機械的にダイナミックな細胞培養のための微細加工プラットフォーム

要約

このプロトコルでは、我々は技術がベースとなっている垂直方向に変位の記事のマイクロアクチュエータアレイの製作、そしてどのようにこの基盤技術は2次元と3次元の両方の文化の中でハイスループット機械的にダイナミックな細胞培養を実施するように変更することができますを示していますパラダイム。

要約

組織工学、創薬や基本的な細胞生物学研究のためのmechanobiological刺激の組み合わせにin vitroでの細胞応答における体系的に調査する能力を同時に培養細胞に機械的なさまざまな刺激を適用することはできません現在のバイオリアクター技術によって制限されます。この問題に対処するために、我々はハイスループットフォーマットで機械的刺激の効果をスクリーニングするために設計された微細なプラットフォームのシリーズを開発した。このプロトコルでは、我々は技術がベースとなっている垂直方向に変位の記事のマイクロアクチュエータアレイの作製を実証し、さらにこの基本技術は二次元と三の両方で高スループットの機械的にダイナミックな細胞培養を行うために変更することができる方法を示しています次元培養パラダイム。

プロトコル

A.デバイスの説明と操作

デバイスは、ポリジメチルシロキサン（PDMS）で多層ソフトリソグラフィ^1を使用して作製し、同時に微細アレイ全体の個々の細胞培養の位置に機械的な条件の範囲を生成することができるされています。このプロトコルでは、空気圧で作動micropostsの配列を作製する手順は、最初に両方の2次元（2D）および三次元（3D）文化のパラダイムで機械的にダイナミックな文化を有効にするデバイスを変更する手順に続いて、説明されています。アウトライン微細加工方法により、既存のマクロスケールのシステムのスループットが増加し、最高の様々な力学的条件の影響をスクリーニングに適しています。

デバイスの動作原理は、垂直に作動micropostsの配列に基づいています。 Micropostsは自由に懸濁しダイアフラム上に作製され、発生し、作動ダイアフラム（図1）の下に正と負の圧力を適用することによって低減されています。配列の重要な特徴は、作動ダイアフラムの大きさを変化させることによって、単一の圧力源は、アレイ全体の垂直変位の範囲を取得するために使用できるということです。この原理は、急速に単一のデバイス間の機械的な刺激条件の多数の細胞応答をスクリーニングするために使用されます。

シャファーらによる類似マクロスケールデザイン^。2に基づいて、私たちのデザインは、細胞が発生ローディングポスト上の文化のフィルムのスリップなどの2次元基板の変形を体験できるのポスト秒以上中断し、潤滑細胞培養のフィルムを、含まれています。また、ローディングポスト上のセルを含んだヒドロゲルの光パターニング配列は、3次元培養中の細胞の圧縮を刺激することができます。これらのシステムをセットアップする際の詳細な手順は以下のとおり。

空気マイクロアクチュエータアレイのB.作製

空気マイクロアクチュエータアレイを作製する多層PDMS構造の厳しいアライメントが必要です。これは、挑戦的な収縮によって誘発されるアライメントの登録エラーが原因です。この問題に対処するため、我々は効果的にこの問題^4を除去するために示されて"サンドイッチの金型製作^、3'、と呼ばれる製造プロセスを使用してください。

材料準備

1. さまざまなレベルのそれぞれに対して、単一または複数レベルのSU - 8のマスターは、標準的な手順を使用してクリーンルームで製造されています。これらのデバイスの場合、マスターは、アプリケーションに応じて、200から400μmの厚さです。マスターズは、使用前に三日間80℃でhardbakedされています。
2. きれいなガラスのスライドとSU - 8のマスターは、材料にPDMSを硬化の接着を防ぐために、真空チャンバ内にシラン化されています。 fumehoodでは、シリル化剤60μL（トリデカフルオロ-1,1,2,2 - テトラヒドロ）-1 - トリクロロシラン（米国化学技術、ブリストル、ペンシルバニア州）チャンバー内のシャーレにピペットで入れる。裸ガラスとSU - 8のマスターは、チャンバー内に設置し、一晩真空下で保持されます。
3. 二つのフォームパッド（クラフト用品店で入手可能）とオーバーヘッドインクジェット透明フィルムは、サンドイッチの金型製作のために使用されるSU - 8マスターより少し大きいサイズにカットされています。

