微机械动态细胞培养平台

摘要

在这个协议中，我们展示的微驱动器阵列的垂直流离失所该技术是基于职位的制造，以及如何可以修改此基础技术，进行二维和三维培养高吞吐量的机械动态细胞培养范例。

摘要

在体外细胞组织工程，药物发现或基本的细胞生物学研究的mechanobiological刺激组合系统探测能力由目前的生物反应器技术，它不能同时适用于各种培养细胞的机械性刺激是有限的。为了解决这个问题，我们已经制定了一系列旨在为机械刺激的影响画面在高通量格式的微型平台。在这个协议中，我们展示了微驱动器阵列的垂直流离失所的技术为基础，进一步展示如何可以修改此基础技术进行高通量的机械动态细胞培养两种维和职位的制造三个立体养殖的范例。

研究方案

A.设备的描述和操作

设备都采用多层软光刻技术^1，在聚二甲基硅氧烷（PDMS），能够同时产生一系列机械在单个细胞的微阵列跨文化地点条件。在这个协议中，首先描述的步骤来制作气动驱动microposts的阵列，步骤来修改设备，使机械动态二维（2D）和三维（3D）的文化范式文化。概述了微加工方法增加吞吐量比现有的宏观系统，适用于各种机械条件的影响，是最好的筛选。

设备的工作原理是基于垂直驱动的microposts阵列。 Microposts制造一个自由悬浮隔膜，并提出和下方的驱动隔膜（图1）申请的正面和负面的压力降低。数组的一个主要特点是一个单一的压力源，通过改变驱动隔膜的大小，可以用来获得一系列跨阵列的垂直位移。这个原则是用来迅速屏幕上的跨越单一设备的机械刺激条件下，大量的细胞反应。

谢弗等人。一个类似的宏观设计的基础上，我们的设计，包括第二次暂停和润滑的较后的细胞培养膜，使细胞的经验作为文化电影滑倒在提出的加载后的2D基板变形。另外，photopatterning在装载员额细胞载货凝胶的数组允许压刺激细胞的三维培养。设立这些系统的详细说明如下。

B.制造的气动微驱动器阵列

编造气动微驱动器阵列，需要在PDMS的多层结构的严格对齐。这是具有挑战性，由于收缩引起的对齐登记错误。为了解决这个问题，我们使用一个制造过程称为“夹心模具制造^”，有效地消除这种问题^4。

材料的制备

1. 单或多级SU - 8各级大师制作在洁净室使用的标准程序。对于这些设备，船长200-400微米厚，根据不同的应用。船长hardbaked在80 ° C时3天前使用。
2. 清洁玻片和SU - 8的主人是在真空室中，以防止硅烷固化硅橡胶材料的附着力。在通风柜，60μL硅烷代理（tridecafluoro - 1 ,1,2,2 - tetrahydrooctyl）- 1 -三氯硅烷（美国化学技术，布里斯托尔，PA）是吸管成在会议厅内的培养皿。裸露的玻璃和SU - 8的主人放置在会议厅内，并在真空条件下过夜。
3. 两个泡沫垫（可在工艺用品商店）和开销喷墨透明胶片切割尺寸稍大比夹心模具制造所使用的SU - 8的主。

夹心模具制造

1. 每一层的多层设备需要使用此方法成型的硅橡胶层。夹心模具制造过程的示意图如图1。
2. PDMS的单体和交联剂彻底混合在标准的比例为10:1。 3毫升固化的硅橡胶混合物沉积到以前捏造的SU - 8的主，并在一个真空室脱气。
3. 泡沫垫和SU - 8的主，被放置在一个有机玻璃底座。
4. 透明度是仔细降低到未固化硅橡胶，一定要避免捕获任何气泡。喷墨透明胶片有一个粗糙和光滑的一面，重要的是，光滑的一面接触到未固化的硅橡胶。
5. 甲硅烷载玻片放置在顶部的透明度，第二个泡沫垫和一个有机玻璃顶板下方。三明治，然后使用C钳钳制在一起。
6. PDMS夹心固化烘箱中在80 ° C至少4个小时。
7. 三明治是从烤箱中删除，并让其冷却后再取出钳。
8. 钳夹心拆解，被丢弃的泡沫垫。从SU - 8的主透明度仔细剥离，保留图案的PDMS薄膜。
9. 这些图案的PDMS层和其处理的透明度层可以存储在一个无尘的环境中中，直到他们准备使用。我们已经成功地使用硅橡胶层达两个月之久，没有明显的有害影响。

