公司	A31631
延长抗淬灭	Invitrogen公司	P7481