サンドイッチモールドの作製

1. 多層デバイスの各レイヤには、このメソッドを使用して成形したPDMS層を必要とします。サンドイッチ型の製造プロセスの概略図を図1に提供されています。
2. PDMSモノマーと架橋剤は、徹底的に標準10:1の比で混合されています。未硬化PDMSの混合液を3 mLのは、以前作製したSU - 8マスター上に堆積し、真空チャンバ内で脱気されています。
3. フォームパッドとSU - 8のマスターはプレキシガラス製のベースプレート上に配置されています。
4. 透明性は、慎重に気泡を引っかけないために確認して、未硬化状態のPDMSに低下する。インクジェットOHPフィルムは、ラフと滑らかな面を持って、そしてそれは滑らかな面の接触未硬化PDMSことが重要です。
5. シラン化ガラススライドは、2個目のパッドとプレキシガラスのトッププレートの下に、透明性の上に配置されます。サンドイッチは、C -クランプを使用して一緒にクランプされます。
6. PDMSのサンドイッチを80℃で少なくとも4時間オーブンで硬化させる。
7. サンドイッチをオーブンから取り出し、クランプを外す前に冷却させる。
8. クランプを除去し、サンドイッチには分解、およびフォームパッドは破棄されますされています。透明性は、慎重にパターニングされたPDMSフィルムを保持し、SU - 8マスターから剥離される。
9. 彼らが使用するための準備が整うまでこれらのパターン化されたPDMS層とその処理の透明層は、粉塵のない環境で保管することができます。私たちは正常に顕著な有害作用と、2ヶ月にPDMS層を使用している。

多層デバイスの構築

tは"マイクロアクチュエータアレイの製作のための>回路図を図2Aに設けられており、アクチュエータの動作は、デバイスを作製するために、図2BおよびCに示されています：

1. 最下層のパターン形成PDMS層がサンドイッチの金型製作することにより調製される。これらの実験では、直径600〜1200μmの範囲の円形のパターンを使用した。
2. PDMS層を、清浄なスライドガラスに転送されます。コロナ放電装置は、酸素プラズマによるPDMSとガラス表面の治療に使用され、2つの面が互いに接触して配置されます。スタックはその後° Cの接合プロセスを完了するために80℃のホットプレート上に配置されます。透明性は、剥離して廃棄することができます。このプロセス中に、パターニングされたPDMS膜は、個々の層の収縮防止、リジット基板から解放されることはありません。
3. サンドイッチ成形工程の成功に応じて、SU - 8の機能と透明性の間から押し出されていないPDMSの薄膜は、削除する必要があります。これは、ステレオスコープの下に25G針を用いて手動で行うことができます。
4. 第二サンドイッチ成形層は、所望のダイヤフラムとポスト構造の負のレプリカの鋳型として形成されている。大面積のSU - 8のマスターの製作が挑戦されているためですが、代替の製造プロセスを使用すると、この余分なステップを排除するかもしれません。このデモンストレーションでは、直径の円形ポストが500μmを使用した。負のレプリカの型はシラン、および一時的に両面テープを使用してスライドガラスに貼付されています。未硬化PDMSは、堆積脱気し、60μm厚作動ダイアフラムをもたらし、1000 RPMで45秒間このサンドイッチ型層上にスピンコーティングされています。スピンコートPDMS層は80で部分的に硬化させる° C〜20分間、またはPDMSが貼り付けられているが触れたとき、永久変形しないまで。
5. スライドガラスと両面テープは、その後、プラズマ処理した反転し、カスタムメイドのアライナーに配置されている部分的に硬化PDMS層、から削除されます。アライナーは、マイクロマニピュレータ（;ミッションViego、CA、米国シスキユー）に取り付けられた真空チャックで構成されています。第一PDMS層は、真空チャックの下に、（ニューマーク、グランツパス、オレゴン、米国）、プラズマ処理や回転ステージ上に配置しており、2つの層の間の位置合わせは、Navitar社12倍のズームマシンビジョンシステム（Navitar社を使用して観察される;ロチェスター、ニューヨーク州、米国）。
6. 層は、マニピュレータを使用して整列し、慎重に接触させています。サンドイッチは、アライナから削除され、さらに30分間80℃のオーブンで硬化させる。透明性とシラン化レプリカPDMSモールドは、そのデバイスから剥離して廃棄することができます。デバイスは、完全に80℃以上で4時間硬化させる。
7. 行われている機械的な刺激実験の種類に応じて、追加のPDMS層はその後、説明した手順を繰り返すことによって、このベースのデバイスに結合することができる。機械的な刺激実験の様々なタイプの詳細は、セクションCおよびDに記載されています