构建多层设备

T“>的微驱动器阵列的制造原理是在图2A，和编造的设备执行机构的运作是在图2B和C所示：

1. 最下面的图案的PDMS层准备夹心模具制造。对于这些实验中，使用了直径从600到1200μm不等的圆形图案。
2. 硅橡胶层，然后转移到一个干净的玻片上。电晕放电单元是用于与氧等离子体处理PDMS和玻璃表面，并放置在相互接触的两个表面。栈是一个烤盘上，然后放置在80 ° C至完成粘接工艺。然后被剥离的透明度和丢弃。在这个过程中，图案的PDMS薄膜是永远不会释放从刚性基板，防止个别层收缩。
3. 根据夹心成型步骤，薄的硅橡胶之间的SU - 8的功能和透明度，没有被挤压出的电影的成功，可能需要被删除。这可以使用立体25G针手工完成。
4. 第二个夹心层成型是形成一个负副本模具所需的隔膜和岗位结构。这是因为制造大面积的SU - 8的主人是具有挑战性的，但使用替代制造工艺可以消除这种额外的步骤。在这个演示中，使用圆形帖子500微米直径。负副本模具硅烷，暂时使用双面胶带贴于载玻片。未固化的PDMS的沉积，脱气，并在1000 rpm到这个45秒的“三明治”模具层旋涂，产生驱动60微米厚的隔膜。旋涂硅橡胶层部分固化在80 ° C的〜20分钟，或直至的PDMS是粘性的，但触摸时不变形，永久。
5. 部分固化的硅橡胶层，然后等离子体处理，倒在放在一个特制的对准的玻片上，双面胶带被删除。对准由一个真空吸盘安装一个显微（锡斯基尤;团Viego，CA，USA）。 PDMS的第一层，然后等离子体处理，并置于一个旋转舞台上（纽马克，资助传球，或美国），下方的真空吸盘，两层之间的对齐方式是使用一个Navitar的12倍变焦的机器视觉系统（NAVITAR观察;罗切斯特，纽约，美国）。
6. 使用机械臂层对齐，然后小心地接触到。三明治，然后从对准中删除，并固化为30分钟，在80 ° C的烤箱中。从设备，然后将去皮的透明度和硅烷副本的PDMS模具丢弃。该设备，然后在80 ° C至少有四个小时完全固化。
7. 根据正在开展的机械性刺激实验的类型，就可以将更多的PDMS层粘合此基础设备通过重复的概述过程。在C和D节提供各类机械性刺激实验的详情

连接器

1. 一旦设备完成后，一针可以用来清除在连接点的PDMS层。
2. Nanoport（厄普丘奇科学;奥克港，WA，USA），如商业连接器，然后可以用于连接外部油管。为了避免商业连接器的高度要求，从而为设备容器使用标准的培养皿中，我们制造我们自己的如下。
3. 大约35克的PDMS演员和治愈以及全方位托盘（NUNC;罗切斯特，纽约，美国）。该设备是去皮，切成小垫片部分，从1 / 8“孔被删除，用一记重拳。
4. 一个18G的钝针是用来核心一段从一侧的垫片。一个较小的21G针是用来清除前撤回18G针的核心。
5. 大约是硅橡胶15克投治愈以及全方位托盘盖，去皮，切成同样大小的部分。本节用透明胶带清洁，等离子保税垫片顶部，和单位等离子体设备，一拳方下来保税。
6. 第二个18G钝针，然后分开的彩色塑料鲁尔接头，插入芯孔和密封到位的PDMS几滴。造成连接器是相当有效的，经济的和死空间体积足够大，以防止气泡在液体灌装阶段进入渠道。