コネクタ

1. デバイスが完了すると、針は接続の時点でPDMS層をクリアするために使用することができます。
2. このようなNanoport（アップチャーチ科学、オークハーバー、ワシントン州、米国）のような市販のコネクタは、外部配管とのインターフェイスに使用することができます。商用のコネクタの高さの要件を避けるために、それによってデバイスのコンテナとして標準のペトリ皿を使用して、我々は次のように私たち自身を作り上げる。
3. PDMSの約35gを無指向性もトレイ（;ロチェスター、NY、米国Nunc社）にキャストし、硬化させる。デバイスは、1 / 8"穴がパンチを使用して除去された、剥離、そして小さなガスケットの部分に切断される。
4. 18G鈍い針は、コアからガスケットの側面からセクションを配置するために使用されます。小さい21Gの針は18G針を撤回する前に中央のコアを削除するために使用されます。
5. PDMSの約15グラムは、同程度のサイズのセクションに皮をむいてカット、無指向性もトレイの蓋にキャストし、硬化させる。このセクションでは、サイドをパンチダウン、ガスケットの上にプラズマ結合、およびユニットがデバイスにプラズマ結合して、スコッチテープで洗浄される。
6. 第二鈍18G針を芯穴に挿入し、着色されたプラスチック製のルアーコネクターから分離し、PDMSの数滴の代わりに封入されている。結果として得られるコネクタは、非常に効果的であり、経済的で、液体充填段階でのチャンネルに入ることから気泡を防止するために十分な大きさのデッドスペースがボリュームを持っています。

C.機械的にアクティブな二次元培養基板

作動micropostsの配列は、細胞が培養されている懸濁ポリマーフィルム、で様々な歪みのプロファイルを作成するために使用することができます。潤滑膜へのポストを上げると、ポストの周りに滑りや変形するためにフィルムを引き起こします。等二軸歪み分布の円形の載荷後の結果を使用するが、デザインは、その別のポストの形で汎用性のある、歪みの様々な分野を作成するために使用することができます。 2次元培養実験（図3の回路図）のためのアクチュエータのアレイを変更するには：

1. 結合デバイスの三番目のPDMS層は、図3aに示します。第三PDMS層は、2層構造で構成されています。下の円が作動micropostsの下に作動キャビティのサイズと一致します。上部の円の直径は、ローディングポストの直径が100μm以上である。 200μmの広いマイクロチャネルは、接続領域にこれらの機能を接続し、ローディングポストと文化のフィルムを潤滑するために使用されます。
2. 前述のように、デバイスに作製し、債券のコネクタ。
3. 透明の滑らかな面上にPDMSのスピンコートは10-15μmの厚い層（スピンパラメータ：4000 RPM、120秒）。少なくとも4時間、80℃で硬化する。
4. 記事の配列を下げるアクチュエータへAppy低レベルの真空（Barnantエアカデット吸引ポンプ）、。
5. プラズマの御馳走と結合作動マイクロデバイスへのスピンコーティングしたPDMSフィルム。 80℃ホットプレートの上に置い℃で10分間。投稿と文化のフィルムは、短い時間のために親水性のままになります。
6. 脱イオン水の溶液中で90％グリセロールを潤滑チャンネルを埋める。潤滑に加えて、この製剤は、摩擦係数を低減する、無期限にPDMSの親水性を維持します。気泡は、ポストと文化のフィルムの間に閉じ込められたままになります。 40℃でホットプレートの上には置かない、と小さな圧力上昇を引き起こし、チャネルに潤滑剤を注入し続ける。数分後、気泡がPDMSを通して拡散し、全表面が潤滑されます。
7. ポストを放出、負圧を削除します。
8. メスを使用して、薄いPDMS膜の周りにカット。慎重に離れてデバイスからバックアップを透明の皮。
9. プラズマ結合デバイスの文化圏の周りハンドカットPDMSガスケット。
10. 5分間、その後45分間生物学的安全キャビネット内の殺菌、UV光下で70％エタノールに浸漬することにより、デバイスを滅菌する。
11. プラズマは、一晩4℃で100μg/ mlのコラーゲン（または別のECM蛋白質）と表面とインキュベート℃を扱う
12. リン酸生理食塩水（PBS）、および標準的な細胞培養のプロトコルに従って10から15000個/ cm ²での種子の細胞を、バッファリングを使用してデバイスを洗ってください。