C.机械活性的二维培养基质

阵列驱动microposts可用于创建各种应变型材在暂停的高分子膜，细胞培养。提高到一个润滑膜后会导致滑和变形后各地的电影。 equibiaxial应变分布使用一个循环加载后的结果，但在不同的岗位形状设计是多才多艺的，可用于创建各种应变场。要修改为二维培养实验（原理图如图3）执行机构数组：

1. 债券PDMS的第三层的设备，如在图3a所示。 PDMS的第三层由两层结构。较低的圆匹配下的驱动microposts的驱动腔的大小。上部圆的直径是100微米，比直径装载职位更大。一个200微米宽的微连接这些功能的连接区，将用于润滑加载的职位和文化电影。
2. 制造和债券连接器的设备，如前面所述。
3. 旋涂10-15微米厚层到一个透明光滑的一面（旋转参数：4000 RPM，120秒）的PDMS。在80 ° C，至少4个小时的治疗。
4. Appy一个低级别的真空（Barnant航空青年团抽吸泵）执行器，降低阵列的职位。
5. 等离子体处理和债券的旋涂PDMS薄膜驱动微装置。广场上的电磁炉在80 ° C 10分钟。很短的时间将保持亲水性的职位和文化电影。
6. 与去离子水，溶液中90％的甘油，填充润滑通道。除了润滑，这一提法无限期地保持的PDMS的亲水性，降低摩擦系数。将继续和文化之间的后电影被困的气泡。炉具装置放置于40 ° C，并不断注入润滑剂通道，造成小的压力增加。几分钟后，气泡会漫过的PDMS，和所有表面进行润滑。
7. 删除负面压力，释放出的职位。
8. 使用手术刀，切薄的PDMS薄膜各地。小心剥离的透明度远离设备的支持。
9. 设备周围的文化领域的手工切割硅橡胶垫片等离子债券。
10. 70％的乙醇中浸泡5分钟，然后下杀菌的紫外线灯在45分钟的生物安全柜消毒设备。
11. 等离子体处理表面用100微克/毫升的胶原蛋白（或替代的ECM蛋白）和孵育过夜，4 ° C。
12. 清洗设备，用磷酸盐缓冲液（PBS）和种子细胞在10-15000细胞^/平方厘米以下标准的细胞培养协议。

别处⁷已发表 ​​微装置的运作，并在这个平台上进行的生物实验的细致刻画。

D.机械活性三维凝胶

设备进行修改，也可以用来使photopatterned压缩。细胞载货，立体水凝胶在高通量的方式。在这个例子中，我们创建了直径为350微米的聚乙烯乙二醇（PEG）凝胶气瓶，封装间质干细胞C3H10T1 / 2鼠标，并适用于从5至25％，跨阵列的压缩应变。该协议可以使用更先进的水凝胶聚合化学品。要使用三维mechanobiology（原理图如图4）的实验平台：

设备的修改：

1. 大衣1微米的聚对二甲苯- C的厚厚的一层，以减少透气性，并提高在PEG凝胶体系的聚合时间的职位。这将减少自由基聚合反应的细胞毒作用。透明胶带饮片是用来屏蔽后周围的地区，并涂在PDS 2010年2 LabCoter系统设备（特种涂料系统，印第安纳波利斯，在美国）。
2. 镀膜设备是从涂料体系，透明胶带剥离，留下的聚对二甲苯- C形层以上的职位。
3. 玻璃盖玻片methacrylated浸泡在2％V / V解决方案^{3 8} - （三甲氧基硅基）丙基甲基丙烯酸甲酯在95％乙醇2分钟。
4. 盖玻片是100％的乙醇冲洗，烘烤，在100℃，表面上留下甲基丙烯酸甲酯组。
5. 投一个200微米厚的硅橡胶垫片电影是在培养皿​​中，并切成小部分。这些四个小部分methacrylated盖玻片边缘周围保税血浆。
6. 垫片等离子保税PDMS区的设备，覆盖- C的聚对二甲苯涂层职位。
7. 在70％乙醇洗涤，暴露在45分钟的生物安全柜的杀菌紫外灯灭菌设备。

原位聚合：

载货细胞的PEG凝胶，然后光刻图案到^8,9如下设备：

1. 准备10％W / V PEGDA（3.4kDa，Laysan生物，阿拉伯，AL，美国）和10％W / V聚乙二醇（8kDa，Sigma - Aldrich公司）在unsupplmented细胞培​​养基中的解决方案。
2. 1 - 乙烯基- 2 - pyrolidinone准备的100毫克/毫升Irgacure 2959（汽巴精化;塔里敦，纽约，美国）的光引发剂原液。
3. 彻底混合准备的两个解决方案，获得0.4％W / V的光引发剂的浓度的解决方案。混合物用0.45μm注射器过滤器过滤，消毒和去除颗粒。
4. Trypsinize细胞培养和两倍所需的细胞浓度为终点，准备在文化传媒一个细胞悬液。
5. 以1:1的比例混合细胞悬液和过滤后的水凝胶的易制毒化学/光引发剂溶液。
6. 注入微装置的使用很长的25G针解决方案。小心避免被困在设备中的气泡。
7. 使印刷的透明度屏蔽设备表面上的对准标记。设置一个紫外照明系统，在设备的表面提供了17.5毫瓦^/平方厘米的紫外线剂量。通过195号的面具照亮凝胶此时已为我们的系统进行了优化，并可能需要调整。
8. 远离unpolymerized凝胶前驱体溶液，用PBS清洗，并取代与文化传媒的PBS。驱动加载的职位，以压缩的凝胶结构。

在这个平台上进行的微装置的操作和生物实验的详细特征已出版^在别处10。

E.周边设备

修改培养皿中，用于设备的驱动细胞培养过程中保持无菌。一个迟钝和剥离的18G针epoxied到在培养皿中的侧钻了一个洞。套管（亚当斯Intramedic PE190粘土; VWR International的阿灵顿高地，IL，美国）是按装到这些接口连接到控制电磁阀和压力源。

到设备的压力是由外部的微型泵。对于二维的实验中，从30-55千帕的正压值产生的使用电压控制偏心隔膜泵（SP 500 EC - LC 4.5VDC，施瓦泽精密，德国）。一个基于脉宽调制的电压调节器是用来改变施加电压控制输出压力。电磁阀和阀组（S10MM - 30 - 12 - 3和MSV10 - 1; Pneumadyne，普利茅斯，美国明尼苏达州）用于创建一个循环的压力波形。该阀驱动12 V信号由一个方波函数发生器控制。

F.器件表征和使用

成像设备

一个常见的​​问题是成像设备上的细胞或颗粒光学分辨率差，由于支持加载后的PDMS薄膜下方的水滴凝结。这凝结来自培养箱内的温度和湿度的差异，并固定后，或在显微镜舞台上。要解决这个问题：

1. 连接到开放的压力进气口水库，并用去离子水填充。我们用一个开放的注射器鲁尔锁连接器为方便。
2. 放置在一个真空室的设备和填充水库，并抽空。
3. 等待5分钟，使大气压力室。重复两次或三次。由于空气是流离失所设备的渠道，它是取代水从水库，消除了液滴的凝析油和光学显微镜提供了明确的路径。
4. 使用明场或荧光显微镜的影像文化领域。

活细胞成像，这个过程可以完成播种前对设备的细胞。然而，渠道的设计必须足够大，以防止单位之间在设备上的任何压力的粘性损失。

由珠跟踪应变特性

在二维培养系统：

1. 稀释至所需浓度甲醇的直径为1微米的荧光珠（邦斯实验室;费舍尔，IN）。 1:150稀释液从原来的浓度（珠缓冲液中1％的固体）被发现适合我们的需要。
2. 等离子体处理设备的表面，和存款珠悬浮5-10微升。
3. 等待甲醇蒸发。重复珠浓度太低。
4. 图像处于静止状态的细胞培养领域，并根据负载。
5. 开源自动化粒子跟踪算法，然后可以使用在ImageJ（NIH）的跟踪珠的位移。
6. 位移的大小，方向和位置参数，然后可以使用一个数学模型来描述设备的表面上的应变场。