このプラットフォーム上で実施したマイクロデバイスの操作と生物学的実験の詳細な特性は、他の場所で⁷公開されている。

D.機械的にアクティブな3Dハイドロゲル

デバイスへの変更は、光パターン形成の圧縮を有効にするために使用することができます。ハイスループットな方法でセルを多用した、三次元ヒドロゲル。この例では、我々はC3H10T1 / 2マウス間葉系幹細胞をカプセル化する、350μmの直径のポリエチレングリコール（PEG）ハイドロゲルのシリンダを作成し、アレイ全体の5〜25％の範囲の圧縮ひずみを適用する。このプロトコルは、より高度なハイドロゲルの光重合化学で使用することができます。三次元mechanobiology（図4の回路図）での実験のためのプラットフォームを使用するには：

デバイスの変更：

1. ガス透過性を低減し、PEGハイドロゲルシステムで重合度を向上させるためにパリレン- Cの1μmの厚い層でコートの記事を。これはフリーラジカルベースの​​光重合反応の細胞毒性効果を減少します。スコッチテープの部分は、ポストの周りの領域をマスクするために使用され、デバイスがPDS 2010 LabCoter 2システム（特殊コーティングシステム、アメリカ、インディアナポリス、インディアナ州に、）でコーティングされています。
2. コー​​ティングされたデバイスは、コーティングシステムから削除され、スコッチテープは、ポストにパリレン- Cのコンフォーマル層を残して、剥離された。
3. 2分間95％エタノールで（トリメトキシシリル）プロピルメタクリレート-ガラスのカバースリップは3の2％v / v溶液に浸漬することによって^8をメタクリル化されています。
4. カバーガラスは、100％エタノールで洗浄し、100で焼成° Cを、表面にメタクリレート基を残して。
5. 200μmの厚さのPDMSのスペーサ膜をシャーレにキャストし、小さな断片に切断される。これらの小さなセクションの4つは、メタクリルカバースリップの端の周囲に結合プラズマです。
6. スペーサーは、パリレン- Cコーティングの記事をカバーするデバイスのPDMS -領域、に結合プラズマです。
7. デバイスは、70％エタノールで洗浄し、45分間生物学的安全キャビネット内の殺菌、UV光に曝露することによって滅菌される。

その場重合で ：

細胞を含んだPEGハイドロゲルは、その後、フォトリソグラフィによって、次のようにデバイス^8,9にパターニングされた。

1. および10％w / vのPEG（8kDa、Sigma - Aldrich社）、10％w / vのPEGDA（アラブ、AL、アメリカ合衆国3.4kDa、ライサン島バイオ）を準備unsupplmented細胞培養培地中のソリューション。
2. 1 - ビニル-2 - pyrolidinoneで、イルガキュア2959年の100 mg / mLの（タリータウン、ニューヨーク州、米国チバスペシャルティケミカルズ）の光開始剤のストック溶液を準備します。
3. 徹底的に光開始剤の0.4％w / vの濃度で溶液を得るために2つの準備のソリューションを混ぜる。滅菌及び微粒子を除去するために0.45μmのシリンジフィルターを通して混合物をフィルタリングします。
4. 培養細胞をトリプシン処理し、二度、目的のエンドポイントの細胞の濃度で、培養培地中の細胞懸濁液を準備する。
5. 1:1の比率で細胞懸濁液とフィルタリングヒドロゲル前駆体/光開始剤溶液を混合。
6. 長い25G針を用いてマイクロデバイスにソリューションを注入する。装置内の気泡をトラップし、慎重に避けてください。
7. デバイスの表面上のアライメントマークに印刷された透明度のマスクを合わせます。デバイスの表面で17.5 MW / cm ²のUV用量を提供するために、UV照射システムを設定します。 195秒のためのマスクを介してハイドロゲルを照らすこの時間は私たちのシステム用に最適化されており、調整する必要があります。
8. PBSで離れて未重合ヒドロゲル前駆体溶液を洗浄し、培地をPBSに交換してください。ハイドロゲル構造を圧縮するためのロードポストを作動させる。