类似的程序可以遵循的特点在三维系统的菌株。混合成的H荧光珠的数量ydrogel易制毒化学解决方案。在PEG水凝胶系统的情况下，孔径比直径为1微米的珠小。珠子都被封装在水凝胶，并可以使用激光共聚焦显微镜成像系统。珠的位移，然后可以进行跟踪，分析，并安装到变形模型。

G.代表性的结果

代表器件的制备，表征和操作的结果在图5和6。

图1。夹心模具制造过程中。 （一）架空透明度仔细降低到未固化的PDMS的SU - 8的主。 （二）放置在一个泡沫，玻璃和金属的堆栈，夹层，并在炉下压缩治愈。 （三）堆栈是拆卸和透明度剥离，保留图案的PDMS的³层。复制物理研究所的许可。

图2垂直驱动micropost示意图（一）休息和（B）当驱动。 （三）多层制造过程的示意图，需要做出^一个 microposts 3数组。改编物理研究所的许可。

图3。进程修改微驱动器阵列的一个变形的二维^衬底 7培养细胞进行实验。转载由英国皇家化学学会的许可 http://dx.doi.org/10.1039/B914460A 。

图4修改微驱动器阵列，立体photopatterned水凝胶中培养的细胞进行实验^的过程构造10。复制的ELSEVIER许可。

图5（A）为2D mechanostimulatory文化的样本设备。红色染料用于标记的工作压力传递渠道，和蓝色染料，用来标记的润滑通道。 （二）应变特性的实验样品图像。红点代表的珠子未变形的位置，而绿点代表变形的位置。转载由英国皇家化学学会的许可 http://dx.doi.org/10.1039/B914460A 。

图6（A）3D压缩实验样品装置。绿色染料用于标记驱动的压力渠道。 （二）上往下看micropost阵列（三）水凝胶上兴建后上方图案。 （D，E）侧重建水凝胶中的荧光珠的图像构造（四）休息和（E）55千帕的驱动压力下，展示在^一个三维培养系统10的应变表征过程。复制的ELSEVIER许可。

讨论

虽然概念上很简单，设备制造并采取了一定的实验技能和实践。设备中的多层次的对齐，特别是在2D细胞培养的情况下，可以是具有挑战性的的，尤其是在一个大面积的数组。实事求是地讲，我们可以可靠地实现了100％对齐的成功率，使用50微米的公差，在间距之间多层次的相邻功能的设备。我们还成功地展示了低至15微米的公差对齐，但对齐所需时间大大提高，并实现在一个较低的成功率。对准?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 PDMS Monomer and Crosslinker Kit	Dow Corning
SU-8 masters
Silanization agent: (tridecafluoro-1, 1, 2, 2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane	United Chemical Technologies
Foam pads			Craft supply stores, 1-2 mm thick
Overhead inkjet transparencies	Grand Toy
Plexiglass plates
C-clamp			hardware store
Micromanipulator system	Siskiyou, Inc.
Custom-made vaccum mount
Vision system, Navitar 12x zoom	Navitar
Connecting tubes	VWR international	Clay Adam Intramedic PE190
Blunt 18G needles	Small Parts (www.smallparts.com)
Eccentric diaphragm micropump	Schwarzer Precision	SP 500 EC-LC4.5V DC
Solenoid valves	Pneumadyne	S10MM-30-12-3
Solenoid manifold	Pneumadyne	MSV10-1
Function generator
3-(trimethoxysilyl) propyl methacrylate	Sigma-Aldrich
Polyethylene glycol diacrylate 3.4 kDa	Laysan Bio Inc.
Polyethylene glycol 8 kDa	Sigma-Aldrich
Irgacure 2959	Ciba Specialty Chemicals
1-vinyl-2-pyrolidinone	Sigma-Aldrich
Standard cell culture reagents