このプラットフォーム上で実施したマイクロデバイスの操作と生物学的実験の詳細な特性は、他の場所で¹⁰公開されている。

E.周辺機器

修正されたペトリ皿は、機器の作動中に、細胞培養の無菌性を維持するために使用されています。鈍化とストリップ18G針をシャーレの側面に開けた穴にepoxiedれる。チューブは（クレイアダムスIntramedic PE190、VWRインターナショナル、アーリントンハイツ、イリノイ州、米国）、これらのコネクタに圧入され、制御されたソレノイドバルブと圧力源に接続します。

デバイスへの圧力は、外部のマイクロポンプによって提供されます。 2Dの実験のために、30から55 kPaから正圧の値は、電圧制御偏心ダイヤフラムポンプ（;シュワルツ精密、ドイツSP 500 EC - LC 4.5VDC）を使用して生成されました。パルス幅変調による電圧制御は、圧力の出力を制御するための印加電圧を変化させるために使用されます。電磁弁とマニホールド（S10MM - 30 - 12 - 3とMSV10 - 1; Pneumadyne、プリマス、ミネソタ州、米国）が周期的圧力波形を作成するために使用されています。バルブは、方形波の関数発生器によって制御される12 Vの信号で作動される。

F.デバイスの特性評価と利用

デバイスのイメージング

デバイス上でのイメージングで細胞または粒子に共通の問題がローディングポストをサポートしているPDMS膜の下に滴の凝縮に起因する不良光学解像度です。この結露は、インキュベーター内の温度と湿度の違いからと固定後、または顕微鏡のステージ上で発生する。この問題を解決するには：

1. 圧力導入口にオープンリザーバーを接続し、脱イオン水で塗りつぶす。私たちは、利便性のためのルアーロックコネクタを開いて注射器を使用してください。
2. 真空チャンバ内のデバイスと満たされたタンクを置き、真空排気。
3. 5分待ってから、大気圧にチャンバーをもたらす。 2〜3回を繰り返します。空気が装置のチャネルからずれているとして、それが液滴の凝縮物を排除し、顕微鏡のための明確な光路を提供し、貯水池からの水に置き換えられます。
4. 明視野または蛍光顕微鏡を用いて映像文化エリア。

ライブセルイメージングのため、この手順は、デバイス上で細胞を播種する前に行うことができます。しかし、チャネルは、デバイス上のユニット間で圧力のいずれかの粘性損失を防ぐために十分な大きさに設計されている必要があります。

ビーズトラッキングによる特性評価をひずみ

二次元培養システムの場合：

1. 所望の濃度のメタノールで、径1μmの蛍光ビーズを（フィッシャー、IN前髪ラボラトリーズ）希釈する。オリジナルの濃度（ビーズ緩衝液で1％固体）から1:150の希釈は我々のニーズに適していることがわかった。
2. プラズマは、デバイスの表面を扱い、ビーズ懸濁液5〜10μLを預ける。
3. 蒸発させるためにメタノールを待ちます。ビーズ濃度が低すぎると繰り返します。
4. 安静時、および負荷の下に画像細胞培養の分野を。
5. オープンソースの自動化された粒子追跡アルゴリズムは、ビーズの変位を追跡するためのImageJ（NIH）で使用することができます。
6. 変位の大きさ、方向、位置パラメータは、デバイスの表面にひずみ場を特徴づけるために数学的モデルで使用することができます。

同様の手順では、3Dシステムで菌株を特徴づけるために追跡することができる。 Hに蛍光ビーズの量を混ぜるydrogelの前駆体溶液。 PEGハイドロゲルシステムの場合には、細孔サイズが1μmの直径のビーズのものよりはるかに小さいです。ビーズは、ハイドロゲルでカプセル化され、システムは共焦点顕微鏡を用いて画像化することができます。ビーズの変位は、その後、追跡分析し、変形モデルに取り付けることができます。

G.描写結果

デバイス作製、特性評価および操作のための代表的な結果は、図5と図6で提供されています。

図1。サンドイッチモールドの製造プロセス。 （A）オーバーヘッドの透明性は、慎重にSU - 8マスターに未硬化状態のPDMSに低下する。 （B）サンドイッチは、泡、ガラスと金属のスタックに配置され、圧縮下のオーブンで硬化させる。 （C）スタックが分解し、透明性は、パターニングされたPDMS層^3を保持し、剥離される。物理学研究所の許可を得て再現。

図2（A）の残りと（B）時作動で垂直に作動マイクロポストの回路図。 （C）多層製造プロセスの概略図はmicroposts ³の配列を作成するのに必須。物理学研究所の許可を得て適応。

図3：変形二次元の基板⁷上で培養した細胞について実験を実施するマイクロアクチュエータアレイを変更する処理。王立化学協会の許可を得て複製http://dx.doi.org/10.1039/B914460A 。

図4。三次元光パターン形成ハイドロゲルで培養した細胞のための実験を実施するマイクロアクチュエータアレイを変更するプロセスは^、10を構築。エルゼビアの許可を得て再現。

図5。2D mechanostimulatory培養のための（）サンプルのデバイス。赤い染料は、作動圧力の配信チャネル、および潤滑のチャネルをマークするために使用される青色色素をマークするために使用。 （B）の歪み特性の実験のサンプル画像を。緑色の斑点が変形位置^7を表しながら、赤い斑点は、ビーズの変形していない場所を表します。王立化学協会の許可を得て複製http://dx.doi.org/10.1039/B914460A 。

図6。3D圧縮実験のための（A）サンプルデバイス。緑色の染料は、作動圧力のチャネルをマークするために使用。 （C）ハイドロゲルは、ポストの上にパターン化された構築とマイクロポスト配列の（B）トップダウンビュー。 （D、E）サイド再建されたハイドロゲルの蛍光ビーズの画像は、3次元培養系¹⁰にひずみ特性評価のプロセスを示す、（D）残りと（E）55 kPaの作動圧力の下で構築する。エルゼビアの許可を得て再現。

ディスカッション

概念的には単純ですが、デバイス製造ではない、いくつかの実験的な技能と練習が必要。特に2次元細胞培養の場合には、デバイス内の複数の層のアライメントは、特に大面積配列を介して、挑戦することができます。事実上、我々は確実に複数の層で隣接するフィーチャ間の間隔の許容範囲の50μmのデバイスを使用して100％のアライメントの成功率を達成することができます。我々はまた、?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 PDMS Monomer and Crosslinker Kit	Dow Corning
SU-8 masters
Silanization agent: (tridecafluoro-1, 1, 2, 2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane	United Chemical Technologies
Foam pads			Craft supply stores, 1-2 mm thick
Overhead inkjet transparencies	Grand Toy
Plexiglass plates
C-clamp			hardware store
Micromanipulator system	Siskiyou, Inc.
Custom-made vaccum mount
Vision system, Navitar 12x zoom	Navitar
Connecting tubes	VWR international	Clay Adam Intramedic PE190
Blunt 18G needles	Small Parts (www.smallparts.com)
Eccentric diaphragm micropump	Schwarzer Precision	SP 500 EC-LC4.5V DC
Solenoid valves	Pneumadyne	S10MM-30-12-3
Solenoid manifold	Pneumadyne	MSV10-1
Function generator
3-(trimethoxysilyl) propyl methacrylate	Sigma-Aldrich
Polyethylene glycol diacrylate 3.4 kDa	Laysan Bio Inc.
Polyethylene glycol 8 kDa	Sigma-Aldrich
Irgacure 2959	Ciba Specialty Chemicals
1-vinyl-2-pyrolidinone	Sigma-Aldrich
Standard cell culture reagents